一种宝华鹅耳枥ISSR-PCR分子标记体系的制作方法

本发明属于遗传生物学
技术领域：
，具体涉及宝华鹅耳枥issr-pcr分子标记方法。
背景技术：
：宝华鹅耳枥（carpinusoblongifolia）是桦木科鹅耳枥属落叶乔木，仅分布在江苏省宝华山，现有野生植株数量十分稀少，被《中国生物多样性红色名录--高等植物卷》列为极危等级（cr）。然而，由于宝华鹅耳枥分类地位的不确定，研究工作长期遭到忽视，遗传多样性的表现层次未知，缺乏相应的濒危物种保护方案。遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是生态系统多样性和物种多样性的基础，具有从形态特征、细胞学特征、生理特征、基因位点和dna序列等多层次的表现形式，其中dna多样性是遗传多样性的本质。dna分子标记是以个体间核苷酸差异为基础的遗传标记，是dna水平上遗传变异的直接反映，能更准确的揭示种、变种、品种乃至无性系间的差异。dna分子标记已被广泛应用于各种的动植物的品种鉴定、遗传图谱建立、遗传多样性等方面的研究。issr（内部简单重复序列）技术是1994年加拿大蒙特利尔大学的zeitkiewicz等创建的一项新型dna分子标记技术，通过加锚定的微卫星寡核苷酸作引物，对两侧具有反向排列ssr的一段dna序列进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳分离谱带的相对位置，来分析样品间的多态性。因其无需预先克隆和测序ssr两端的碱基序列即可进行扩增，极大减少多态性分析的实验成本，同时操作简单、重复性好、多态性高、物种间通用，尤其对缺乏分子遗传学研究背景的濒危动植物的遗传多样性水平评价中发挥重要作用，比如宝华鹅耳枥。issr分子标记试验的关键在于对反应体系和反应条件的优化，不同材料来源的基因组dna所采用的issr多态性引物不同，引物和退火温度以及相应的pcr体系所采用的不同商品型号的mg2+浓度、dntps浓度和taq酶等诸多因素均会影响试验结果。因此，开发宝华鹅耳枥的issr标记技术，建立科学合理的issr-pcr反应体系，寻求最佳的分子标记体系，可为后续遗传多样性分析奠定基础，为濒危物种的保护提供科学依据。技术实现要素：1.本发明的目的是提供一种宝华鹅耳枥issr-pcr分子标记体系及其应用，包括以下步骤：1）提取宝华鹅耳枥的基因组dna；2）以宝华鹅耳枥基因组dna为模板进行issr-pcr扩增。2.issr-pcr反应体系25µl中含有1*pcr缓冲液，2.5mm的mg2+，0.25mmdntps，引物0.6µm，dna模板50ng，taq酶1.2u，此反应混合液按照：95℃预变性5min，然后95℃变性30sec、56℃退火45sec、72℃延伸1min，40个循环，72℃再延伸7min，进行扩增。3.本发明优选的10条issr-pcr引物来自于加拿大蒙特利尔大学公布的100条引物，no1-10的具体序列如下：no1agagagagagagagagycno2cacacacacacacacagno3tgtgtgtgtgtgtgtgrcno4tgtgtgtgtgtgtgtgrano5ctcctcctcctcctcctcno6ccctccctccctccctno7gggtggggtggggtgno8tagatctgatatctgaattcccno9agagttggtagctcttgatcno10tctctctctctctctcg5.本发明的pcr反应的退火温度由对应的引物确定，具体见表2所示。6.本发明提供的宝华鹅耳枥的issr分子标记体系，pcr产物多态性丰富，背景清晰且信号强。6.本发明较为细致地进行了宝华鹅耳枥issr分子标记体系的优化与引物筛选工作，建立了适合宝华鹅耳枥的issr-pcr最佳反应体系，提高了实验的准确定和稳定性；本发明以issr标记为起点，弥补了国内外对宝华鹅耳枥遗传多样性研究的不足，为宝华鹅耳枥遗传多样性的分析评价奠定了良好的基础。发明成果可应用于宝华鹅耳枥的种间、种内遗传多样性分析评价，也可应用于鹅耳枥属的遗传关系、分子标记辅助育种和新品种选育方面，具有很高的科学价值和应用价值。附图说明图1为提取的宝华鹅耳枥基因组dna。其中m为dl2000的marker，1为芽苞，2为嫩芽。图2为1%琼脂糖凝胶电泳issr-pcr反应体系优化的正交试验结果。其中m为dl2000的marker，1-9表示处理组合1-9，每处理两次重复。图3为1%琼脂糖凝胶电泳筛选最佳引物的部分结果。图4为1.5%琼脂糖凝胶电泳分析引物no3的最佳退火温度，每个退火温度重复两次。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不违背本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1宝华鹅耳枥基因组dna提取（1）取宝华鹅耳枥未萌发的芽苞或新芽100mg左右，放入研钵，加液氮研磨；（2）将充分研磨后的粉末按照植物基因组dna提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）的操作说明进行宝华鹅耳枥基因组dna的提取；（3）te洗脱的基因组dna采用nanodrop检测dna的浓度和质量，同时进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，提取的宝华鹅耳枥株系基因组dna结果见图1。实施例2issr-pcr反应体系正交设计优化（1）在常规pcr反应体系的基础上对宝华鹅耳枥的issr-pcr反应体系进行优化，主要针对mg2+、dntps、taq酶和引物浓度4因素进行3水平的正交设计，采用l9(34)正交设计表进行试验优化，pcr反应体系优化的正交设计表见表1。issr-pcr所采用的的引物是no3，序列为5’agagagagagagagagyc3’[y=（c，t）],2次重复，扩增程序：95℃预变性5min，然后95℃变性30sec，56℃退火45sec，72℃延伸1min，40个循环，72℃再延伸7min，4℃保存。表1pcr反应体系正交优化处理（2）1%琼脂糖凝胶电泳分离pcr反应体系优化的正交试验，结果见图2，9个处理都有明显的条带，且重复之间一致性较好，说明反应体系相对比较稳定，但是从产物条带的数量和清晰度上以处理4最佳，总共可见7个条带，条带清晰、重复性好，为最佳的pcr反应体系组合，即含有1*pcr缓冲液，2.5mm的mg2+，0.25mmdntps，引物0.6µm，dna模板50ng，taq酶1.2u。实施例3引物筛选及最佳退火温度确定（1）本试验issr分子标记的引物采用加拿大蒙特利尔大学提供的序列（ubc801-900），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。（2）在试验确定的最佳反应体系基础上进行引物筛选，100条引物逐一进行pcr扩增，56℃进行退火，结果表明半数以上的引物能够扩增出信号明显的产物，部分产物以1%琼脂糖凝胶电泳，结果可见pcr产物的多态性丰富，见图3，谱带分布区域宽、清晰度高，最终优选的10条多态性好的引物序列见表2。（3）以no3引物为例进行退火温度确定，试验设置了8个退火温度，分别是48℃、48.8℃、50.3℃、52.6℃、55.4℃、57.6℃、59.1℃和60℃。由图4可见，当退火温度低于55.4℃时，issr-pcr扩增产物的条带稍弱，说明扩增效率较低，当退火温度高于57℃时，条带数量变少，55.4℃时条带较多且较为清晰明亮，因此确定此引物的最佳退火温度为55.4℃。依此方法进行其它优选的引物进行退火温度筛选试验，优选的10个引物no1-10的最佳退火温度如表2。表2筛选的最佳引物和退火温度引物编号引物序列引物长度（bp）退火温度（℃）最佳退火温度（℃）no1agagagagagagagagyc1850.550.3no2cacacacacacacacag1750.950.3no3tgtgtgtgtgtgtgtgrc1852.5-55.555.4no4tgtgtgtgtgtgtgtgra1851.5-53.555.4no5ctcctcctcctcctcctc1853.955.4no6ccctccctccctccct1655.555.4no7gggtggggtggggtg1556.255.4no8tagatctgatatctgaattccc2248.750.3no9agagttggtagctcttgatc2051.250.3no10tctctctctctctctcg1747.650.3当前第1页12