人源调控细胞死亡的C1ORF109重组蛋白及其制备方法与应用与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种人源调控细胞死亡的重组蛋白，本发明也涉及这种人源调控细胞死亡的重组蛋白的制备方法和应用

背景技术：

c1orf109基因最初从人正常肺上皮细胞中分离获得，研究发现其参与了细胞死亡调控。c1orf109转录本具有典型的可变剪切和不同的转录起始位点，其编码的蛋白质存在1-62位氨基酸的有或无，以及第214位氨基酸之后的羧基端序列变异，如附图1所示。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种来自于人源的调控细胞死亡的重组蛋白。本发明的目的还在于提供这种人源调控细胞死亡的重组蛋白的制备和应用方法。

本发明的人源调控细胞死亡的重组蛋白，编码序列来源于人胚肾hek293细胞，它是由280个氨基酸残基组成的蛋白质。它由seqidno.1所示核苷酸序列编码，具有seqidno.2所示的氨基酸序列，其中包含第156-215位可诱导细胞死亡的核心肽段。

本发明的重组蛋白是采用下列方法来制备的：首先提取人胚肾hek293细胞的总rna，通过逆转录pcr的方法合成cdna，用特异性引物扩增所述的人c1orf109基因蛋白编码序列，将所述人源调控细胞死亡的蛋白编码序列插入真核细胞表达载体，得到含有所述人源调控细胞死亡的蛋白编码序列的重组质粒，将该重组质粒导入真核细胞，通过免疫印迹的方法确认所述的人源调控细胞死亡的蛋白的表达。

所述特异性引物，上游引物序列为5′-cggaattcatgtcagagaagagacggcgc-3′，下游引物序列为5′-gcctcgagactgtggtacccgtggtctcc-3′。

本发明的蛋白质在调控细胞死亡方面的应用是采用下列方法来进行的：将所述人源调控细胞死亡的蛋白编码序列插入真核细胞表达载体，得到含有所述人源调控细胞死亡的蛋白编码序列的重组质粒，将该重组质粒导入真核细胞，在导入了所述的人源调控细胞死亡的蛋白编码序列的重组质粒的细胞中观察到细胞死亡的变化。

利用本发明提供的方法，成功制备了人源调控细胞死亡的c1orf109重组蛋白。

在概括和以特定的实施方案描述本发明前，列举在描述本发明的上下文中所用的缩写及代号。未在下文或说明书的其他部分定义的那些缩写及代号具有本领域认同的意义。

缩写“c1orf109”是指本发明所提供的人源的调控细胞死亡的蛋白，具有seqidno.2所示的氨基酸序列。

代号“invitrogen公司”指的是一家总部在美国的生物公司。

代号“trizol”指的是invitrogen公司的一种提取rna的试剂的商标。

代号“thermoscripttmrt-pcrsystem”指的是invitrogen公司的一种逆转录试剂盒的名称。

缩写“orf”指的是基因中的开放读码框，其是蛋白质的编码基因。

缩写“pcr”指的是聚合酶链式反应，是一种将核酸片段大量扩增的技术。

代号“plvsin-puro”指的是invitrogen公司的一种真核表达质粒的名称。

缩写“lb”指的是luria-bertani培养基，是一种细菌生长用的培养基。

代号“lipofectamine^tm2000transfectionreagent”指的是invitrogen公司的细胞转染试剂。

代号“hek293”指的是一种人胚肾细胞株。

代号“hela”指的是一种人宫颈癌细胞株。

缩写“fbs”指的是胎牛血清。

代号“flag”指的是带有flag标签的c1orf109-280重组蛋白。

代号“egfp”指的是带有egfp标签的c1orf109-280重组蛋白

代号“westernblot”指的是蛋白印记杂交

附图说明

图1是人源c1orf109蛋白变异体的氨基酸序列特征模式图；

图2是c1orf109-280蛋白在细胞内瞬时表达的蛋白印记杂交图；

图3是c1orf109蛋白的亚细胞定位图；

图4是c1orf109蛋白调控细胞死亡的细胞集落形成结果。

具体实施方式

下面结合附图举例对本发明作更详细的描述：

实施例1

制备一种人源调控细胞死亡的c1orf109重组蛋白：

1、人源调控细胞死亡的蛋白全编码区的克隆

步骤1cdna第一条链的合成

(1)人胚肾细胞hek293总rna的提取

应用invitrogen公司trizolrna提取试剂，按说明书提供的方法提取人胚肾hek293细胞的总rna。并用dnasei处理所提细胞的总rna，然后再用trizol总rna提取试剂纯化rna，通过rna/dna计算器测定rna含量，调整浓度约为1μg/μl，于1％甲醛变性琼脂糖凝胶上电泳检测所提rna标本的完整性。

(2)采用invitrogen公司的thermoscript^tmrt-pcrsystem，采用随机六碱基引物(randomhexamer)进行高温逆转录合成cdna的第一条链。反应条件：25℃10min→60℃60min→85℃5min。

步骤2pcr扩增c1orf109蛋白的orf区

为增强反应的特异性，采用pcr扩增c1orf109orf区。根据软件预测的orf区设计引物。pcr所用的上游引物为5′-cggaattcatgtcagagaagagacggcgc-3′，下游引物为5′-gcctcgagactgtggtacccgtggtctcc-3′。pcr体系为：50μl；pcr程序为：95℃5min、95℃30s、60℃5s、72℃1min、72℃5min、4℃45min,30cycles。结束后琼脂糖胶回收840bp的片段，即得到c1orf109蛋白的orf区基因。

步骤3真核表达载体的构建

(1)连接与转化

采用invitrogen公司plvsin-puro质粒作为真核表达载体。参照说明书的方法进行连接，将步骤2得到的c1orf109蛋白的orf区基因通过ecori和xhoi双酶切，回收后通过t4连接酶连接到到plvsin-puro质粒的ecori和xhoi位点形成c1orf109重组质粒，并参照《分子克隆》(1989)所述的方法将c1orf109重组质粒进行转化大肠杆菌。涂布于含有氨苄青霉素抗性的lb平板。

(2)重组体的确认

随机挑选40个菌落，置于5ml含氨苄青霉素(100ng/ml)的lb培养基中，37℃振荡培养16h，取1ml细菌培养物用于重组质粒序列测定(上海英骏生物技术有限公司)。

2、c1orf109真核表达载体瞬时转染hela细胞及其重组蛋白的表达

步骤1细胞转染

采用invitrogen公司的lipofectamine^tm2000transfectionreagent作为转染试剂，并参照说明书将c1orf109重组质粒转染hela细胞。

步骤2westernblot确认c1orf109重组蛋白的表达

用flag抗体作为一抗，参照《分子克隆》(1989)所述方法对c1orf109重组质粒转染的hela细胞进行westernblot分析。结果如图2所示，从图中清晰可见转染后，所检测到的蛋白分子量与预测分子量一致。

3、c1orf109重组蛋白的亚细胞定位

步骤1将c1orf109重组质粒转染的hela细胞接种到位于培养皿内的细胞培养载片上，过夜后从培养皿中取出载片，pbs洗涤；室温下用多聚甲醛固定，并用pbs洗涤。然后将载有细胞的细胞培养载片浸入tritonx-100中于室温作用10min，并用pbs洗涤。经bsa封闭后，转染带有flag标签的c1orf109重组质粒的细胞用flag抗体在4℃孵育过夜，并于翌日上午用pbs洗涤三次，之后加抗flag抗体的二抗室温下孵育1个小时，然后用pbs洗涤两次。转染带有egfp标签的c1orf109重组质粒的细胞，则在细胞接种于培养载片后只进行过夜培养，培养结束后采用pbs液洗涤两次。

步骤2滴加n-propylgallate(n-丙基没石子酸酯)到经过步骤1处理的细胞载片上进行封片，用激光共聚焦显微镜观察。结果如图3所示，上图为转染带有egfp标签的c1orf109重组质粒的细胞表达的c1orf109-egfp融合蛋白在细胞内的定位情况，下图为转染带有flag标签的c1orf109重组质粒的细胞表达的c1orf109-flag融合蛋白在细胞内的定位情况。

从图中可以清晰地看出，转染含有c1orf109重组体的质粒后，其表达的融合蛋白在细胞核有明显定位。

4、c1orf109蛋白调控细胞死亡(细胞克隆形成)

步骤1在ptripz-egfp载体中插入c1orf109,经测序确认后，制备含有所述ptripz-egfp序列特征的重组质粒，感染hela细胞，采用嘌呤霉素筛选稳定表达c1orf109-egfp融合蛋白的单克隆细胞，并在培养基中加入多西环素鉴定tet-on系统的可靠性，在荧光倒置显微镜下观察具有绿色荧光细胞为筛选阳性细胞。

步骤2将ptripz/c1orf109/egfp/dox感染的单克隆细胞按每孔5000个细胞接种于含有10％的胎牛血清的dmem培养基的6孔板内，设置ptripz/egfp/dox-对照组、ptripz/egfp/dox+对照组和ptripz/c1orf109/egfp/dox-对照组，每组设3个重复。待细胞贴壁后按1μg/ml浓度在含10％的胎牛血清的dmem培养基中加入多西环素，在37℃，5％co2条件下培养，每两天换液一次，14天后采用giemsa染液染色，观察细胞克隆形成的情况。

结果如图4所示，左图为ptripz-egfp/dox-对照组和ptripz-egfp/dox+对照组，从该图中可见有大量的细胞克隆形成，而且两组之间没有差异；右图ptripz-c1orf109-egfp/dox-对照组和ptripz-c1orf109-egfpdox+实验组，可以见到实验组的3个孔中完全没有细胞克隆形成，而ptripz-c1orf109-egfp/dox-的对照组中细胞克隆的数量及大小与ptripz-egfp/dox-对照组和ptripz-egfp/dox+对照组一致。表明含有c1orf109序列的重组蛋白可以诱导细胞死亡。

sequencelisting

<110>哈尔滨工业大学

<120>人源调控细胞死亡的c1orf109重组蛋白及其制备方法与应用

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