本发明涉及裂蹄木层孔菌菌种保藏领域，具体涉及一种用于裂蹄木层孔菌菌种冻干保藏的保护剂及其保藏方法。
背景技术
裂蹄木层孔菌是一味珍贵的民间传统中药材，具有促进血液循环的功效，新研究发现裂蹄木层孔菌具有出众的抑制肿瘤以及提高机体免疫能力的作用。由于野生裂蹄木层孔菌资源稀缺，人们开始通过驯化野生裂蹄木层孔菌菌种并实现人工栽培来满足市场需求，例如，申请号cn201710475571.4的专利申请公开了以小麦胚芽和黄豆粉作为固体培养基培养裂蹄木层孔菌的方法。
在人们实际生产过程中，技术人员对裂蹄木层孔菌菌种的生产性能进行了改良，并获得了多批具有优良生产性能的菌种，因此，对该改良菌种的保藏也是技术人员的一项重要工作，将改良菌种保藏，使该菌种的遗传性状在一定时间内保持稳定，不会轻易受到外界环境的影响而改变，并有利于菌种运输和储存，对优良性状的维持和跨区域的技术交流具有积极意义。
现有技术关于菌种保藏的方法有很多，包括定期移植法、液氮超低温保藏、甘油低温保藏法等，其中保藏效果较好、保藏年限相对较长的方法为真空冷冻干燥法，该方法可延长菌种保存时间，保藏菌种不易退化，而且便于以储存盒的形式出售，是一种较理想的菌种保藏方法。但是该方法需要克服的难题也很突出，此技术难题表现在，菌种细胞在冻干过程易受外界冷冻环境损伤，包括冻干过程的机械损伤、溶质损伤、细胞膜损伤、蛋白质变性失活以及细胞代谢调节作用损伤等，从而造成菌种生理活性下降甚至导致细胞的存活率降低。解决此技术问题的途径是在冻干制剂中加入保护剂，或者根据菌种生长特性选择合适的冻干培养基，以此来提高细胞对冷冻环境的耐受力。由于微生物菌种的多样性和生长特性各异，并非所有保护剂或者冻干培养基都适合每一种微生物菌种的保藏，选择合适的保护剂和冻干培养基对本领域技术人员来说是首要解决的问题。因此，对于裂蹄木层孔菌菌种的冻干保藏，选择适宜的保护剂和冻干培养基对提高冻干菌种的存活率、维持细胞正常生理状态尤为重要。
然而目前关于裂蹄木层孔菌菌种保藏的研究十分鲜见，这对于这一珍稀药用菌品种来说是一大缺憾，对于珍稀品种的保护和延续也是不利的。因此，开发出一种适用于裂蹄木层孔菌优良菌种保藏的方法，对于裂蹄木层孔菌优良品种的保护具有十分重要的积极意义，对裂蹄木层孔菌菌种保藏这一技术领域同样是一项开拓性的进展。
技术实现要素：
为弥补裂蹄木层孔菌菌种保藏领域上的技术空白，提高裂蹄木层孔菌菌种保藏的效果，本发明旨在提供一种新的冻干保藏方法，该方法在冻干培养基和保护剂的组成上做出新的开发和尝试，并对冻干工艺进行优化。具体技术方案如下。
（1）产孢培养基制备
第一培养物：麦粒、大豆、黑米洗净，各称取10~15g于接种瓶中，加入去离子水12~25g，高温蒸汽灭菌20～30min，备用；
第二培养物：另外称取葡萄糖1.8g~2.8g，甘氨酸0.9g~1.3g，磷酸二氢钾和硫酸镁各0.6g～1.1g，谷氨酸、l-异亮氨酸、天冬酰胺各0.21g～0.32g，环腺苷酸0.09g～0.18g，维生素0.15g～0.30g，将其溶解于16~28g去离子水中，使用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，ph自然。上述维生素为维生素b1、维生素b12、维生素b6的等量组合物；
在无菌操作下将上述两种培养物混合均匀，得到产孢培养基。
（2）产孢培养
在无菌条件下向上述产孢培养基接入培养基重量0.5%~2%的裂蹄木层孔菌斜面菌种，于恒温生化培养箱中培养至表面形成分生孢子层，终止培养。设置培养温度为22℃~26℃。
（3）制备孢子悬液
用无菌接种环轻轻刮下培养物表面的孢子层，注入10～20ml无菌生理盐水，充分混匀，并使其完全分散，制成孢子悬液。将孢子悬液进行10倍的梯度稀释后采用稀释平板计数法测定活孢子浓度，得到孢子悬液的浓度。取数量级为107～109cfu/ml浓度的孢子悬液作为冻干材料。
（4）配制保护剂
按配方称取各成分，加入去离子水后混合均匀，使其完全分散，然后进行高温蒸汽灭菌20~30min。保护剂的组成及以重量百分数计的含量为培养余料24%~56%，脱脂牛奶11%～20%、蔗糖5%~13%、谷氨酰胺0.8%~2.9%、脯氨酸0.6%~1.8%，余量为去离子水。所述培养余料的制备方法是将步骤（3）提取孢子后剩余的培养物在60～70℃烘箱内烘干至无水状态，然后粉碎，粉碎至颗粒均可通过120～180目筛，即颗粒粒径为80微米～120微米，所得细粉即为所述培养余料。
（5）制备冻干制剂
在无菌条件下，取无菌西林瓶，向其加入步骤（3）数量级为107～109cfu/ml浓度的孢子悬液1~2ml，再加入步骤（4）保护剂1~3ml，充分混合均匀，加封橡胶塞后冻干。
（6）冻干
将步骤（5）装有冻干制剂的西林瓶进行预冻，设置降温速率为5℃/min，冷却至-45℃，恒温预冻2h；预冻结束后开启真空泵进行抽真空，在真空度达到50pa时，维持此真空度并以2℃/30min的速率升温，样品升温至12℃时结束冻干过程。冻干结束后加封铝盖，于10℃下干燥保存。
本发明开发出一种新的保护剂，用以在裂蹄木层孔菌菌种冻干保藏过程中保护菌种细胞免受干燥、冷冻等因素的影响，从而提高细胞复水后的存活率。本发明方案从优化保护剂的角度出发，在保护剂中添加了培养余料。所述培养余料包含裂蹄木层孔菌形成孢子的过程中产生的代谢产物，包括多种低聚糖、多肽、氨基酸、维生素等物质以及其他尚未发现具体化学组成的低分子量物质，上述低分子量物质能够保护菌种细胞膜免受外界冷冻环境的损伤，防止细胞因受冷冻、干燥而失去生理活性，造成细胞死亡，从而提高了冻干菌种的存活率。
经过方案的实施证明，使用了本技术方案的实验组与采用普通冻干培养基和保护剂的对照组相比，其冻干菌种复水后测定的存活率有显著的差别，实验组明显更优。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员理解，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的阐述。
实施例1
（1）产孢培养基制备
第一培养物：麦粒、大豆、黑米洗净，各称取10g于接种瓶中，加入去离子水12g，高温蒸汽灭菌30min，备用；
第二培养物：另外称取葡萄糖2.2g，甘氨酸1.0g，磷酸二氢钾0.6g和硫酸镁0.6g，谷氨酸、l-异亮氨酸、天冬酰胺各0.22g，环腺苷酸0.09g，维生素0.15g，将其溶解于18g去离子水中，使用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，ph自然。上述维生素为维生素b1、维生素b12、维生素b6的等量组合物；
在无菌操作下将上述两种培养物混合均匀，得到产孢培养基。
（2）产孢培养
在无菌条件下向上述产孢培养基接入培养基重量0.8%的裂蹄木层孔菌斜面菌种，于恒温生化培养箱中培养至表面形成分生孢子层，终止培养。设置培养温度为24℃。
（3）制备孢子悬液
用无菌接种环轻轻刮下培养物表面的孢子层，注入20ml无菌生理盐水，充分混匀，并使其完全分散，制成孢子悬液。将孢子悬液进行10倍的梯度稀释后采用稀释平板计数法测定活孢子浓度，得到孢子悬液的浓度为2.8×109cfu/ml。将此孢子悬液稀释100倍，即浓度为2.8×107cfu/ml，以此浓度的孢子悬液作为冻干材料。
（4）配制保护剂
按配方称取各成分，加入去离子水后混合均匀，使其完全分散，然后进行高温蒸汽灭菌20min。保护剂配方为培养余料40%，脱脂牛奶11%、蔗糖6%、谷氨酰胺1.2%、脯氨酸0.8%，余量为去离子水。所述培养余料为步骤（3）提取孢子后剩余的培养物，其处理方法是将提取孢子后剩余的培养物在70℃烘箱内烘干至无水状态，然后粉碎，粉碎至颗粒均可通过180目筛，即颗粒粒径为80微米，所得细粉即为所述培养余料。
（5）制备冻干制剂
在无菌条件下，取无菌西林瓶，向其加入步骤（3）浓度为2.8×107cfu/ml的孢子悬液2ml，再加入步骤（4）保护剂2ml，充分混合均匀，加封橡胶塞后冻干，则每一瓶冻干菌种含有活孢子总量为5.6×107cfu。
（6）冻干
将步骤（5）装有冻干制剂的西林瓶进行预冻，设置降温速率为5℃/min，冷却至-45℃，恒温预冻2h；预冻结束后开启真空泵进行抽真空，在真空度达到50pa时，维持此真空度并以2℃/30min的速率升温，样品升温至12℃时结束冻干过程。冻干结束后加封铝盖，于10℃下干燥保存。
（7）测定冻干菌种存活率
首先测定冻干结束后冻干品的活孢子数量，即保藏时间为0个月的活孢子数量。测定时设置5个平行试验，测定结果取其平均值。其次，在经过特定的保藏期限后，将保藏3个月、6个月、9个月以及12个月的冻干品取出测定各自的活孢子数量，上述4组每组同样做5个平行试验。测定方法是各称取1g冻干品，加入1ml无菌生理盐水对其进行复水，然后按照稀释平板计数法测定活孢子数量。冻干菌种存活率按式1计算。
式1：
其中，原始孢子悬液的活孢子浓度的数值在本实施例中为2.8×107cfu/ml，冻干制剂的孢子悬液体积的数值为2ml。
（8）结果分析
实验测得的相关数据如表1所示。由表中数据可知，在冻干结束后菌种存活率便达到较高的水平，达到95.18%，在经过一定的保藏时间后，存活率略有下降，但总体能达到较高的存活率，且数值相对稳定。因此，本实施例1的方案产生的效果整体上令人满意，能够基本实现本发明的宗旨和目的。
表格
实施例2
（1）产孢培养基制备
第一培养物：麦粒、大豆、黑米洗净，各称取13g于接种瓶中，加入去离子水20g，高温蒸汽灭菌30min，备用；
第二培养物：另外称取葡萄糖2.2g，甘氨酸1.0g，磷酸二氢钾0.9g和硫酸镁0.8g，谷氨酸、l-异亮氨酸、天冬酰胺各0.25g，环腺苷酸0.14g，维生素0.21g，将其溶解于27g去离子水中，使用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，ph自然。上述维生素为维生素b1、维生素b12、维生素b6的等量组合物；
在无菌操作下将上述两种培养物混合均匀，得到产孢培养基。
（2）产孢培养
在无菌条件下向上述产孢培养基接入培养基重量1.0%的裂蹄木层孔菌斜面菌种，于恒温生化培养箱中培养至表面形成分生孢子层，终止培养。设置培养温度为24℃。
（3）制备孢子悬液
用无菌接种环轻轻刮下培养物表面的孢子层，注入20ml无菌生理盐水，充分混匀，并使其完全分散，制成孢子悬液。将孢子悬液进行10倍的梯度稀释后采用稀释平板计数法测定活孢子浓度，得到孢子悬液的浓度为4.53×1011cfu/ml。将此孢子悬液稀释1000倍，即浓度为4.53×108cfu/ml，以此浓度的孢子悬液作为冻干材料。
（4）配制保护剂
按配方称取各成分，加入去离子水后混合均匀，使其完全分散，然后进行高温蒸汽灭菌20min。保护剂配方为培养余料36%，脱脂牛奶15%、蔗糖8%、谷氨酰胺1.9%、脯氨酸1.4%，余量为去离子水。所述培养余料为步骤（3）提取孢子后剩余的培养物，其处理方法是将提取孢子后剩余的培养物在70℃烘箱内烘干至无水状态，然后粉碎，粉碎至颗粒均可通过180目筛，即颗粒粒径为80微米，所得细粉即为所述培养余料。
（5）制备冻干制剂
在无菌条件下，取无菌西林瓶，向其加入步骤（3）浓度为4.53×108cfu/ml的孢子悬液2ml，再加入步骤（4）保护剂2ml，充分混合均匀，加封橡胶塞后冻干。
（6）冻干
将步骤（5）装有冻干制剂的西林瓶进行预冻，设置降温速率为5℃/min，冷却至-45℃，恒温预冻2h；预冻结束后开启真空泵进行抽真空，在真空度达到50pa时，维持此真空度并以2℃/30min的速率升温，样品升温至12℃时结束冻干过程。冻干结束后加封铝盖，于10℃下干燥保存。
（7）测定冻干菌种存活率
冻干菌种存活率的测定方法和步骤与实施例1相同，同样以保藏0个月、保藏3个月、6个月、9个月以及12个月的冻干品为测定对象，相关实验指标相同。实验测得的相关数据如表2所示。由表2数据可以看出，裂蹄木层孔菌孢子经过冻干后其存活率已经很高，说明实施例2的流程和配方含量是比较优良的方案，而随着保藏时间的延长，其存活率基本能够维持在较高的水平，但是与实施例1相比，菌种的存活率下降的幅度较大，经过12个月的保藏期便下降了约12%，说明在菌种存活率上实施例2方案的效果不如实施例1。
表格2冻干菌种存活率
对照例
对照组设置两组，其与实验组的区别在于，对照组1使用与实施例1同样的孢子悬液作为冻干材料，即实施例1的步骤（3）浓度为2.8×107cfu/ml的孢子悬液，唯一不同的是保护剂配方中不添加培养余料，而是以等量甘露醇代之，其余步骤流程与物质的成分及含量均一致；对照组2使用黑米作为单一谷物取代实施例1的步骤（1）的第一培养物，其含量为30g，经过产孢培养、制备孢子悬液后得到浓度为4.27×107cfu/ml的孢子悬液，将此浓度的孢子悬液作为冻干制剂的成分之一，其余步骤流程与物质的成分及含量与实施例1一致。对照组的相关实验数据如表3、表4所示。
表格3对照组1冻干菌种存活率
表格4对照组2冻干菌种存活率
由表3数据可以看出，当用甘露醇取代培养余料作为保护剂成分时，在冻干结束后菌种的存活率与实施例1相比明显偏低，且随着保藏时间的延长，其下降的趋势明显，经历12个月的保藏时间后便下降了30%左右，说明在保护剂成分上，培养余料与甘露醇相比，培养余料对提高菌种冻干后的初始存活率有较大的促进作用，并能使高存活率在一定保藏时间内维持较高的水平。因此，经过以上的对比，实施例1的方案明显优于对照组1的方案。
将表4数据与实施例1相比较，对照组2以大豆为单一谷物，其菌种冻干后的初始存活率与实施例1相比偏低，且菌种存活率下降的幅度偏大，因此，以黑米为单一谷物的技术方案，其菌种保藏的效果远不如以大豆、麦粒和黑米的混合谷物的技术方案的效果。
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也应属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由各权利要求限定。