一种支持HEK293细胞悬浮培养的无血清培养基的制作方法

本发明涉及一种支持hek293细胞悬浮培养的无血清培养基，属于细胞工程技术领域。

背景技术：

细胞培养基是决定细胞体外生长代谢最重要、最直接的环境因素。目前大多数合成细胞培养基均需要补充动物血清才能支持细胞的体外生长、增殖，而动物血清的使用带来了动物性病原微生物污染培养物的可能，因此推动了动物细胞无血清培养基的发展。

hek293细胞为目前大规模瞬时基因表达最常用宿主细胞之一，由加拿大mcmaster大学f.l.graham与j.s.miley于1976年用dna转染技术构建而成。hek293细胞是经5型腺病毒75株系转化、含有ad5e1区的人胚肾亚三倍体细胞系。作为e1区缺陷互补细胞系，它可持续表达e1a和e1b基因。

为了使hek293细胞能够大规模应用于瞬时转染，将其驯化为悬浮生长，而悬浮培养过程中hek293细胞极易结团，细胞团直接影响细胞活性，导致hek293细胞无法高密度扩增、连续传代。

现有技术中，进口品牌hek293悬浮培养无血清培养基配方保密且价格高，还存在着培养效果不佳、成分均不明确等问题。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了一种支持hek293细胞悬浮培养的无血清培养基，根据细胞体外生长的营养需求选择不同营养物质以替代动物血清所发挥的作用，并对不同营养物质的比例进行了合理调整，添加抗剪切力物质和抗结团物质，实现了不需要补充血清也可以维持高密度悬浮培养hek293细胞，使其能够维持正常的形态，分散不结团，保持正常的生长速度。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种支持hek293细胞悬浮培养的无血清培养基，由基础培养基包括的组分、血清替代组分和抗结团物质f68组成的，各物质浓度单位为mg/l：

甘氨酸10～50；

l-丙氨酸2～10；

l-精氨酸盐酸盐50～200；

l-天冬酰胺5～20；

l-天冬氨酸5～20；

l-半胱氨酸盐酸盐10～50；

l-胱氨酸盐酸盐20～50；

l-谷氨酰胺300～500；

l-谷氨酸5～10；

l-组氨酸盐酸盐20～50；

l-异亮氨酸50～100；

l-亮氨酸50～100；

l-赖氨酸盐酸盐50～200；

l-蛋氨酸10～50；

l-苯丙氨酸20～50；

l-脯氨酸10～50；

l-丝氨酸20～50；

l-苏氨酸50～100；

l-色氨酸5～20；

l-酪氨酸50～100；

l-缬氨酸50～100；

生物素0.0001～0.01；

氯化胆碱5～10；

d-泛酸钙1～5；

叶酸1～5；

烟酰胺1～5；

盐酸吡哆醇1～5；

核黄素0.1～1；

硫胺素盐酸盐1～5；

维生素b120.1～1；

肌醇10～20；

无水氯化钙100～200；

五水硫酸铜0.0001～0.01；

九水硝酸铁0.01～0.1；

七水硫酸亚铁0.1～1；

无水氯化镁20～50；

七水硫酸镁20～50；

氯化钾300～500；

碳酸氢钠2000～3000；

氯化钠5000～8000；

磷酸氢二钠50～100；

一水磷酸二氢钠50～100；

七水硫酸锌0.1～1；

葡萄糖2000～3000；

次嘌呤钠1～5；

亚油酸0.1～0.5；

硫辛酸0.1～1；

酚红钠盐5～15；

腐胺盐酸盐0.01～0.1；

丙酮酸钠50～200；

胸腺嘧啶0.1～0.5；

hepes2000～5000；

抗坏血酸100～200；

谷胱甘肽5～20；

l-多聚赖氨酸0.1～1；

白蛋白1000～3000；

胰岛素5～50；

转铁蛋白5～50；

氯化锰0.0001～0.01；

偏钒酸铵0.0001～0.1；

氯化镍0.0001～0.1；

二水氯化亚锡0.0001～0.1；

九水硅酸钠0.0001～0.1；

四水钼酸铵0.0001～0.1；

亚硒酸钠0.0001～0.1；

抗结团物质f68：0.1%～0.5%；

余量为水。

附图说明

图1：添加低浓度抗结团物质f68细胞结团状况示意图。

图2：添加高浓度抗结团物质f68细胞结团状况示意图。

图3：hek293细胞低密度下悬浮形式正常生长示意图。

图4：hek293细胞高密度下悬浮形式正常生长示意图。

图5：hek293细胞在本培养基中生长趋势图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1制备无血清培养基

由以下浓度的组分组成，各浓度单位为mg/l：

甘氨酸130；

l-丙氨酸6；

l-精氨酸盐酸盐120；

l-天冬酰胺15；

l-天冬氨酸15；

l-半胱氨酸盐酸盐30；

l-胱氨酸盐酸盐40；

l-谷氨酰胺400；

l-谷氨酸8；

l-组氨酸盐酸盐40；

l-异亮氨酸150；

l-亮氨酸70；

l-赖氨酸盐酸盐150；

l-蛋氨酸30；

l-苯丙氨酸30；

l-脯氨酸30；

l-丝氨酸40；

l-苏氨酸70；

l-色氨酸12；

l-酪氨酸80；

l-缬氨酸80；

生物素0.005；

氯化胆碱7；

d-泛酸钙3；

叶酸3；

烟酰胺3；

盐酸吡哆醇3；

核黄素0.5；

硫胺素盐酸盐3；

维生素b120.5；

肌醇15；

无水氯化钙150；

五水硫酸铜0.005；

九水硝酸铁0.05；

七水硫酸亚铁0.5；

无水氯化镁35；

七水硫酸镁35；

氯化钾400；

碳酸氢钠2500；

氯化钠7000；

磷酸氢二钠70；

一水磷酸二氢钠80；

七水硫酸锌0.5；

葡萄糖2500；

次嘌呤钠3；

亚油酸0.3；

硫辛酸0.5；

酚红钠盐10；

腐胺盐酸盐0.05；

丙酮酸钠100；

胸腺嘧啶0.3；

hepes3500；

抗坏血酸150；

谷胱甘肽15；

l-多聚赖氨酸0.5；

白蛋白2000；

胰岛素30；

转铁蛋白30；

氯化锰0.005；

偏钒酸铵0.005；

氯化镍0.005；

二水氯化亚锡0.005；

九水硅酸钠0.005；

四水钼酸铵0.005；

亚硒酸钠0.005；

余量为蒸馏水。

制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入蒸馏水使各组分终浓度如上所述，调节ph值至7.2，0.22μm滤膜过滤除菌即得，分装，2-8℃保存。

悬浮培养条件为：37℃，5%co2，摇床转速110rpm，接种密度3e⁵cells/ml。

实施例2抗结团物质f68浓度的优化

由于hek293细胞的结团生长特性，细胞增殖过程中极易结团，从而导致细胞衰亡，添加抗结团物质f68缓解细胞结团问题，根据表格1添加抗结团物质f68于实例1配制的hek293细胞悬浮培养无血清培养基中，镜下观察细胞的结团状况，同时计数对比细胞增殖速度：

表1.抗结团物质浓度优化梯度

从上述浓度优化筛选实验可知抗结团物质f68的加入并未影响细胞增殖，据镜下观察细胞结团状况可得用于hek293细胞全悬浮培养的无血清培养基由以下浓度的组分组成，各物质浓度单位为mg/l：

甘氨酸130；

l-丙氨酸6；

l-精氨酸盐酸盐120；

l-天冬酰胺15；

l-天冬氨酸15；

l-半胱氨酸盐酸盐30；

l-胱氨酸盐酸盐40；

l-谷氨酰胺400；

l-谷氨酸8；

l-组氨酸盐酸盐40；

l-异亮氨酸150；

l-亮氨酸70；

l-赖氨酸盐酸盐150；

l-蛋氨酸30；

l-苯丙氨酸30；

l-脯氨酸30；

l-丝氨酸40；

l-苏氨酸70；

l-色氨酸12；

l-酪氨酸80；

l-缬氨酸80；

生物素0.005；

氯化胆碱7；

d-泛酸钙3；

叶酸3；

烟酰胺3；

盐酸吡哆醇3；

核黄素0.5；

硫胺素盐酸盐3；

维生素b120.5；

肌醇15；

无水氯化钙150；

五水硫酸铜0.005；

九水硝酸铁0.05；

七水硫酸亚铁0.5；

无水氯化镁35；

七水硫酸镁35；

氯化钾400；

碳酸氢钠2500；

氯化钠7000；

磷酸氢二钠70；

一水磷酸二氢钠80；

七水硫酸锌0.5；

葡萄糖2500；

次嘌呤钠3；

亚油酸0.3；

硫辛酸0.5；

酚红钠盐10；

腐胺盐酸盐0.05；

丙酮酸钠100；

胸腺嘧啶0.3；

hepes3500；

抗坏血酸150；

谷胱甘肽15；

l-多聚赖氨酸0.5；

白蛋白2000；

胰岛素30；

转铁蛋白30；

氯化锰0.005；

偏钒酸铵0.005；

氯化镍0.005；

二水氯化亚锡0.005；

九水硅酸钠0.005；

四水钼酸铵0.005；

亚硒酸钠0.005；

抗结团物质f680.3%；

余量为蒸馏水。

制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入蒸馏水使各组分终浓度如上所述，调节ph值至7.2，0.22μm滤膜过滤除菌即得，分装，2-8℃保存。

实施例3影响外源基因导入物质浓度的优化

hek293细胞为目前大规模瞬时基因表达最常用宿主细胞之一，为提高外源基因导入和表达率，通过plackett-burman实验筛选培养基组分中影响外源基因导入的物质。

使用实例2中所述配制所得hek293细胞全悬浮培养的无血清培养基，去除亚油酸、腐胺、抗坏血酸、谷胱甘肽、白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠等8种物质，根据表2配制得8种培养基，在这8种培养基中进行转染，目的基因携带荧光蛋白，以荧光蛋白表达率反映外源基因导入和表达率。

表2plackett-burman设计因素水平

表3plackett-burman实验设计结果

据表3中plackett-burman实验设计结果可知，用于hek293细胞全悬浮培养的无血清培养基由以下浓度的组分组成，各物质浓度单位为mg/l：

甘氨酸50；

l-丙氨酸2；

l-精氨酸盐酸盐200；

l-天冬酰胺5；

l-天冬氨酸20；

l-半胱氨酸盐酸盐10；

l-胱氨酸盐酸盐50；

l-谷氨酰胺300；

l-谷氨酸10；

l-组氨酸盐酸盐20；

l-异亮氨酸100；

l-亮氨酸50；

l-赖氨酸盐酸盐200；

l-蛋氨酸10；

l-苯丙氨酸50；

l-脯氨酸10；

l-丝氨酸50；

l-苏氨酸50；

l-色氨酸20；

l-酪氨酸50；

l-缬氨酸100；

生物素0.001；

氯化胆碱10；

d-泛酸钙1；

叶酸5；

烟酰胺1；

盐酸吡哆醇5；

核黄素0.1；

硫胺素盐酸盐5；

维生素b120.1；

肌醇20；

无水氯化钙100；

五水硫酸铜0.01；

九水硝酸铁0.01；

七水硫酸亚铁1；

无水氯化镁20；

七水硫酸镁50；

氯化钾300；

碳酸氢钠3000；

氯化钠5000；

磷酸氢二钠100；

一水磷酸二氢钠50；

七水硫酸锌1；

葡萄糖2000；

次嘌呤钠5；

亚油酸0.5；

硫辛酸1；

酚红钠盐5；

腐胺盐酸盐0.1；

丙酮酸钠50；

胸腺嘧啶0.5；

hepes2000；

抗坏血酸100；

谷胱甘肽5；

l-多聚赖氨酸0.1；

白蛋白1000；

胰岛素5；

转铁蛋白50；

氯化锰0.001；

偏钒酸铵0.001；

氯化镍0.0001；

二水氯化亚锡0.001；

九水硅酸钠0.1；

四水钼酸铵0.1；

亚硒酸钠0.001；

抗结团物质f680.3%；

余量为蒸馏水。

制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入蒸馏水使各组分终浓度如上所述，调节ph值至7.2，0.22μm滤膜过滤除菌即得，分装，2-8℃保存。

实施例4hek293细胞的培养与慢病毒包装

将实施例3制备的培养基置于125ml摇瓶中，将hek293细胞以3.5×10⁵cells/ml接种，在温度37℃下培养，培养3天后，可见hek293t细胞呈分散、悬浮形式正常生长，如图1所示，培养5天后，如图2所示，细胞状态良好，活率90%以上。

取对数期细胞用于慢病毒包装，所用质粒为第三代四质粒包装系统，表达载体携带荧光标记基因，转染试剂为lip2000。同时，以国外品牌（gibco）的无血清培养基为对照，实验结果见表4。

表4慢病毒包装实验结果。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。