一种转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，转基因大豆及其衍生品种为转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127及其衍生品种，其Arm-PCR检测引物组包括内参Lectin引物组、特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs，特异性的套式PCR引物用于Arm-PCR的第一步扩增，超级上游引物Fs和超级下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步扩增，检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照，采用六对套式引物和一对超级引物，在DNA聚合酶的作用下，对DNA模板进行扩增，用毛细管电泳检测扩增结果。本发明具有低成本、快速、高通量和阳性检出率高等优势，并具有兼容性、特异性、敏感性、半定量性、灵活性、重复性和高效性。
【专利说明】—种转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及生物学【技术领域】，具体是一种转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法。
【背景技术】
[0003]20世纪80年代，除草剂生产公司从矮牵牛中克隆获得抗性基因一EPSPS基因，即农杆菌的5-烯酮丙酮酸莽草酸-3-磷酸酶基因。应用Ti质粒介导转移DNA技术，将矮牵牛Ti质粒中35S启动子控制的EPSPS基因导入大豆基因组中，进而育成抗除草剂草甘膦的转基因大豆品种，简称RR大豆。这种转基因大豆于1994年获得美国FDA批准，并较早地成为进行商业化大规模推广生产的转基因作物之一。RR大豆对非选择性除草剂——农达有高度耐性，即使在大田中施用草甘膦除草剂，也不影响大豆产量，适于大面积机械种植。据农业生物技术应用国际服务机构资料显示，2001年世界种植大豆总面积7200万公顷，而转基因大豆有3330万公顷占据全球转基因作物的63%，且均为抗除草剂大豆。当然除此之外，还有一些改良性状的新品种大豆也相继问世，如杜邦公司培育出的油酸含量达70%以上的大豆；此外，在美国低亚麻酸大豆、低棕桐酸大豆、高硬脂酸大豆、高棕搁酸大豆等转基因品种也已培育成功。利用基因工程方法所培养出的高油酸含量，同时降低了多不饱和脂肪酸含量，而且不存在反式脂肪酸，因此是一种理想的植物油。营养学家则称21世纪是“大豆世纪”。由此可见，转基因大豆在转基因作物及未来食品中占有重要地位。
[0004]为了能够对转基因作物及其产品做出综合评价，除了需要各国政府和国际机构制定科学的安全评价体系以及严格的管理法规外，建立有效的方法体系对转基因作物进行检测也很重要，这是对转基因作物进行安全性评价和实施监管的基础，也是农产品国际贸易健康发展的重要保障。转基因产品的检测要求方法要快速，准确，灵敏，并且还得考虑适应大样品量，目标基因种类多等特点。目前国际上转基因作物及其产品的检测方法主要分为两种:酶联免疫法和聚合酶链式反应法，而基于分子生物学原理的PCR技术是近年来检测转基因生物体的常用方法，包括定性PCR方法、符合PCR方法、巢式PCR方法、竞争性定量PCR方法和荧光定量PCR方法等。但是上述的PCR方法往往检测效率低、耗费时间长，而常规的多重PCR技术涉及多个靶标和引物对，随着反应体系内引物数量的增加，错误引发扩增和引物相互干扰的几率大大增加，从而导致靶点扩增不兼容、扩增背景过高、可重复性差等问题，限制了该技术在多靶标的同步检测中的实际应用范围。
[0005]扩增子拯救多重PCR技术，以下简称Arm-PCR技术，其原理是针对多重PCR体系中的每个靶序列，分别设计两对套式引物，使其可以形成4种扩增引物组合；由于每个靶序列都有4种可能的扩增模式。从而使得寻找不同靶序列最佳通用的扩增条件变得简单可行，最终实现对多种靶基因的高特异性、高灵敏度的同步扩增。目前尚未有将Arm-PCR法应用于快速检测转基因大豆及其衍生品种的试剂盒。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种兼容性高、敏感性强的转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0007]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
一种转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，所述转基因大豆及其衍生品种为转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127及其衍生品种，所述转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127及其衍生品种的Arm-PCR检测引物组包括内参Lectin引物组、特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs，所述特异性的套式PCR引物包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向内引物F1、反向内引物Ri，所述特异性的套式PCR引物用于Arm-PCR的第一步扩增，所述超级上游引物Fs和超级下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步扩增；所述内参Lectin引物组、特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs的核苷酸序列分别如下所示:
GTS40-3-2 正向外引物 Fo:CTTCCCGTTACCTTGCGCGG ；
GTS40-3-2 反向外引物 Ro:CGGTGAGCTTGCCGCGGCCT ；
GTS40-3-2正向内引物F1:
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGTCCGCCGTGCTGCTCGCCG ；
GTS40-3-2反向内引物R1:
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTCAGGCGGATGGTGCGCACGC ；
Mon89788 正向外引物 Fo:GAGACTGATGCTGACGGTGT ；
Mon89788 反向外引物 Ro:CACTTCGATGTCGGCACCCA ；
Mon89788正向内引物F1:
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTGCTTTCCCATTGGTTGCT ；
Mon89788反向内引物R1:
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTATGAGACCAGTACGGGTTGG ；
A5547-127 正向外引物 Fo:GGACAGGGTACCCGGGGATC ；
A5547-127 反向外引物 Ro:TAGCCTTCCAGGGCCCAGCG ；
A5547-127正向内引物Fi:
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGCTGATATGGCCGCGGTTTG ；
A5547-127反向内引物Ri:
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGTGGTGTTTGTGGCTCTGTC ；
Lectin 正向外引物 Fo:CCAAGTCATCGACGTGCCGG ；
Lectin 反向外引物 Ro:GCCACGTCTTCGCCGCCGGC ；
Lectin正向内引物Fi:
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGCCTTCCCGCTGGTTGCGGC ；
Lectin反向内引物Ri:
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGATGACTTCGATGTCGGCGC ；
超级上游引物 Fs:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC ；
超级下游引物 Rs:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT ?
[0008]作为本发明进一步的方案:所述Arm-PCR检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照物，所述引物液包含特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs，其中正向外引物Fo的浓度为1-3 μ M，反向外引物Ro的浓度为1-3 μ Μ，正向内引物Fi的浓度为1-3 μ Μ，反向内引物Ri的浓度为1-3 μ Μ，超级上游引物Fs的浓度为8_12μΜ，超级下游引物Rs的浓度为8-12 μ M ;所述反应液中包含Arm-PCR反应缓冲液、浓度为6mM的MgCl2和浓度为1mM的dNTP ;所述DNA聚合酶的浓度为7-9U/ μ I ;所述对照物中阳性对照为大豆标准内参Lectin引物组，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
[0009]作为本发明进一步的方案:所述引物液中正向外引物Fo的浓度为2 μ Μ，反向外引物Ro的浓度为2μΜ，正向内引物Fi的浓度为2μΜ，反向内引物Ri的浓度为2μΜ，超级上游引物Fs的浓度为10 μ Μ，超级下游引物Rs的浓度为10 μ Mo
[0010]作为本发明进一步的方案:所述所述DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，DNA聚合酶的浓度为8U/μ I。
[0011]作为本发明进一步的方案:所述的转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，具体步骤如下:
Cl)待检样品DNA的提取:采用植物DNA提取试剂盒提取转基因大豆GTS40-3-2、Μοη89788、Α5547-127 的纯化样品 DNA ；
(2)设置对照反应:设置阳性对照反应时，用大豆标准内参Lectin引物组代替待检DNA,设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ；
(3)Arm-PCR扩增反应:
1)第一步扩增:配置反应体系:向200μI的PCR管中加入引物液2.5μ 1、反应液混合物12.5 μ I和待检DNA2-5 μ 1，并用灭菌去离子水将PCR管中溶液补齐到25 μ I ;将配制好的PCR管混匀后离心，于95°C下反应15min，94°C下反应30s，60°C下反应90s，72°C下反应60s，循环反应15次；再于94°C下反应15s，70°C下反应90s，循环反应6次；再在60°C下延伸反应30min,最后在4 C环境下保存；
2)第二步扩增:配置反应体系:向200μ I的PCR管中加入引物液I μ 1、反应液混合物12.5 μ I和第一步扩增得到的PCR反应产物1-2 μ 1，并用灭菌去离子水将PCR管中溶液补齐到25 μ I ;将配制好的PCR管混匀后离心，于95°C下反应15min ;94°C下反应30s，60°C下反应90s，72°C下反应60s，循环反应30次后在60°C下延伸反应30min，最后在4°C环境下保存；
(4)结果判断:通过毛细管电泳检测Arm-PCR扩增结果。
[0012]作为本发明再进一步的方案:所述步骤(I)中植物DNA提取试剂盒提取转基因大豆 GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127 的 DNA 的方法为:
A、取95-105mg的转基因大豆GTS40-3_2、Mon89788和A5547-127，放入研钵中，加入液氮迅速磨碎，液氮反复加入3-4次，直至将转基因大豆磨成粉末为止；
B、加入400μ I缓冲液FPl和6 μ I浓度为10mg/m的RNaseAl，旋涡振荡Imin,室温放置 1min ；
C、加入130μ I缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡Imin ；
D、在转速12000rpm下离心5min，将上清转移至新的离心管中；
E、向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，出现絮状基因组DNA，在转速12000rpm下离心2min,弃上清,保留沉淀；
F、向沉淀中加入600μ 1/70%的乙醇,润旋振荡5s,在转速12000rpm下离心2min,弃上清；
G、重复步骤F;
H、开盖倒置，室温放置5-10min，彻底晾干残余的乙醇；
1、加入适量洗脱缓冲液TE，65°C下水浴1min溶解DNA，其间颠倒混匀数次助溶，最终得到DNA溶液。
[0013]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
本发明具有低成本、快速、高通量和阳性检出率高等优势，具有兼容性、特异性、敏感性、半定量性、灵活性、重复性和高效性:
(O兼容性:在Arm-PCR反应中，每个待检靶序列有2对巢式引物，形成4种扩增引物组合。每种组合可能各自有其最佳扩增条件，但由于各个靶序列都有4种可能的扩增模式，很可能寻找到针对不同靶序列的最佳通用条件；
(2)特异性:因为靶序列特异性巢式引物的浓度极低，即使在多对巢式引物同时存在的条件下，也能和其互补靶序列特异性结合，保证了扩增的特异性；
(3)敏感性:基因特异性引物的量极低，不容易形成引物二聚体，仅用于富集靶序列和向初始PCR加上超级引物标签序列。在富集靶序列和添加超级引物标签后，仅用一对引物进行扩增，而且仅有一个引物标记，都降低了反应的背景噪音；
(4)半定量:Arm-PCR反应中仅使用超级引物作为能进行几何级数扩增的引物，因而，共扩增的靶序列具有相同的扩增效率，扩增终点的产物量能够在一定程度上反应模板的起始拷贝量；
(5)灵活性:可根据待检测的序列的不同，设计不同的巢式引物组合，以针对不同类群的靶序列组合。可以对现有组合进行删减或添加巢式引物，制备新的组合；此外，可以在原靶序列组合中添加新的扩增目标，而不会降低原有靶序列检测的敏感性；
(6)重复性:不需要PCR后的清洗程序，简化了操作流程，同时只有一个通用引物被标记也加强了产品的稳定性和可重复性；
(7)高效性:能在一次反应、一个反应管内对多达20种靶序列同时扩增并标记。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明实施例1的单个品系琼脂糖凝胶电泳检测结果示意图。
[0015]图2为本发明实施例1中部分引物组进行的Arm-PCR毛细管电泳检测结果示意图。
[0016]图3为本发明实施例1不含转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127成分的毛细管电泳检测结果示意图。
[0017]图4为本发明实施例2的毛细管电泳检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0018]下面结合【具体实施方式】对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
[0019]实施例1 请参阅图1-3，本发明实施例中，一种转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，所述Arm-PCR检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照物，所述引物液包含特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs，其中正向外引物Fo的浓度为2 μ M，反向外引物Ro的浓度为2 μ Μ，正向内引物Fi的浓度为2 μ Μ，反向内引物Ri的浓度为2 μ Μ，超级上游引物Fs的浓度为10 μ Μ，超级下游引物Rs的浓度为10 μ M ;所述反应液中包含Arm-PCR反应缓冲液、浓度为6mM的MgCl2和浓度为1mM的dNTP ;所述DNA聚合酶的浓度为SU/μ I ;所述对照物中阳性对照为大豆标准内参Lectin引物组，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
[0020]所述内参Lectin引物组、特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs的核苷酸序列分别如下所示:
GTS40-3-2 正向外引物 Fo: CTTCCCGTTACCTTGCGCGG ；
GTS40-3-2 反向外引物 Ro: CGGTGAGCTTGCCGCGGCCT ；
GTS40-3-2正向内引物F1:
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGTCCGCCGTGCTGCTCGCCG ；
GTS40-3-2反向内引物R1:
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTCAGGCGGATGGTGCGCACGC ；
Mon89788 正向外引物 Fo:GAGACTGATGCTGACGGTGT ；
Mon89788 反向外引物 Ro:CACTTCGATGTCGGCACCCA ；
Mon89788正向内引物F1:
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTGCTTTCCCATTGGTTGCT ；
Mon89788反向内引物R1:
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTATGAGACCAGTACGGGTTGG ；
A5547-127 正向外引物 Fo:GGACAGGGTACCCGGGGATC ；
A5547-127 反向外引物 Ro:TAGCCTTCCAGGGCCCAGCG ；
A5547-127正向内引物Fi:
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGCTGATATGGCCGCGGTTTG ；
A5547-127反向内引物Ri:
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGTGGTGTTTGTGGCTCTGTC ；
Lectin 正向外引物 Fo:CCAAGTCATCGACGTGCCGG ；
Lectin 反向外引物 Ro:GCCACGTCTTCGCCGCCGGC ；
Lectin正向内引物Fi:
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGCCTTCCCGCTGGTTGCGGC ；
Lectin反向内引物Ri:
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGATGACTTCGATGTCGGCGC ；
超级上游引物 Fs:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC ；
超级下游引物 Rs:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT。
[0021 ] 作为本发明进一步的方案:所述弓丨物液中正向外引物Fo的浓度为2 μ M，反向外引物Ro的浓度为2μΜ，正向内引物Fi的浓度为2μΜ，反向内引物Ri的浓度为2μΜ，超级上游引物Fs的浓度为10 μ Μ，超级下游引物Rs的浓度为10 μ Mo
[0022]所述的转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，具体步骤如下:
Cl)待检样品DNA的提取:采用植物DNA提取试剂盒提取转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127 的纯化样品 DNA:
A、取10mg的转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788和A5547-127，放入研钵中，加入液氮迅速磨碎，液氮反复加入3次，直至将转基因大豆磨成粉末为止；
B、加入400μ I缓冲液FPl和6 μ I浓度为10mg/m的RNaseAl，旋涡振荡Imin,室温放置 1min ；
C、加入130μ I缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡Imin ；
D、在转速12000rpm下离心5min，将上清转移至新的离心管中；
E、向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，出现絮状基因组DNA，在转速12000rpm下离心2min,弃上清,保留沉淀；
F、向沉淀中加入600μ 1/70%的乙醇,润旋振荡5s,在转速12000rpm下离心2min,弃上清；
G、重复步骤F;
H、开盖倒置，室温放置8min，彻底晾干残余的乙醇；
1、加入适量洗脱缓冲液TE，65°C下水浴1min溶解DNA，其间颠倒混匀数次助溶，最终得到DNA溶液。
[0023](2)设置对照反应:设置阳性对照反应时，用大豆标准内参Lectin引物组代替待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ；
(3)Arm-PCR扩增反应:
O第一步扩增:配置反应体系:向200μ I的PCR管中加入引物液2.5 μ 1、反应液混合物12.5 μ I和待检DNA2 μ 1，并用灭菌去离子水将PCR管中溶液补齐到25 μ I ;将配制好的PCR管混匀后离心，于95°C下反应15min，94°C下反应30s，60°C下反应90s，72°C下反应60s，循环反应15次；再于94°C下反应15s，70°C下反应90s，循环反应6次；再在60°C下延伸反应30min,最后在4 C环境下保存；
2)第二步扩增:配置反应体系:向200 μ I的PCR管中加入引物液I μ 1、反应液混合物
12.5 μ I和第一步扩增得到的PCR反应产物I μ 1，并用灭菌去离子水将PCR管中溶液补齐到25 μ I ;将配制好的PCR管混匀后离心，于95°C下反应15min ;94°C下反应30s，60°C下反应90s，72°C下反应60s，循环反应30次后在60°C下延伸反应30min，最后在4°C环境下保存；
(4)结果判断:通过毛细管电泳检测Arm-PCR扩增结果。
[0024]请参阅图1，本实施例中各个品系以及阳性对照分别设计2组引物进行扩增并用琼脂糖凝胶电泳进行检测:1和2为阳性对照Lectin两组引物在3个品系中的扩增；3和4为GST40-3-2两组引物在该品系中的扩增；5和6为M0N89788两组引物在该品系中的扩增；7和8为A5547-127两组引物在该品系中的扩增。
[0025]请参阅图2，根据图1的结果挑选较好的引物组进行Arm-PCR毛细管电泳检测结果显示为阴性对照无条带，阳性对照Lectin的条带为173bp，待检样品的PCR产物大小为198bp、134bp和129bp，表明待检大豆种子样品中含有或全部为转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127 及其衍生品种，含有转基因大豆 GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127 成分。
[0026]请参阅图3，待测样品经毛细管电泳检测无峰图出现，表明待检样品不含转基因大豆 GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127 成分。
[0027]实施例2 特异性实验
用实施例1的鉴定方法分别对分离纯化的转基因玉米BT176、Event98140、59122、M0N810、M0N88017、M0N89034、M0N863、GA21、MIR604，转基因大豆 M0N89788，转基因大豆GTS40-3-2，转基因大豆A5547-127，转基因油菜T45，转基因棉花GHB614，非转基因玉米、水稻、小麦、油菜、棉花进行Arm-PCR鉴定。
[0028]请参阅图4，鉴定结果显示:转基因玉米BT176、Event98140、59122、M0N810、M0N88017、M0N89034、M0N863、GA21、MIR604，转基因水稻 BT63，转基因油菜 T45，转基因棉花GHB614，非转基因大豆、水稻、小麦、油菜、玉米、棉花反应管毛细管电泳检测均无峰，即无扩增；转基因大豆M0N89788，转基因大豆GTS40-3-2，转基因大豆A5547-127以及大豆内源基因Lectin毛细管电泳检测有峰，即有扩增，本实验结果显示出良好的特异性。
[0029]本发明基于扩增子拯救多重PCR扩增技术，根据多重PCR体系中的每个靶序列，分别设计两对套式引物，使其可以形成4种扩增引物组合；由于每个靶序列都有4种可能的模式，从而使得寻找不同靶序列最佳通用的扩增条件变得简单可行，具有低成本、快速、高通量和阳性检出率高等优势，具有兼容性、特异性、敏感性、半定量性、灵活性、重复性和高效性:
(O兼容性:在Arm-PCR反应中，每个待检靶序列有2对巢式引物，形成4种扩增引物组合。每种组合可能各自有其最佳扩增条件，但由于各个靶序列都有4种可能的扩增模式，很可能寻找到针对不同靶序列的最佳通用条件；
(2)特异性:因为靶序列特异性巢式引物的浓度极低，即使在多对巢式引物同时存在的条件下，也能和其互补靶序列特异性结合，保证了扩增的特异性；
(3)敏感性:基因特异性引物的量极低，不容易形成引物二聚体，仅用于富集靶序列和向初始PCR加上超级引物标签序列。在富集靶序列和添加超级引物标签后，仅用一对引物进行扩增，而且仅有一个引物标记，都降低了反应的背景噪音；
(4)半定量:Arm-PCR反应中仅使用超级引物作为能进行几何级数扩增的引物，因而，共扩增的靶序列具有相同的扩增效率，扩增终点的产物量能够在一定程度上反应模板的起始拷贝量；
(5)灵活性:可根据待检测的序列的不同，设计不同的巢式引物组合，以针对不同类群的靶序列组合。可以对现有组合进行删减或添加巢式引物，制备新的组合；此外，可以在原靶序列组合中添加新的扩增目标，而不会降低原有靶序列检测的敏感性；
(6)重复性:不需要PCR后的清洗程序，简化了操作流程，同时只有一个通用引物被标记也加强了产品的稳定性和可重复性；
(7)高效性:能在一次反应、一个反应管内对多达20种靶序列同时扩增并标记。
[0030]上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。
【权利要求】
1.一种转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，其特征在于，所述转基因大豆及其衍生品种为转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127及其衍生品种，所述转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127及其衍生品种的Arm-PCR检测引物组包括内参Lectin引物组、特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs，所述特异性的套式PCR引物包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向内引物F1、反向内引物Ri，所述特异性的套式PCR引物用于Arm-PCR的第一步扩增，所述超级上游引物Fs和超级下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步扩增；所述内参Lectin引物组、特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs的核苷酸序列分别如下所示:
GTS40-3-2 正向外引物 Fo: CTTCCCGTTACCTTGCGCGG ；
GTS40-3-2 反向外引物 Ro: CGGTGAGCTTGCCGCGGCCT ； GTS40-3-2正向内引物F1:
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGTCCGCCGTGCTGCTCGCCG ； GTS40-3-2反向内引物R1:
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTCAGGCGGATGGTGCGCACGC ； Mon89788 正向外引物 Fo:GAGACTGATGCTGACGGTGT ； Mon89788 反向外引物 Ro:CACTTCGATGTCGGCACCCA ； Mon89788正向内引物F1:
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTGCTTTCCCATTGGTTGCT ； Mon89788反向内引物R1:
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTATGAGACCAGTACGGGTTGG ； A5547-127 正向外引物 Fo:GGACAGGGTACCCGGGGATC ； A5547-127 反向外引物 Ro:TAGCCTTCCAGGGCCCAGCG ； A5547-127正向内引物Fi:
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGCTGATATGGCCGCGGTTTG ； A5547-127反向内引物Ri:
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGTGGTGTTTGTGGCTCTGTC ； Lectin 正向外引物 Fo:CCAAGTCATCGACGTGCCGG ； Lectin 反向外引物 Ro:GCCACGTCTTCGCCGCCGGC ； Lectin正向内引物Fi:
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGCCTTCCCGCTGGTTGCGGC ； Lectin反向内引物Ri:
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGATGACTTCGATGTCGGCGC ； 超级上游引物 Fs:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC ； 超级下游引物 Rs:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT ?
2.根据权利要求1所述的转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，其特征在于，所述Arm-PCR检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照物，所述引物液包含特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs，其中正向外引物Fo的浓度为1-3 μ M，反向外引物Ro的浓度为1-3 μ Μ，正向内引物Fi的浓度为1_3 μ Μ，反向内引物Ri的浓度为1-3 μ Μ，超级上游引物Fs的浓度为8-12 μ Μ，超级下游引物Rs的浓度为8_12 μ M ；所述反应液中包含Arm-PCR反应缓冲液、浓度为6mM的MgCl2和浓度为1mM的dNTP ;所述DNA聚合酶的浓度为7-9υ/μ I ;所述对照物中阳性对照为大豆标准内参Lectin引物组，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
3.根据权利要求2所述的转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，其特征在于，所述引物液中正向外引物Fo的浓度为2 μ Μ，反向外引物Ro的浓度为2 μ Μ，正向内引物Fi的浓度为2μΜ，反向内引物Ri的浓度为2 μ Μ，超级上游引物Fs的浓度为ΙΟμΜ，超级下游引物Rs的浓度为ΙΟμΜ。
4.根据权利要求2所述的转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，其特征在于，所述所述DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，DNA聚合酶的浓度为8U/ μ I。
5.根据权利要求1-4任一所述的转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，其特征在于，具体步骤如下: Cl)待检样品DNA的提取:采用植物DNA提取试剂盒提取转基因大豆GTS40-3-2、Μοη89788、Α5547-127 的纯化样品 DNA ； (2)设置对照反应:设置阳性对照反应时，用大豆标准内参Lectin引物组代替待检DNA,设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA ； (3)Arm-PCR扩增反应: A第一步扩增:配置反应体系:向200 μ I的PCR管中加入引物液2.5 μ 1、反应液混合物12.5 μ I和待检DNA2-5 μ 1，并用灭菌去离子水将PCR管中溶液补齐到25 μ I ;将配制好的PCR管混匀后离心，于95°C下反应15min，94°C下反应30s，60°C下反应90s，72°C下反应.60s，循环反应15次；再于94°C下反应15s，70°C下反应90s，循环反应6次；再在60°C下延伸反应30min,最后在4 C环境下保存； B第二步扩增:配置反应体系:向200 μ I的PCR管中加入引物液I μ 1、反应液混合物.12.5 μ I和第一步扩增得到的PCR反应产物1-2 μ 1，并用灭菌去离子水将PCR管中溶液补齐到25 μ I ;将配制好的PCR管混匀后离心，于95°C下反应15min ;94°C下反应30s，60°C下反应90s，72°C下反应60s，循环反应30次后在60°C下延伸反应30min，最后在4°C环境下保存； (4)结果判断:通过毛细管电泳检测Arm-PCR扩增结果。
6.根据权利要求5所述的转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(I)中植物DNA提取试剂盒提取转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127的DNA的方法为: A、取95-105mg的转基因大豆GTS40-3_2、Mon89788和A5547-127，放入研钵中，加入液氮迅速磨碎，液氮反复加入3-4次，直至将转基因大豆磨成粉末为止； B、加入400μ I缓冲液FPl和6 μ I浓度为10mg/m的RNaseAl，旋涡振荡Imin,室温放置 1min ； C、加入130μ I缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡Imin ； D、在转速12000rpm下离心5min，将上清转移至新的离心管中； E、向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，出现絮状基因组DNA，在转速.12000rpm下离心2min,弃上清,保留沉淀； F、向沉淀中加入600μ 1/70%的乙醇,润旋振荡5s,在转速12000rpm下离心2min,弃上 清； G、重复步骤F; H、开盖倒置，室温放置5-10min，彻底晾干残余的乙醇； . 1、加入适量洗脱缓冲液TE，65°C下水浴1min溶解DNA，其间颠倒混匀数次助溶，最终得到DNA溶液。
【文档编号】C12Q1/68GK104388579SQ201410778521
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月16日 优先权日:2014年12月16日
【发明者】王丽娟, 方雪恩, 陈旭, 徐凌佳, 孔继烈 申请人:上海速芯生物科技有限公司, 复旦大学