一种具有抑菌活性的沙棘籽油的制备工艺的制作方法

本发明涉及一种沙棘子油的制备工艺，采用gc-ms对其化学成分进行定性及定量分析，并发现其对多个菌种都具有良好的抑菌活性，属于食品科学技术领域。

背景技术

我国是世界最早记述沙棘药用价值的国家，早在1000多年前的唐代，藏族医学的经典著作《四部医典》就有了详细的有关沙棘疗效和配伍的记述。1977年沙棘首次被载入《中华人民共和国药典》，获得了中药材的法定地位，此后各版药典均有收录。其次我国沙棘属植物生物多样性最为丰富，资源蕴藏特别广泛。

沙棘籽油是从沙棘籽中提取得到的棕黄色到棕红色透明油状液体，是一种非常好的功能性食品，它含有超过85%的不饱和脂肪酸。此外，沙棘籽油还含有花青素、槲皮素等多种生命活性物质，是一个不可多得的生命活性因子宝库。在国际上，沙棘籽油被称为“油料黄金”。

技术实现要素：

本文采取水蒸气蒸馏法提取沙棘籽油，优化得到最佳的提取工艺参数，并利用gc-ms结合保留指数对其进行定性及定量分析，同时对其开展了抑菌活性的研究，为沙棘籽油今后的进一步开发深加工提供了理论依据。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案，其特征在于，包括以下步骤：

（1）水蒸气蒸馏法提取沙棘籽油：将干燥去杂的沙棘籽经粉碎机粉碎后，过40目筛，置1000ml圆底烧瓶中，加一定比例的蒸馏水，连续蒸馏一定时间，得到淡黄色油滴，冷却吸水后得到固体挥发油。

（2）先通过单因素试验找出沙棘子油提取的单因素最优条件，如提取温度、提取时间、提取溶剂的ph值。

（3）在单因素实验的基础上，以料液比、提取时间、ph值为影响因素，各取3个水平做正交试验（l9（3³）），对沙棘籽油的提取工艺进行优化。

（4）用最优工艺提取沙棘籽油，并用gc-ms对所得挥发油的化学成分进行定性及定量分析。

（5）鉴定最优工艺条件下提取的沙棘籽油分别对大肠埃希氏菌（escherichiacoli）、金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）、白色念珠菌（canidiaalbicans）、酿酒酵母菌（saccharomycescerevisiae）、短小芽孢杆菌（bacilluspumilus）和枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）的抑制作用。

附图说明

图1是液料比对沙棘籽油提取率的影响；图2是提取时间对沙棘籽油提取率的影响；图3是ph值对沙棘籽油提取率的影响；图4是沙棘籽油气相质谱图。

具体实施方式

以下结合图表和具体实施操作对本发明作具体的介绍。

实施方案一沙棘子油提取工艺的优化

为了探究沙棘籽油的最佳提取条件，考察了影响提取率的三个因素：液料比、提取时间、ph值。首先讨论单因素下的最优条件，结合文献，在各因素下选取了三个最优水平，然后在其他两个因素固定的情况下进行实验，对比其提取率高低。以提取率作为参考因素，做出折线图，找到单因素下最佳水平值。

（1）液料比对沙棘籽油提取率的影响

称取60、30、20、15、12g干燥去杂的沙棘籽，粉碎后过40目筛，放入1000ml烧瓶中，加入600ml蒸馏水，即料液比分别为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50。连接挥发油提取装置，100℃提取5h，得沙棘籽油，精密称量计算挥发油提取率，考察不同液料比对沙棘籽油提取率的影响。

（2）提取时间对沙棘籽油提取率的影响

称取30g沙棘籽，固定颗粒大小为40目，料液比1:20，加600ml蒸馏水，分别按4h、5h、6h、7h、8h的提取时间，对沙棘籽油进行提取，考察不同提取时间对沙棘籽油提取率的影响。

（3）ph值对沙棘籽油提取率的影响

称取30g粉碎后过40目筛的沙棘籽粉末，量取600ml蒸馏水，使用盐酸和氢氧化钠分别调出ph值为2、5、7、7.4、8的蒸馏水，对沙棘籽油提取5h，考察不同ph值对沙棘籽油提取率的影响。

由说明书附图图1-3可以看出，沙棘籽油的提取的最优单因素条件为：料液比在1:20（g/ml）、提取时间为5h、ph值为7。

（4）正交实验

在单因素实验的基础上，以料液比、提取时间、ph值为影响因素，各取3个水平做正交试验，对沙棘籽油的提取工艺进行优化。正交因素水平如表所示：

表1正交因素水平设计表

根据以上因素水平，确定按照l9（3³）正交表进行试验，实验结果结果如下表所示：

表2正交试验结果

由表2可以得出ph值对沙棘籽油提取率的影响最为显著，提取时间的影响最小，影响沙棘籽油提取率的主次顺序为c＞a＞b，即ph值＞料液比＞提取时间。最佳提取条件是a2b2c2，即料液比为1:20，ph值为7，提取时间为5h。

实施方案二沙棘籽油化学成分的分析

沙棘籽油gc-ms分析条件：色谱柱：db-1(30m×0.25mm×0.25mm)弹性石英毛细管柱；柱温：初始温度50℃，保持5min，以6℃/min升至250℃，保持5min；进样器温度：280℃；检测器温度：280℃；载气：he；分流比：10:1；进样量：0.4μm；流速：1ml/min质谱条件：电子轰击(ei)离子源电子能量：70ev；接口温度：230℃；倍增电压：1kv；扫描质量范围：33~500；nistio5谱库。

样品的预处理：采用1%硫酸-甲醇酯化法，称量挥发油50mg，加入1%硫酸-甲醇2ml(即浓硫酸2ml，甲醇溶液1.8ml)，混合均匀后在70℃水浴下加热60min，之后加入2ml正己烷，使挥发油溶于到有机相中，再加入蒸馏水直至瓶颈，取出上清液。再用1ml正己烷洗一次，合并两次上清液，过0.45µm微孔滤膜，得到无色透明液体，4℃冷藏，备用。

标准品溶液的配置：取适量的正构烷烃c8-c40标准品溶液，用正己烷溶液将其稀释成质量分数为5%溶液，按上述gc-ms条件进样，得出正构烷烃c8-c40保留时间，为下一步计算沙棘籽油中各组分保留指数作准备。

对所得挥发油进行定性定量的分析，得到沙棘籽油的总离子流图，如说明书附图图4。通过检索对比nist05数据库，并且结合参考文献，根据相似度数值si＞80为依据以除溶剂以外的全部色谱峰面积作为100%，通过面积归一化法计算得出各成分的相对百分含量，结果表3所示。

表3沙棘籽油成分分析结果

水提沙棘籽油中鉴定出30种化合物，其中相对含量较大的组分为(z,z)-9,12-十八烷二烯酸乙酯（42.56%），顺-3-己烯（24.95%），油酸乙酯（11.47%），棕榈酸（9.49%），十六烷酸（3.15%），棕榈酸乙酯（2.95%）。

实施方案三沙棘籽油抑菌活性试验

1、培养基的配置

（1）配方：大肠杆菌培养基（100ml）：胰蛋白胨1.0g；酵母浸粉0.5g；氯化钠1.0g；琼脂粉1.5g；ph7.0~7.2；灭菌110℃，30min。

白色念球菌培养基（100ml）：酵母浸粉0.2g；葡萄糖2.0g；鱼蛋白胨1.0g；磷酸氢二钾0.1g；硫酸镁0.05g；琼脂粉1.5g；ph7.0~7.2；灭菌110℃，30min。

酿酒酵母菌培养基（100ml）：酵母浸粉1.0g；葡萄糖2.0g；蛋白胨2.0g；琼脂粉2.15g；ph7.0~7.2；灭菌110℃，30min。

金黄色葡萄球菌培养基（100ml）：磷酸氢二钾0.5g；蛋白胨1.0g；牛肉浸膏0.5g；琼脂粉1.5g；鱼蛋白胨1.0g；ph7.0~7.2；灭菌110℃，30min。

枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌培养基的配方，与金黄色葡萄球菌培养基的配方相同。

（2）配置方法：按培养基配方比例依次准确称取上述药品放入锥形瓶中，可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充蒸馏水到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。在未调ph前，先用精密ph试纸测量培养基的原始ph值，如果ph偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/lnaoh溶液，边加边搅拌，并随时用ph试纸测其ph值，直至ph达7.6。反之，则用1mol/lhcl进行调节。将配制的培养基分装入三角烧瓶内。

培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。加塞后，将全部三角瓶，培养皿用棉绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道棉绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。放到高压蒸汽灭菌锅内，以110℃，30min高压蒸汽灭菌。将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24~48h，以检查灭菌是否彻底。只有灭菌彻底的培养基才可进行微生物培养。

2、微生物的培养

供试细菌：大肠埃希氏菌（escherichiacoli）、金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）、白色念珠菌（canidiaalbicans）、酿酒酵母菌（saccharomycescerevisiae）、短小芽孢杆菌（bacilluspumilus）和枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）。

培养方法：采用斜面接种法，取出灭菌后的培养基，待冷却至50℃左右，取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、酿酒酵母菌、短小芽孢杆菌的菌原液20μl加入，缓慢摇匀，不能起泡，否则影响观察。在超净台内将培养液慢慢倾倒入平板内，不得超过平板的1/2。将各菌种的培养基配制好后，分别倒入试管中，倾斜试管使之成30°夹角，用竹签蘸取菌落，伸入试管底部，从试管底部向试管口轻划一条直线，在用竹签的另一面从试管底部，以之前的竖线为对称轴，将菌涂抹均匀，封口。放入培养箱中，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌与短小芽孢杆菌的培养温度为恒温37℃，白色念球菌与酿酒酵母菌的培养温度为恒温28℃。在培养24~48h后，挑选健康粗壮的菌落在平板中划线备用。

3、抑菌实验方法

固定料液比、提取时间，用盐酸和氢氧化钠对提取液ph值进行调节，参考半仿生实验，调出的ph值为2，5，7，7.4，8的蒸馏水提取液，使用不同ph值条件下提取的沙棘籽油对六种菌种进行抑菌研究。

采用滤纸片法，将滤纸打成直径为0.5cm的小圆片，高温蒸气杀菌后烘干。用微量移液器分别吸取15μl的微生物分别加入到对应的培养基中，在进行抑菌试验前应先培养六种微生物24~48h，以保证微生物菌种处于生理期活跃状态。用乙醇作为稀释剂，把凝固的沙棘籽油制成挥发油稀释液，再将纸片浸泡在挥发油稀释液中约30min，沥干后贴于含菌平板上，并贴只浸有无水乙醇滤纸片的组为空白对照。

表4不同ph值条件下提得沙棘籽油抑菌活性统计表

注：“+”为有抑菌效果，“-”为无抑菌效果

从表4可以看出沙棘籽油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、短小杆菌均有不同程度的抑菌作用，其中对枯草芽孢杆菌和短小杆菌的抑菌效果尤为明显，还可以看出提取溶剂的ph值对抑菌活性有影响。