一种基因组定点敲除的方法与流程

本发明涉及一种基因组定点敲除的方法。

背景技术：

crispr-cas9(theclusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats-crispr-associatedprotein9)技术的出现和发展，已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。crispr/cas9protein–rna复合物通过向导rna(guiderna)定位于靶点上，切割产生dna双链断裂(dsb，dsdnabreak)，而后，生物体会本能的启动dna修复机制修复dsb。一般有两种修复机制，一种是非同源末端连接(nhej，non-homologousendjoining)，一种是同源重组(hdr，homology-directedrepair)，通常情况下，nhej修复占大多数，通过随机插入或者缺失不同数量的碱基，细胞将断裂的dsb连接起来，引起编码蛋白的氨基酸移码或发生提前终止，从而改变蛋白的结构，影响基因功能，实现基因定点敲除。

为了提高工作效率，降低工作成本，定点敲除效率的提升一直是植物基因组定点敲除的重要技术方向。另一方面，植物中常用的streptococcuspyogenescas9(spcas9)进行基因组编辑时具有一定的脱靶效应，虽然植物不同于动物，在后代可以通过遗传分离去除脱靶位点，但是由于一些潜在的脱靶位点可能是未知的，所以，后代中就很难有目的性的去除。因此，降低脱靶效应也是植物中一直以来的重要技术方向。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基因组定点敲除的方法。

本发明提供了一种基因编辑系统，包括cas9核酸酶和sgrna；

所述cas9核酸酶如序列表的序列4所示；

所述sgrna的核苷酸序列如序列表的序列2自5’端第445-530位所示。

本发明还保护表达所述基因编辑系统的重组表达载体、表达盒、重组细胞或重组菌。

表达所述cas9核酸酶的表达盒具体可为表达盒甲。

当靶序列如表1所示时，表达所述sgrna的表达盒具体可为表达盒乙。

本发明还保护一种用于基因敲除的重组表达载体，包括表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲表达所述cas9核酸酶；所述表达盒乙包括n个元件乙；所述元件乙包括所述的sgrna和靶序列；所述重组表达载体可靶向n个不同的靶序列进行基因敲除。

所述元件乙还包括pre-trna的核苷酸序列；所述pre-trna的核苷酸序列如序列表的序列2自5’端第344-420位所示。

所述元件乙自5’端依次为pre-trna的核苷酸序列、靶点序列和sgrna的核苷酸序列。

以上任一所述表达盒甲由启动子甲启动所述cas9核酸酶的编码基因表达。所述表达盒甲自5’端依次包括启动子甲、所述cas9核酸酶的编码基因和终止子甲。所述启动子甲具体可为osubq3启动子。所述osubq3启动子的核苷酸序列如序列表的序列3自5’端第1-1714位所示。所述终止子甲具体可为camv35s终止子。所述camv35s终止子的核苷酸序列如序列表的序列3自5’端第5999-6193所示。所述cas9核酸酶的编码基因如序列表的序列3自5’端第1721-5992位所示。所述表达盒甲具体可如序列表的序列3所示。

以上任一所述表达盒乙由启动子乙启动所述元件乙表达。所述表达盒乙自5’端依次包括启动子乙、元件乙和终止子乙。所述启动子乙具体可为osu3启动子。所述osu3启动子的核苷酸序列如序列表的序列2自5’端第1-337位所示。所述终止子乙具体可为osu3终止子。所述osu3终止子的核苷酸序列如序列表的序列2自5’端第1263-1553位所示。当靶序列如表1所示时，所述表达盒乙具体可如序列表的序列2所示。

当靶序列如表1所示时，以上任一所述重组载体具体可为将序列表的序列1自5’端第131位-1633位替换为序列表的序列2，并且将序列表的序列1自5’端第1640-7832位替换为序列表的序列3得到的环状质粒。

本发明还保护一种植物基因组定点敲除的方法，包括如下步骤：利用所述基因编辑系统完成植物基因组定点敲除。

本发明还保护一种植物基因组定点敲除的方法，包括如下步骤：将以上任一所述的重组表达载体导入目的植物，实现植物基因组定点敲除。

本发明还保护所述基因编辑系统，或，以上任一所述重组表达载体、表达盒、重组细胞或重组菌，在植物基因组定点敲除中的应用。

以上任一所述所述植物具体可为水稻，更具体可为日本晴水稻。

本发明的发明人在植物中将espcas9(1.1)和sgrna(modified)组合使用，增加靶点的敲除效率，降低脱靶效应。具体结果为，spcas9+sgrna(modified)敲除效率显著高于spcas9+sgrna(wt)，但脱靶效率升高，使用espcas9(1.1)+sgrna(wt)脱靶效率较spcas9+sgrna(wt)降低或相当，但部分靶点敲除效率显著降低，同时使用espcas9(1.1)和sgrna(modified)，多数靶点敲除效率显著高于spcas9+sgrna(wt)，敲除效率增加至与spcas9+sgrna(modified)相当或略低，而且脱靶效率与spcas9+sgrna(wt)相当或在一定程度上降低。敲除效率的提升可能会伴随脱靶效率的增加，通过使用espcas9(1.1)+sgrna(modified)，平衡了这一矛盾，提升敲除效率的同时，不增加脱靶效率甚至是一定程度的降低脱靶效率。

附图说明

图1为spcas9+sgrna(wt)和espcas9(1.1)+sgrna(wt)对靶点的敲除效率。

图2为espcas9(1.1)+sgrna(modified)和espcas9(1.1)+sgrna(wt)对靶点的敲除效率。

图3为spcas9+sgrna(modified)和espcas9(1.1)+sgrna(modified)对靶点的敲除效率。

图4为脱靶效率检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

日本晴水稻：参考文献：梁卫红,王高华,杜京尧,等.硝普钠及其光解产物对日本晴水稻幼苗生长和5种激素标记基因表达的影响[j].河南师范大学学报(自然版),2017(2):48-52.；公众可以从北京市农林科学院获得。

下述实施例中靶标基因、靶点名称和序列如表1所示。

表1

实施例1、espcas9(1.1)+sgrna(modified)增加靶点敲除效率

一、基因组编辑载体的构建

1、spcas9+sgrna(wt)：人工合成序列表的序列1所示的环状质粒。

序列表的序列1包括如下三个表达盒：

序列1自5’端第131位-1633位为表达盒i，其中，第131-467位为osu3启动子的核苷酸序列，第474-550位为pre-trna的核苷酸序列，第555-574位为oshd1靶点的核苷酸序列，第575-650位为sgrna(wt)的核苷酸序列，第651-727位为pre-trna的核苷酸序列，第728-747位为osghd7靶点的核苷酸序列，第748-823位为sgrna(wt)的核苷酸序列，第824-900位为pre-trna的核苷酸序列，第901-920位为osgl7靶点的核苷酸序列，第921-996位为sgrna(wt)的核苷酸序列，第997-1073位为pre-trna的核苷酸序列，第1074-1093位为gw8-t1靶点的核苷酸序列，第1094-1169位为sgrna(wt)的核苷酸序列，第1170-1246位为pre-trna的核苷酸序列，第1247-1266位为gw8-t2靶点的核苷酸序列，第1267-1342位为sgrna(wt)的核苷酸序列，第1343-1633位为osu3终止子的核苷酸序列。

序列1自5’端第1640-7832位为表达盒ⅱ，其中，第1640-3353位为osubq3启动子的核苷酸序列，第3360-7631位为spcas9的核苷酸序列，第7638-7832位为camv35s终止子的核苷酸序列。

序列1自5’端第7907-11173位为表达盒ⅲ，其中，第7907-9899为zmubi1启动子的核苷酸序列，第9906-10931位为潮霉素的核苷酸序列，第10958-11173位为camv35spolya的核苷酸序列。

2、spcas9+sgrna(modified)：将序列表的序列1自5’端第131位-1633位(表达盒i)替换为序列表的序列2得到的环状质粒。spcas9+sgrna(modified)与spcas9+sgrna(wt)的区别仅在于采用sgrna(modified)替换了sgrna(wt)。

3、espcas9(1.1)+sgrna(wt)：将序列表的序列1自5’端第1640-7832位(表达盒ⅱ)替换为序列表的序列3得到的环状质粒。espcas9(1.1)+sgrna(wt)与spcas9+sgrna(wt)的区别仅在于采用espcas9(1.1)替换了spcas9。

4、espcas9(1.1)+sgrna(modified)：将序列表的序列1自5’端第131位-1633位(表达盒i)替换为序列表的序列2，将序列表的序列1自5’端第1640-7832位(表达盒ⅱ)替换为序列表的序列3得到的环状质粒。espcas9(1.1)+sgrna(modified)与spcas9+sgrna(wt)的区别在于采用sgrna(modified)替换了sgrna(wt)，并且采用espcas9(1.1)替换了spcas9。

序列表的序列2中，自5’端第1-337位为osu3启动子的核苷酸序列，第344-420位为pre-trna的核苷酸序列，第425-444位为oshd1靶点的核苷酸序列，第445-530位为sgrna(modified)的核苷酸序列，第531-607位为pre-trna的核苷酸序列，第608-627位为osghd7靶点的核苷酸序列，第628-713位为sgrna(modified)的核苷酸序列，第714-790位为pre-trna的核苷酸序列，第791-810位为osgl7靶点的核苷酸序列，第811-896位为sgrna(modified)的核苷酸序列，第897-973位为pre-trna的核苷酸序列，第974-993位为gw8-t1靶点的核苷酸序列，第994-1079位为sgrna(modified)的核苷酸序列，第1080-1156位为pre-trna的核苷酸序列，第1157-1176位为gw8-t2靶点的核苷酸序列，第1177-1262位为sgrna(modified)的核苷酸序列，第1263-1553位为osu3终止子的核苷酸序列。

序列表的序列3中，自5’端第1-1714位为osubq3启动子的核苷酸序列，第1721-5992位为espcas9(1.1)的核苷酸序列，第5999-6193位为camv35s终止子的核苷酸序列。

espcas9(1.1)如序列表的序列4所示。

二、在水稻愈伤组织中进行基因编辑

将步骤一构建的四个载体分别按照如下步骤1-5进行操作：

1、将载体导入农杆菌lba4404(唯地生物，上海，cat#:ac1030)，得到重组菌，采用yep培养基培养重组菌，得到菌液od600nm为0.2的侵染液。

2、选取日本晴水稻种子，剥去种皮，灭菌洗涤后，均匀的点入在n6培养基中，28℃暗培养4-6周以诱导愈伤组织的产生。

3、将步骤2得到的水稻愈伤组织浸泡在步骤1得到的侵染液中浸泡10min，取愈伤组织接种于含有两层滤纸的培养皿上，25℃黑暗下培养3天(培养基为含有100mg/l的特美汀的n6培养基)，然后愈伤组织在筛选培养基中(含有50mg/l潮霉素的n6培养基，ph5.7)28℃黑暗下筛选培养2周，转入新配置的筛选培养基中再次进行筛选培养2周，获得抗性愈伤。

4、提取步骤3得到的抗性愈伤的基因组dna，采用引物f(5’-attatgtagcttgtgcgtttcg-3’)和引物r(5’-gatgaagagcttatcgacgt-3’)组成的引物对进行pcr扩增；将获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如电泳图显示有1150bp大小的条带，说明对应的愈伤为阳性抗性愈伤。

5、每个载体取15块步骤4得到的阳性抗性愈伤的dna，分别采用osghd7靶点引物(ghd7-f和ghd7-r)、osgl7靶点引物(gl7-f和gl7-r)、oshd1靶点引物(hd1-f和hd1-r)、gw8-t1靶点引物(gw8-f和gw8-r)和gw8-t2靶点引物(gw8-t1靶点引物相同)进行pcr扩增，然后将扩增产物测序，只要在靶点区产生双峰，就视为发生敲除突变。五个靶点分别统计发生敲除突变的阳性抗性愈伤数，敲除效率为15块阳性抗性愈伤中发生敲除突变的阳性抗性愈伤所占的比例。

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hd1-r:5’-cagctagtaatagatgaactcacgc-3’；

gw8-f:5’-catttcgttggctccacctc-3’，

gw8-r：5’-ccagagatgagaggctgcg-3’。

结果如图1-图3所示。实验结果表明，相对于spcas9+sgrna(wt)，espcas9(1.1)+sgrna(wt)对大部分靶点的敲除效率降低或相当(图1)。espcas9(1.1)+sgrna(modified)相对于espcas9(1.1)+sgrna(wt)，对靶点的敲除效率显著增加(图2)，且在osgl7，gw8-t1，gw8-t2这三个靶点中，敲除效率增加至与spcas9+sgrna(modified)相当或略低(图3)，且多数靶点敲除效率显著高于spcas9+sgrna(wt)(图1和图3)。

实施例2、脱靶效应分析比较

每个载体从实施例1步骤二的4得到的阳性抗性愈伤中选取8块(优先选择经步骤5检测发生敲除突变的，如果发生敲除突变的阳性抗性愈伤数量不足8块，再随机选择经步骤5检测未发生敲除突变的阳性抗性愈伤补足8块)，将其dna进行混合。在cas-offinder网站上(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)输入gw8-t2的靶点序列，预测该靶点在基因组上对应的脱靶位点，选择脱靶可能性最高的前四个潜在脱靶位点，进行二代测序验证脱靶效率。潜在的脱靶位点及序列信息分别为：

gw8-ot1：5’-tctctctcttctgtcagttccgg-3’，

gw8-ot2：5’-tctctctctgctgtcaactccgg-3’，

gw8-ot3：5’-tctctctcttctgtcatccccgg-3’，

gw8-ot4：5’-tttctctctcctctcagctctgg-3’。

针对四个脱靶位点，设计成对引物，分别为：

ot1-f:5’-agggacggcgattggcag-3’，

ot1-r:5’-ttcatctcattgtcattggagctca-3’，

ot2-f:5’-cttctcttcggctacaaagaaagtg-3’，

ot2-r:5’-ccgtaattctcttcctcacgtcg-3’，

ot3-f:5’-atgagggcgatcagataagcttc-3’，

ot3-r:5’-catggggatttggtggtggt-3’，

ot4-f:5’-caaatactttgttcttgttgcagcc-3’，

ot4-r:5’-aaacaagcatgtgaaatcttttgcc-3’。

分别对目标靶点区检测突变情况，靶点区任何突变均计入脱靶。

结果如图4所示。实验结果表明，对于gw8-ot2、gw8-ot3和gw8-ot4这三个靶点，四种形式的组合均未检测到显著的脱靶效应。对于gw8-ot1靶点，spcas9+sgrna(wt)脱靶效率为1.5％，espcas9+sgrna(wt)的脱靶效率接近0，spcas9+sgrna(modified)脱靶效率为4.45％，espcas9(1.1)+sgrna(modified)脱靶效率为1.06％，即espcas9(1.1)+sgrna(modified)脱靶效率较spcas9+sgrna(modified)降低，较spcas9+sgrna(wt)脱靶效率相当或在一定程度上降低。

序列表

<110>北京市农林科学院

<120>一种基因组定点敲除的方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17579

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggtggcaggatatattgtggtgtaaacatggcactagcctcaccgtcttcgcagacgagg60

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