一种肝癌患者来源鸡胚绒毛尿囊膜M-PDX模型构建方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肝癌患者来源鸡胚绒毛尿囊膜m-pdx模型构建方法。

背景技术：

抗血管生成在肝癌治疗的途径之一，而建立血管生成模型是进行肝癌血管生成研究和筛选血管生成抑制剂的前提条件。传统的pdx模型，荷瘤载体一般是裸鼠，裸鼠移植瘤可以保存原有组织学构造或各种功能，能重现已在组织培养中消失的原有的癌结构。但是，由于裸鼠的饲养和繁殖要求条件比较严格，价格比较昂贵，试验周期长，相关裸鼠移植肿瘤模型存在一定局限性，且受到动物伦理学方面的限制。

技术实现要素：

本发明的目的是要解决上述技术问题，提供一种肝癌患者来源鸡胚绒毛尿囊膜m-pdx模型构建方法，本发明应用低分化、高转移特性的人肝癌细胞，在鸡胚尿囊膜(chickchorioallantoicmembranecam)上建立人肝癌移植瘤及其血管生成模型,为肝癌移植瘤及其血管生成的相关研究提供一个简便实用的手段。

本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：一种肝癌患者来源鸡胚绒毛尿囊膜m-pdx模型构建方法，包括临床样本转运、冻存、复苏以及移植四个步骤；

s1.临床样本的转运

从手术室获得临床肝癌肿瘤样本，然后将所述临床肝癌肿瘤样本置于活检组织培养基中，完成转运；

s2.冻存

s21.去除所述临床肝癌肿瘤样本的坏死组织、脂肪和纤维组织，然后切成1-2mm的薄片，放在活检组织培养基中浸洗，取出，

s22.每个冻存管中放入4-6个薄片状的所述s21临床肝癌肿瘤样本的组织，

s23.将1ml含有dmso的培养基放入s22的冻存管内，室温放置30-60min，

s24.将s23的冻存管放入程序降温盒内，置于-80℃冰箱内，进行梯度降温，1℃/min，第二天放入液氮罐，完成冻存；

s3.复苏

s31.从液氮罐中取出冻存管，将其放入37℃温水中2min，

s32.用酒精将步骤s31的冻存管外表彻底擦拭之后，静置2min之后吸出一半的培养液，

s33.向步骤s32的冻存管补充不含dmso的培养液，混匀后静置5min，

s34.弃去步骤s33的冻存管管内的培养基，补充不含dmso的培养基，静置3min，完成复苏；

s4.移植

s41.取7日龄的胚蛋在钝部开窗1cm×1cm，将浸泡过0.01%多聚赖氨酸的硅胶圈放于绒毛尿囊膜上，所述硅胶圈内加入细胞外基质，将完成复苏的所述临床肝癌肿瘤样本的组织，用移液器吸取，置于硅胶圈内，

s42.将完成步骤s41的胚蛋置于培养箱中继续培养，每隔24h镜检拍照，记录肝癌肿瘤生长情况，完成模型构建。

具体地，所述步骤s1转运过程中，所述活检组织培养基的配方为：基础生长培养基500ml，青霉素125000单位，链霉素125000单位，卡那霉素50mg，以及庆大霉素25mg。

具体地，所述步骤s1转运过程中，组织质量大于200mg的所述临床肝癌肿瘤样本在置于所述活检组织培养基之前，所述临床肝癌肿瘤样本放于浓度70%的酒精30s，除菌。

进一步，所述步骤s4移植过程中，所述细胞外基质为基质胶、纤连蛋白的一种或两种。

进一步，所述步骤s42过程中，培养箱为37-40℃，湿度50-70%。

具体地，所述步骤s1转运过程中，所述临床肝癌肿瘤样本在所述活检组织培养基中最长保留时间为2天。

与现有技术相比，具有如下积极效果：

1、本发明的m-pdx荷瘤的载体则是一层带有丰富血管的绒毛尿囊膜，本发明相比起传统模型，具有实验周期短，培养成本低，以及方便操作等的独特优势，造模成功率高；

2、本发明为肝癌移植瘤及其血管生成的相关研究提供一个简便实用的手段，本发明可用于研究肝癌的生长特性、血管生成机制、筛选肿瘤化疗药物、研究肿瘤的放射敏感性及制备肝癌基因片段等，是研究肿瘤生物学特性，特别是肿瘤诱导血管生成的良好模型。本发明通过构建鸡胚绒毛尿囊膜m-pdx模型，进一步标准化、规模化肝癌模型库，进行细胞、动物和临床样本三位一体的全方位模拟评价，从而进行新的肝癌生物标志物和新干预靶标的发现和验证研究，从而发展个性化药物研究体系。

附图说明

图1为本发明实施例1的肝s6段肝癌样本m-pdx模型在显微镜下结构形态图。

图2为本发明实施例3的巨块型肝癌组织样本m-pdx模型在显微镜下结构形态图。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

实施例一

本发明的肝癌患者来源鸡胚绒毛尿囊膜m-pdx模型构建方法，包括临床样本转运、冻存、复苏以及移植四个步骤；

s1.从手术室获得肝s6段肝癌组织质量为150mg想临床肝癌肿瘤样本，然后将所述临床肝癌肿瘤样本置于活检组织培养基中；所述活检组织培养基的配方为：基础生长培养基500ml，青霉素125000单位，链霉素125000单位，卡那霉素50mg，以及庆大霉素25mg，所述临床肝癌肿瘤样本在所述活检组织培养基中保留1天；

s2.冻存的步骤包括：

s21.去除所述临床肝癌肿瘤样本的坏死组织、脂肪和纤维组织，然后切成1.5mm的薄片，放在活检组织培养基中浸洗，取出，

s22.每个冻存管中放入5个薄片状的所述临床肝癌肿瘤样本的组织，

s23.将1ml含有dmso的培养基放入s22的冻存管内，室温放置45min，

s24.将s23的冻存管放入程序降温盒内，置于-80℃冰箱内，进行梯度降温，1℃/min，第二天放入液氮罐，完成冻存；

s3.复苏的步骤包括：

s31.从液氮罐中取出冻存管，将其放入37℃温水中2min，

s32.用酒精将s31的冻存管外表彻底擦拭之后，静置2min之后吸出一半的培养液，

s33.向s32的冻存管补充不含dmso的培养液，混匀后静置5min，

s34.弃去s33的冻存管管内的培养基，补充不含dmso的培养基，静置3min，完成复苏；

s4.移植的步骤包括：

s41.取7日龄的胚蛋在钝部开窗1cm×1cm，将浸泡过0.01%多聚赖氨酸的硅胶圈放于绒毛尿囊膜上，所述硅胶圈内加入细胞外基质，将完成复苏的所述临床肝癌肿瘤样本的组织，用移液器吸取，置于硅胶圈内，

s42.将完成s41的胚蛋置于38℃，湿度60%的培养箱中继续培养，每隔24h镜检拍照，记录肝癌肿瘤生长情况。

实施例二

实施例二的肝癌患者来源鸡胚绒毛尿囊膜m-pdx模型构建方法，包括临床样本转运、冻存、复苏以及移植四个步骤；

s1.从手术室获得肝s6段肝癌组织质量100mg的临床肝癌肿瘤样本，然后将所述临床肝癌肿瘤样本置于活检组织培养基中；所述活检组织培养基的配方为：基础生长培养基500ml，青霉素125000单位，链霉素125000单位，卡那霉素50mg，以及庆大霉素25mg，所述临床肝癌肿瘤样本在所述活检组织培养基中保留2天；

s2.冻存的步骤包括：

s21.去除所述临床肝癌肿瘤样本的坏死组织、脂肪和纤维组织，然后切成2mm的薄片，放在活检组织培养基中浸洗，取出，

s22.每个冻存管中放入6个薄片状的所述临床肝癌肿瘤样本的组织，

s23.将1ml含有dmso的培养基放入s22的冻存管内，室温放置30min，

s24.将s23的冻存管放入程序降温盒内，置于-80℃冰箱内，进行梯度降温，1℃/min，第二天放入液氮罐，完成冻存；

s3.复苏的步骤包括：

s31.从液氮罐中取出冻存管，将其放入37℃温水中2min，

s32.用酒精将s31的冻存管外表彻底擦拭之后，静置2min之后吸出一半的培养液，

s33.向s32的冻存管补充不含dmso的培养液，混匀后静置5min，

s34.弃去s33的冻存管管内的培养基，补充不含dmso的培养基，静置3min，完成复苏；

s4.移植的步骤包括：

s41.取7日龄的胚蛋在钝部开窗1cm×1cm，将浸泡过0.01%多聚赖氨酸的硅胶圈放于绒毛尿囊膜上，所述硅胶圈内加入细胞外基质，将完成复苏的所述临床肝癌肿瘤样本的组织，用移液器吸取，置于硅胶圈内，

s42.将完成s41的胚蛋置于40℃，湿度50%的培养箱中继续培养，每隔24h镜检拍照，记录肝癌肿瘤生长情况。

实施例三

实施例三的肝癌患者来源鸡胚绒毛尿囊膜m-pdx模型构建方法，包括临床样本转运、冻存、复苏以及移植四个步骤；

s1.从手术室获得巨块型肝癌组织质量300mg的临床肝癌肿瘤样本，先将临床肝癌肿瘤样本放于浓度70%的酒精30秒，除菌，然后将所述临床肝癌肿瘤样本置于活检组织培养基中；所述活检组织培养基的配方为：基础生长培养基500ml，青霉素125000单位，链霉素125000单位，卡那霉素50mg，以及庆大霉素25mg，所述临床肝癌肿瘤样本在所述活检组织培养基中保留1天；

s2.冻存的步骤包括：

s21.去除所述临床肝癌肿瘤样本的坏死组织、脂肪和纤维组织，然后切成1mm的薄片，放在活检组织培养基中浸洗，取出，

s22.每个冻存管中放入4个薄片状的所述临床肝癌肿瘤样本的组织，

s23.将1ml含有dmso的培养基放入s22的冻存管内，室温放置60min，

s24.将s23的冻存管放入程序降温盒内，置于-80℃冰箱内，进行梯度降温，1℃/min，第二天放入液氮罐，完成冻存；

s3.复苏的步骤包括：

s31.从液氮罐中取出冻存管，将其放入37℃温水中2min，

s32.用酒精将s31的冻存管外表彻底擦拭之后，静置2min之后吸出一半的培养液，

s33.向s32的冻存管补充不含dmso的培养液，混匀后静置5min，

s34.弃去s33的冻存管管内的培养基，补充不含dmso的培养基，静置3min，完成复苏；

s4.移植的步骤包括：

s41.取7日龄的胚蛋在钝部开窗1cm×1cm，将浸泡过0.01%多聚赖氨酸的硅胶圈放于绒毛尿囊膜上，所述硅胶圈内加入细胞外基质，将完成复苏的所述临床肝癌肿瘤样本的组织，用移液器吸取，置于硅胶圈内，

s42.将完成s41的胚蛋置于37℃，湿度70%的培养箱中继续培养，每隔24h镜检拍照，记录肝癌肿瘤生长情况。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型。