一种全自动核酸单链制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种全自动核酸单链制备方法。

背景技术：

近年来，随着经济社会的不断发展，单链核酸杂交技术成为了现代医学生物学等领域诊断与检测的重要手段，常用的核酸单链制备方法包括：热变性法、碱处理法、t7逆转录法、变性高效液相色谱法和不对称pcr。

热变性法：高温使核酸由双链解为单链，操作简单，但制备得到的单链需保存于特定条件，且该方法仅适用于耐高温试剂，对于常温或低温试剂有较大局限性。

t7逆转录法：该方法是在pcr引物5’端加上t7启动子，以纯化pcr扩增产物为模板，用t7rna聚合酶体外逆转录合成单链rna。该方法虽然单链得率较高，但需要两步完成，操作不方便，且需要严格控制rna酶的污染。

核酸外切酶法：由于一条pcr引物被磷酸化，pcr产物在用核酸外切酶消化时，被磷酸化的引物扩增链不被切割，最终得到的pcr产物还需要再纯化，操作不方便，且消化后酶被加热灭活，而单链得率依赖外切酶活性。

变性高效液相色谱法：由于一条pcr引物被生物素标记，其pcr扩增链在dhplc时，会与另一条普通链分开，该方法可以15分钟内直接从双链pcr产物获得所需单链，但需要昂贵的仪器，难以普及。

不对称pcr：用两条不等量的引物进行扩增，得到大量目的单链dna的方法。相比普通pcr，该方法对核酸量要求较高，灵敏度低。

这些方法都需要高度依赖技术人员的操作，人工操作虽然更灵活，但是误差大、效率低，不能实现快速、高效的制备核酸单链。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种全自动核酸单链制备方法。该方法借助磁珠，通过富集、变性等流程，利用核酸提取仪实现核酸单链制备的全自动化，准确且高效。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种全自动核酸单链制备方法，将待处理的标记了生物素的核酸扩增产物和试剂加入加样板中，再将加样板放入全自动核酸提取仪内，启动预先设置好的程序，按以下(1)-(4)的步骤完成全自动核酸单链制备：

(1)核酸提取仪按照预先设置好的混匀参数，将待处理的标记了生物素的核酸扩增产物和结合液的混合物进行混匀，获得混匀液a；

(2)核酸提取仪按照预先设置好的磁吸参数，从磁珠液中吸取磁珠，并加入到混匀液a中，再按照预先设置好的混匀参数进行混匀，获得混匀液b，所述磁珠表面偶联有可识别生物素的功能基团，使标记了生物素的核酸富集包被到磁珠表面；

(3)核酸提取仪按照预先设置好的磁吸参数，从混匀液b吸取包被了核酸的磁珠，并加入到变性溶液中，再按照预先设置好的混匀参数进行混匀，获得混匀液c，使富集包被到磁珠表面的双链核酸变成单链核酸；

(4)核酸提取仪按照预先设置好的磁吸参数，从混匀液c吸取包被了单链核酸的磁珠，加入到后续反应液中。

本发明上述方法的原理是：磁珠表面耦联了可识别生物素的功能基团，核酸扩增产物包含生物素标记的双链核酸，所述生物素可以和磁珠表面的功能基团结合，通过磁吸使包被了生物素标记的双链核酸的磁珠富集，同时使标记了生物素的核酸也同步富集到磁珠表面；变性溶液使得富集包被到磁珠表面的双链核酸变成单链核酸。

核酸提取仪是应用配套核酸提取试剂自动完成样本核酸的提取工作的仪器，操作人员根据样本设置不同参数后，该仪器能自动完成核酸的提取和纯化过程，在生物技术领域应用较为广泛。但是，目前没有人将核酸提取仪用于核酸单链的制备。本发明的发明人利用核酸提取仪可实现的功能，借助磁珠富集作用，获得了上述的核酸单链全自动化制备方法，具有快速、高效、准确的特点。

进一步地，上述的全自动核酸单链制备方法，步骤(1)-(4)中所述的混匀参数包括频率和动作进行的任意组合，在频率上包括连续式、间歇式或周期式；在动作上包括往复吹吸式、上下往复敲打式、水平振荡式或水平旋转拍打式。

步骤(1)在混匀时，敲打混匀次数过多会破坏磁珠表面的亲和素，干扰特异性结合，敲打过少又不能满足充分混匀的要求。因此，本发明混匀参数为上下往复敲打混匀30s～2min，混匀频率为450次/分。

步骤(3)在变性溶液中混匀的过程关系到试验的成败。如果是人工操作，不同操作人员采用相同方法试验时，也会因为一些细小的误差(比如混匀的力度和速度等)影响试验结果。本发明经过大量试验验证，最后用核酸提取仪采用如下的混匀方式保证该步骤的顺利完成：上下往复敲打混匀50s(混匀频率为460次/分)，静置250s；再上下往复敲打混匀30s(混匀频率为460次/分)，静置250s。该混匀方式更加充分地将包被了核酸的磁珠与变性液混匀，静置期间，使得磁珠表面的双链核酸充分地变为单链核酸，而且以仪器替代人工，有效地避免了人为误差对结果的影响。

进一步地，上述的全自动核酸单链制备方法，步骤(1)所述的生物素为维生素b7，又称维生素h、辅酶r；步骤(2)所述功能基团为链霉亲和素、中性链亲和素、卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素或其组合。

进一步地，上述的全自动核酸单链制备方法，步骤(1)所述的核酸扩增产物为pcr扩增、等位基因特异性pcr(aspcr)、链置换扩增(sda)、基于核酸序列扩增(nasba)、滚环扩增(rca)、环介导等温扩增(lamp)等方法扩增的产物。

进一步地，上述的全自动核酸单链制备方法，步骤(2)-(4)所述磁吸的方式为永磁铁吸附富集磁珠或电磁铁吸附富集磁珠。

进一步地，上述的全自动核酸单链制备方法，所述磁珠为可磁化的微小颗粒，该颗粒的直径为0.1μm～10μm。

进一步地，上述的全自动核酸单链制备方法，步骤(3)所述的变性溶液用尿素、甲酰胺、甲醇、乙醇和氢氧化钠中的一种或几种来配置。

优选步骤(3)所述的变性溶液用氢氧化钠配置，配置终浓度为0.05m～0.5m。

本发明上述方法步骤(4)制备的核酸单链可以加入到后续反应液中，反应液根据核酸单链的应用目的而进行选择，可以是杂交反应液、pcr扩增反应液、aspcr扩增反应液、sda扩增反应液、nasba扩增反应液、rca扩增反应液、lamp扩增反应液等反应液。

本发明还提供了一种基因检测的方法，包括前述的全自动核酸单链的制备步骤，以及下述的杂交检测步骤：

(5)核酸提取仪按照预先设置好的磁吸参数，吸取步骤(4)包被了单链核酸的磁珠，加入到杂交反应液中，然后以预先设置好的混匀参数混匀；

(6)将制备好的杂交混合物加到微阵列芯片表面，孵育；

(7)使用芯片洗干仪清洗芯片，然后用离心机甩干；

(8)使用微阵列芯片扫描仪和基因检测分析系统进行信号读取及结果判断。

本发明的一些实施例，采用上述方法对十五项遗传性耳聋基因进行了检测，检测结果与理论结果高度一致。

本发明的全自动核酸单链制备方法具有以下优点：

1、采用核酸提取仪，借助磁珠，通过富集、变性等流程易于实现自动化和高通量化。

2、因所有操作过程均由机器实现，可最大限度避免人为操作带来的失误，极大提高制备单链核酸的效率及稳定性。

附图说明

图1是十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒相关的微阵列芯片点阵排布示意图；

图2是野生型基因组使用十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒的分析检测结果，其中(a)为实施例1的理论杂交测结果，(b)为实施例1的真实杂交测结果；

图3是235杂合基因组使用十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒的分析检测结果，其中(a)为实施例2的理论杂交测结果，(b)为实施例2的真实杂交测结果；

图4是ivs7-2杂合基因组使用十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒的分析检测结果，其中(a)为实施例3的理论杂交测结果，(b)为实施例3的真实杂交测结果。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的发明内容做进一步的阐释，但不应理解为本发明的范围仅限于以下的实例，根据本发明的发明思路和全文内容，可以将以下实例中的各个技术特征做适当的组合/替换/调整/修改等，这对于本领域技术人员而言是显而易见的，仍属于本发明保护的范畴。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例以遗传性耳聋相关的15个snp/突变的检测为例，对本发明进行具体阐述。

实施例1

一、核酸扩增产物的制备

以野生型基因组(该人类基因组dna是从血斑中提取的，且对于遗传性耳聋相关的15个snp/突变而言都是野生型)为模板，加入十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒的扩增试剂，按照如下该试剂盒说明书中提供的扩增程序进行多重等位基因扩增，获得核酸扩增产物。

扩增程序见下表：

二、单链核酸的制备

实验前，先将待处理的标记了生物素的核酸扩增产物、结合液、杂交液、变性液、磁珠悬液在核酸提取仪外加入加样板中，并将加样板放入核酸提取仪，启动预先设置好的程序，按照以下①-④步骤进行全自动核酸单链的制备：

核酸提取仪按照预先设置好的混匀参数(以上下往复敲打混匀方式混匀2分钟(混匀频率为450次/分))，将待处理的标记了生物素的核酸扩增产物(a、b、c三个扩增体系各20μl)和30μl结合液的混合物混匀，获得混匀液a，所述核酸扩增产物包含生物素标记的双链核酸；

采用上述混匀参数混合可以更加高效地将核酸扩增产物与结合液充分混匀，并减少由于人为操作所带来的误差。

核酸提取仪按照预先设置好的磁吸及混匀参数，从磁珠结合液(6μl结合液+9μl磁珠)中吸取磁珠60s，加入30μl结合液中，上下往复敲打混匀30s(混匀频率为460次/分)，得到处理好的磁珠悬液；应用核酸提取仪进行磁吸，可在较短的时间内充分吸取磁珠，减少磁珠损失，此种混匀参数可以更加高效地将磁珠与结合液充分混匀，从而使得磁珠与核酸扩增产物的结合更加充分。

核酸提取仪按照预先设置好的磁吸参数(吸取磁珠60s)通过磁吸方式从处理好的30μl磁珠悬液中吸取磁珠加入到混匀液a中，磁珠上表面耦联了可识别生物素的功能基团的链霉亲和素，然后按照混匀参数混匀(以上下往复敲打混匀方式混匀30s(混匀频率为460次/分)，静置270s；然后再以上下往复敲打混匀方式混匀30s(混匀频率为460次/分)，静置270s)，获得混匀液b，同时使得标记了生物素的核酸富集包被到磁珠表面；

应用核酸提取仪进行磁吸，可在较短的时间内充分吸取磁珠，减少磁珠损失，上述的混匀参数可以更加充分地将磁珠与混匀液a混匀，使得磁珠表面功能基团与核酸扩增产物上的生物素充分结合，增加后续实验的成功率。

核酸提取仪按照预先设置好的磁吸参数(吸取磁珠60s)通过磁吸方式从混匀液b吸取包被了核酸的磁珠60s，并加入到120μl变性溶液中(浓度为0.1mnaoh溶液)，然后按照混匀参数混匀(上下往复敲打混匀50s(混匀频率为460次/分)，静置250s；再上下往复敲打混匀30s(混匀频率为460次/分)，静置250s)，获得混匀液c，同时使富集包被到磁珠表面的双链核酸变成单链核酸；

此种混匀方式可以更加充分地将包被了核酸的磁珠与变性液混匀，静置期间，使得磁珠表面的双链核酸更加充分地变为单链核酸，以提高后续实验的成功率。

三、后续杂交检测

④核酸提取仪按照预先设置好的磁吸参数(吸取磁珠60s)通过磁吸方式从混匀液c吸取包被了核酸的磁珠60s，加入到50μl杂交反应液中，上下往复敲打混匀30s(混匀频率为460次/分)；

应用核酸提取仪进行磁吸，可在较短的时间内从混匀液c中充分吸取包被了核酸的磁珠，减少磁珠损失，上下往复敲打混匀可以更加充分地将包被了单链核酸的磁珠与50μl杂交液混匀，中和磁珠表面残留的变性液，以提高后续实验的成功率。

⑤核酸提取仪按照预先设置好的磁吸及混匀参数，从混匀液c吸取包被了核酸的磁珠60s，加入到20μl杂交反应液中，上下往复敲打混匀10s(混匀频率为450次/分)，进行后续杂交反应。

⑥将制备好的杂交混合物加到微阵列芯片表面，50℃孵育1小时；

⑦使用芯片洗干仪slidewashertm24(博奥，北京)，依次在42℃和室温下分别用两种溶液各清洗一次(洗涤液i：ssc终浓度为0.3×，sds终浓度为0.1％；洗涤液ii：ssc终浓度为0.06×)，然后用离心机甩干芯片；

⑧使用微阵列芯片扫描仪luxscantm10k-a/b(博奥，北京)和十五项遗传性耳聋相关基因检测分析系统(博奥，北京)进行信号读取及结果判断。

该十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒相关的微阵列芯片点阵排布示意图如图1所示。使用该野生型基因组作为模板，采用十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒进行检测分析，实际的杂交结果如图2(b)所示。

四、结果判断

当以野生型基因组为模板，十五项耳聋扩增试剂在整个pcr扩增的过程中，所有的野生型的特异性引物均会进行大量扩增，而所有的突变型的特异性引物均不会进行扩增，于是通过链霉亲和素包被的磁珠表面上只能富集到能与微阵列芯片上的野生型探针进行杂交的单链核酸产物，最后这些富集包被到磁珠表面的单链核酸产物通过杂交将磁珠和荧光连接到微阵列芯片的不同野生型探针上，理论的杂交结果如图2(a)所示。

当使用野生型基因组作为模板，采用十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒进行检测分析，实际的杂交结果如图2(b)所示，与图2(a)中的理论杂交结果完全一致。用进一步配套的十五项遗传性耳聋基因检测分析系统分析确认该样品中遗传性耳聋相关的15个snp/突变都是野生型。

实施例2

一、核酸扩增产物的制备

以235杂合基因组(该人类基因组dna是从血斑中提取的，且对于遗传性耳聋相关的15个snp/突变而言，除gib2基因上的235delc为杂合突变外，其余14个位点基因型均为野生型)为模板，加入十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒的扩增试剂，按照如下该试剂盒说明书中提供的扩增程序进行多重等位基因扩增，获得核酸扩增产物。

扩增程序见下表：

二、单链核酸的制备；及

三、后续杂交检测

按照实施例1中步骤二和步骤三的操作。使用十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒对该235杂合基因组进行检测分析，实际的杂交结果如图3(b)所示。

四、结果判断

当以235杂合基因组(该人类基因组dna对于遗传性耳聋相关的15个snp/突变而言，除gib2基因上的235delc为杂合突变外，其余14个位点基因型均为野生型的人类基因组dna)为模板，十五项耳聋扩增试剂在整个pcr扩增的过程中，gib2基因上的235delc杂合突变型及其余14个野生型位点的特异性引物均会进行大量扩增，于是通过链霉亲和素包被的磁珠表面上只能富集到能与微阵列芯片上的14种野生型探针及gib2基因上的235delc突变型探针进行杂交的单链核酸产物，最后这些富集包被到磁珠表面的单链核酸产物通过杂交将磁珠和荧光连接到微阵列芯片的不同野生型探针及gib2基因上的235delc突变型探针上，理论的杂交结果如图3(a)中。

当以235杂合基因组为模板，使用十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒进行检测分析，真实的杂交结果如图3(b)所示，与图3(a)中的理论杂交结果完全一致。进一步用配套的十五项遗传性耳聋基因检测分析系统分析确认该样品中遗传性耳聋相关的15个snp/突变中，除gib2基因上的235delc为杂合突变型外，其余14个位点基因型均为野生型。

实施例3

一、核酸扩增产物的制备

以ivs7-2杂合基因组(该人类基因组dna是从外周血中提取的，浓度为3ng/μl，且对于遗传性耳聋相关的15个snp/突变而言，除slc26a4基因上的ivs7-2a>g为杂合突变外，其余14个位点基因型均为野生型)为模板，加入十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒的扩增试剂，按照如下该试剂盒说明书中提供的扩增程序进行多重等位基因扩增，获得核酸扩增产物。

扩增程序见下表：

二、单链核酸的制备

实验前，先将待处理的标记了生物素的核酸扩增产物、结合液、杂交液、变性液、磁珠悬液在核酸提取仪外加入加样板中，并将加样板放入核酸提取仪，启动预先设置好的程序，按照以下①-④步进行全自动核酸单链的制备：

同实施例1，但第一混匀参数为：以上下往复敲打混匀方式混匀30s，混匀频率为450次/分。

本实施例的混匀方式除将核酸扩增产物与结合液充分混匀外，还可以避免因敲打混匀次数过多破坏磁珠表面的亲和素，干扰特异性结合。

②③按照实施例1中步骤二中②和③的操作进行。

三、后续杂交检测

按照实施例1中步骤三的操作进行。使用十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒对该ivs7-2杂合基因组进行检测分析，实际的杂交结果如图4(b)所示。

三、结果判断。

当以ivs7-2杂合基因组(该人类基因组dna对于遗传性耳聋相关的15个snp/突变而言，除slc26a4基因上的ivs7-2a>g为杂合突变外，其余14个位点基因型均为野生型的人类基因组dna)为模板，十五项耳聋扩增试剂在整个pcr扩增的过程中，slc26a4基因上的ivs7-2a>g杂合突变型及其余14个野生型位点的特异性引物均会进行大量扩增，于是通过链霉亲和素包被的磁珠表面上只能富集到能与微阵列芯片上的14种野生型探针及slc26a4基因上的ivs7-2a>g突变型探针进行杂交的单链核酸产物，最后这些富集包被到磁珠表面的单链核酸产物通过杂交将磁珠和荧光连接到微阵列芯片的不同野生型探针及slc26a4基因上的ivs7-2a>g突变型探针上，理论的杂交结果如图4(a)中。

当以ivs7-2杂合基因组为模板，使用十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒进行检测分析，真实的杂交结果如图4(b)所示，与图4(a)中的理论杂交结果完全一致。进一步用配套的十五项遗传性耳聋基因检测分析系统分析确认该样品中遗传性耳聋相关的15个snp/突变中，除slc26a4基因上的ivs7-2a>g为杂合突变型外，其余14个位点基因型均为野生型。