一种融合的TaqDNA聚合酶及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种融合的taqdna聚合酶及其应用。

背景技术：

pcr是分子生物学领域最基本但是最重要的方法，它可以将微量的核酸复制扩大，实现生物学上的研究，大大促进了分子生物学和相关学科的发展。pcr的主要成分包括：反应buffer、酶、dntp、模板、引物。这些组分中，每个组分都是pcr扩增不可缺少的，但dna聚合酶是实现dna复制的关键，目前针对这些不同的组分，研究者关注最多的是酶的研究，期望通过对酶的改造，实现更多应用，比如：血液直扩、土壤直扩、植物直扩等。

taqdna聚合酶存在于水生嗜热菌(thermusaquaticus)的嗜热dna聚合酶，可在74℃复制dna，在95℃仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以dna为模板，延伸引物，合成双链dna。其在结构上由三部分构成：dna聚合酶区、3’核酸外切酶区和5’核酸外切酶区，只有5’→3’dna聚合酶活性和5’→3’的外切酶活性，缺少3’→5’的外切酶活性。taqdna聚合酶是重要的生物技术工具酶，广泛应用于疾病诊断与治疗、传染病检测、药物作用机理等医药领域。

随着医药科技的发展，对taq酶性能的要求不断提高，野生型的taqdna聚合酶已经不能满足特殊pcr技术的要求了，例如用于定点突变时要求聚合酶有较高的保真性，用于长片段扩增时要求聚合酶有较高的扩增效率。由此而带来了多种酶的改造方法，比如：通过制备酶单分子纳米凝胶提高酶的稳定性(化学修饰)；定点突变置换氨基酸，如3’端核酸外切酶区的氨基酸变化使其失去5’→3’的外切功能(分子修饰)等等。目前常用的改造方法有定点突变、定点缺失、基因融合等。

当前对taqdna聚合酶改造用的最多的是聚合酶联合应用、定点突变、缺失突变等，通过定向改变氨基酸种类，达到增强某种性能的目的。例如：taqdna聚合酶缺乏校正功能，所以将taqdna聚合酶和pfudna聚合酶联合应用，利用taqdna聚合酶较强的延伸能力和pfudna聚合酶的校正功能，使得扩增可以达到40kb。例如：将taqdna聚合酶543位的丝氨酸定点突变为天冬酰胺，可以增强taqdna聚合酶和模板引物复合物的相互作用，提高了对高gc含量等困难模板的扩增能力。

很多报道通过酶改造增强了taqdna聚合酶的扩增效率、扩增特异性等，但是很少有报道提高了taqdna聚合酶在不经过纯化的dna，实现直接用血液进行扩增。当下用于医院或者工业用户的扩增都是样本数量庞大，如果要先进行dna提取纯化，再进行扩增，一方面需耗费很长的时间，另一方面dna交叉污染可能出现很多假阳性，不利于结果的判定。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的问题，本发明目的提供的一种融合的taqdna聚合酶，增强了扩增过程中与模板链的亲和能力从而提高扩增效率，实现困难模板的扩增，且酶活性稳定，可以直接用血液当模板进行扩增。

为实现上述目的，本发明提供一种融合的taqdna聚合酶，其为dna单链结合蛋白sac7d或dna单链结合蛋白sso7d分别与野生型taqdna聚合酶融合而成。

本发明所述的野生型taqdna聚合酶的编码序列优选如seqidno.3所示。

本发明所提供的融合的taqdna聚合酶，编码基因序列如seqidno.1或seqidno.2所示的核苷酸序列。

所述的核苷酸序列还可以为seqidno.1或seqidno.2所示的核苷酸序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列。

本发明还提供一种载体，所述载体包含可编码上述融合的taqdna聚合酶的核苷酸序列。

具体的，上述载体可以包含seqidno.1或seqidno.2所示的核苷酸序列。

该载体可以进一步由可编码上述融合的taqdna聚合酶的核苷酸序列与表达载体经重组得到。所述表达载体为含有转录和翻译插入的编码序列所需的元件的空载体。

所述表达载体可以为本领域常用载体，如可以为pet-28a。

具体的，上述载体可以由seqidno.1或seqidno.2所示的核苷酸序列插入pet-28a等表达载体经重组得到。

本发明还提供一种重组细胞，该重组细胞可以包含编码上述融合的taqdna聚合酶的核苷酸序列。

具体的，该重组细胞包含seqidno.1或seqidno.2所示的核苷酸序列。

该重组细胞还可包含载体，所述载体包含可编码上述taqdna聚合酶的核苷酸序列。

进一步的，该重组细胞还可包含载体，所述载体包含seqidno.1或seqidno.2所示的核苷酸序列。

重组细胞可包含载体，所述载体可以由编码上述融合的taqdna聚合酶的核苷酸序列与表达载体经重组得到。

进一步的，该重组细胞还可包含载体，所述载体由seqidno.1或seqidno.2所示的核苷酸序列与表达载体经重组得到。

所述表达载体可以为本领域常用载体，如可以为pet-28a。

所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌等。

本申请还提供上述融合的taqdna聚合酶的制备方法，构建含有可编码上述融合的taqdna聚合酶的核苷酸序列的载体，转化至宿主细胞获得重组细胞，表达融合的taqdna聚合酶。

本方法还提供一种taqdna聚合酶试剂，所述试剂中含有上述融合的taqdna聚合酶。

本发明还提供上述融合的taqdna聚合酶在pcr中的应用。

本发明所述的应用，可以直接用血液作为模板进行扩增。

本发明所述的应用，用血液扩增时，血液在pcr反应体系中的占比(体积)不高于20％，优选的不高于15％。

本申请的有益效果：

本申请所述的融合的taqdna聚合酶增强了扩增过程中与模板链的亲和能力从而提高扩增效率，实现困难模板的扩增，且酶活性稳定，可以直接用血液当模板进行扩增。

附图说明

图1是实施例2所述的4种酶扩增电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1制备融合的taqdna聚合酶

我们获得了表达dna单链结合蛋白的3个基因：hmf、sac7d、sso7d，其序列可通过现有公开途径查询获得，或者分别为seqidno.4、seqidno.1和seqidno.2的序列中出去野生型taqdna聚合酶即除去seqidno.3的序列后剩余的序列。通过前期扩增、胶回收、测序得到hmf、sac7d、sso7d的核酸序列，用clonexpressultraonestepcloningkit(南京诺唯赞生物科技有限公司)将hmf、sac7d、sso7d分别与taq首尾相连在pet28a载体，得到重组基因，转化到大肠杆菌中，37℃摇菌1小时(转速200-250rpm)，5000rpm离心5min，弃900μl上清，剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在kan平板上涂布。37℃培养箱中倒置培养12-16h。通过pcr鉴定阳性菌落，将阳性菌落送测序，确认基因序列正确。将正确的大肠杆菌iptg诱导表达蛋白，用本行业通俗的方法纯化蛋白，得到融合的3种taqdna聚合酶，分别命名为hmf-taq(编码序列如seqidno.4所示)、sac7d-taq(编码序列如seqidno.1所示)、sso7d-taq(编码序列如seqidno.2所示)。

同源重组所用的引物序列

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sso7d-taq-2-r：tgatgatgatggctgctgcctcactccttggcggagagc

实施例2检测得到的改进的taqdna聚合酶直接用于血液扩增的效果

测试改造后的hmf-taq、sac7d-taq、sso7d-taq和野生型taq(序列如seqidno.3所示)在血液直扩时的效果。

测试用到的反应buffer配方：30mmtris，ph8.3，mg2.5mm，kcl10mm，海藻糖0.5m，反应酶浓度2u/μl。

血液模板浓度为反应体系的15％。反应程序：95℃30sec，95℃5min，58℃30sec，72℃30sec(35cycles)，72℃5min。

扩增所用的引物序列：

r：ctgcccgtagtagtcgtaatcgtcctccat

f：aactgctgcttggctacagcgacatcga

pcr产物在1％的琼脂糖胶进行电泳，得到如图1结果，显示通过基因融合得到的sac7d-taq、sso7d-taq可以在含有15％血液的体系中良好扩增，而对比例hmf-taq和野生型taq则扩增效果较弱。

实施例3检测hmf-taq、sac7d-taq、sso7d-taq和野生型taq在不同浓度血液存在下的酶活

将实施例1制备的3种酶和野生型taq组成的4种酶(hmf-taq、sac7d-taq、sso7d-taq和野生型taq)分别与活化的小牛胸腺dna和p³²标记的datp一起温育，在不同体积浓度血液抑制的情况下，70℃下保持10分钟，通过检测核苷酸渗入dna的速度检测酶的活性，在酶标仪上检测，得到结果如表1所示，显示通过基因融合得到的sac7d–taq、sso7d-taq在不同血液存在的情况下，酶活性稳定，15％血液依然能维持90％以上的活性，而野生型和hmf-taq活性分别下降至11％、30％。

表1：4种酶在血液抑制下检测酶活结果(酶活，单位：％)

序列表

<110>南京市胸科医院

<120>一种融合的taqdna聚合酶及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2697

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<400>2

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