一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒与流程

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌meca基因的方法及检测试剂盒。

背景技术：

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)是造成人和动物感染的最主要致病菌，普遍存在于环境和食品中。即使在低浓度下，金黄色葡萄球菌也可危及人与动物的生命健康，比如会引起急性肺炎、败血症、中毒性休克等疾病。

目前，常规的金黄色葡萄球菌检测方法主要有微阵列，聚合酶链式反应，高通量测序和表面等离子共振等方法。这些方法需要对待测样品进行分离富集，操作繁琐和费时，不利于快速现场检测。近年来，利用生物传感器检测致病菌的方法备受关注，已建立荧光、电化学以及比色法等分析技术，但大多需要进行标记，因而限制了这些技术的广泛应用。

因此，迫切需要构建一种新型检测技术用于金黄色葡萄球菌的检测，使检测过程具有快速、简单、免标记和灵敏度高等特点，从而降低成本，易于推广。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，利用发夹探针(hp)和核酸外切酶(exoiii)辅助的目标信号级联循环扩增策略，构建了一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的方法及检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，包括发夹探针hp、缓冲溶液、n-甲基卟啉二丙酸ix(nmm)和核酸外切酶exoiii，其中发夹探针hp既包含识别原件又包含信号报告原件。发夹探针hp从5'端开始依次为i、ii、iii和iv区域，其中i区5'端为g-quadruplex序列；ii区构成发夹探针茎环结构的环；i区中g-quadruplex序列以外的序列加上ii区序列这一段区域与meca基因序列相同，形成meca基因类似物，而g-quadruplex序列充当信号报告因子；iii区与i区完全互补，共同构成发夹探针茎环结构的茎；iv为3'端凸起，通过碱基互补识别meca基因。本发明试剂盒中添加了exoiii，为了防止发夹探针hp被酶切，所以需要在发夹探针hp的3'端连接数个保护性碱基，使其形成3'端突出末端，即iv区。iv区序列与meca基因的部分序列互补配对。

优选的，发夹探针hp中i区包含23-27个碱基，ii区包含7-9个碱基，iii区包含15-27个碱基，iv区包含9-13个碱基。

优选的，发夹探针hp的i区序列为：gggtagggcgggttgggattgggatca(seqidno：1)。

优选的，发夹探针hp的ii区序列为：tagcgtcat(seqidno：2)。

优选的，i与iii区序列完全互补。将g-quadruplex紧紧绑住，降低背景信号。

优选的，发夹探针hp的iii区序列为：tgatcccaatcccaacccgccctaccc(seqidno：3)。

优选的，发夹探针hp的iv区序列为ctatgatcccaat(seqidno：4)。

优选的，发夹探针hp的序列如下所示：

hp:5'-gggtagggcgggttgggattgggatca(i区)-tagcgtcat(ii区)-tgatccca

atcccaacccgccctaccc(iii区)-ctatgatcccaat(iv区)-3'(seqidno：5)。

优选的，缓冲溶液包括tris-hcl缓冲溶液，ph＝7.0-7.5。

优选的，缓冲溶液为20mmtris-hcl缓冲溶液，其中含有100mmnacl，10mmmgcl2，15mmkcl，ph＝7.4。此处，缓冲溶液是模拟生理条件，有利于碱基配对。缓冲液的成分、种类和ph可以适应性调整。

优选的，缓冲溶液还包括1×nebuffer缓冲液，作为exoiii酶切缓冲液。

本发明的反应原理如下：

当存在meca基因时，发夹探针iv区与meca基因通过碱基互补结合，使发夹探针hp的3’端iv区形成双链dna的平末端。接着exoiii从发夹探针hp的3’端逐渐酶切双链dna，最后切至ii区，释放出含有g-quadruplex、meca基因类似物(i和ii区)和meca基因。随后meca基因类似物的i和ii区同样与发夹探针hp的iv区结合引发类似meca基因的反应过程。最后，在meca基因和meca基因类似物的不断循环下，释放出大量的g-quadruplex。不断产生的g-quadruplex与荧光染料nmm结合(λex＝399nm，λem＝610nm；λex为激发光波长，λem为发射光波长峰值)，产生明显的荧光变化。根据释放的g-quadruplex/nmm复合物浓度与荧光强度成线性关系(λex＝399nm，λem＝610nm)，从而达到检测金黄色葡萄球菌meca基因的目的。因为mecagene是金黄色葡萄球菌的一段致病基因，只存在于金黄色葡萄球菌中，所以可以通过检测mecagene达到检测金黄色葡萄球菌的目的。

在最佳条件下，该方法的线性范围从10fm到10nm，检测限为2.4fm。该方法还对其他可能的干扰核酸表现出显著的选择性。牛奶实际样品分析金黄色葡萄球菌meca基因的结果表明，该方法具有较好的精密度和准确度。

一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：

(1)将发夹探针hp溶解于缓冲溶液中，90-95℃加热5-10分钟，冷却至室温；

(2)将待测溶液加入到含有发夹探针hp和exoiii的缓冲溶液，室温下反应；再加入n-甲基卟啉二丙酸ix荧光染料，室温下反应；在激发波长为399nm，发射波长为610nm的条件下，测定上述体系的荧光强度；根据释放的g-quadruplex/nmm复合物浓度与荧光强度成线性关系(λex＝399nm，λem＝610nm)，从而达到检测金黄色葡萄球菌meca基因的目的。

其中，发夹探针hp、缓冲体系、n-甲基卟啉二丙酸ix和核酸外切酶exoiii如上述任一项所述。

当meca基因不存在时，体系的荧光强度没有变化；当有meca基因存在时，体系中发夹探针hp与meca基因结合导致该复合物被exoiii酶切。在酶切的作用下，发夹探针hp释放出meca基因和meca基因类似物。释放的meca基因和meca基因类似物不断与发夹探针hp结合，持续释放出g-quadruplex。根据释放的g-quadruplex/nmm复合物浓度与荧光强度成线性关系(λex＝399nm,λem＝610nm)，从而达到检测金黄色葡萄球菌meca基因的目的。因为mecagene是金黄色葡萄球菌的一段致病基因，只存在于金黄色葡萄球菌中，所以可以通过检测mecagene达到检测金黄色葡萄球菌的目的。本发明所述的检测方法的原理图见图1。

本发明的有益效果是：

本发明是以发夹探针hp结合核酸外切酶(exoiii)辅助目标信号级联再循环扩增策略。以g-quadruplex为信号报告分子，可现实免标记检测金黄色葡萄球菌meca基因，简化了操作，降低了成本。整个检测过程响应迅速，简单、免标记，且灵敏度高，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。

本发明所述的检测方法和检测试剂盒，对环境或食品中金黄色葡萄球菌的快速检测具有重要意义。

附图说明

图1为本发明所述的检测方法的原理图；

图2为对不同浓度的金黄色葡萄球菌meca基因检测的结果图；

图3为特异性实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不局限于此。

实施例1

一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，包括下列成分：

(1)发夹探针hp，序列如下：

hp:5'-gggtagggcgggttgggattgggatca(i区)-tagcgtcat(ii区)-tgatcccaatcccaacccgccctaccc(iii区)-ctatgatcccaat(iv区)-3'(seqidno：5)；

(2)exoiii及1×nebuffer缓冲液；

(3)20mmtris-hcl缓冲溶液，其中含有100mmnacl，10mmmgcl2，15mmkcl，ph＝7.4。

一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的方法按照如下步骤进行：

(1)发夹探针hp的形成。将浓度为10μm的发夹探针hp，置于90℃水浴锅中加热10分钟，随后缓慢冷却至室温；

(2)金黄色葡萄球菌meca基因的检测。首先将2μl待测溶液加入到含有300nm发夹探针hp和37.5uexoiii的38μltris-hcl缓冲溶液，室温下反应30分钟；再加入500nmnmm荧光染料，室温下接着反应30分钟；最后把反应体系稀释到200μl(本实验室荧光仪器所要求，本领域技术人员可以适应性调整)。根据释放的g-quadruplex/nmm复合物浓度与荧光强度成线性关系(λex＝399nm，λem＝610nm)，从而达到检测金黄色葡萄球菌meca基因的目的。因为mecagene是金黄色葡萄球菌的一段致病基因，只存在于金黄色葡萄球菌中，所以可以通过检测mecagene达到检测金黄色葡萄球菌的目的。本发明所述的检测方法的原理图见图1。

实施例2

对不同浓度金黄色葡萄球菌meca基因的检测：

配制金黄色葡萄球菌meca基因标准溶液，浓度分别为0、10fm、10²fm、10³fm、10⁴fm、10⁵fm、10⁶fm、10⁷fm、10⁸fm和10⁹fm，4℃保存。

将不同浓度的meca基因溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察体系荧光强度变化，结果如图2(图2a：在λex＝399nm条件下，不同meca基因浓度所对应的发射光波谱图；图2b：在λex＝399nm条件下，λem＝610nm得到的荧光标准曲线图；)所示，10fm的meca基因可产生明显的荧光变化，说明其检测限<10fm。随着meca基因浓度增加，荧光强度也增加，并逐渐趋于饱和。

实施例3

特异性实验：

配制10nm不同核酸的标准溶液，它们分别是m1，m2，m3和nc。

m1:5’-attgggatgatagcgtcatt-3’(seqidno：6)，

m2:5’-attgggatgataccgtcatt-3’(seqidno：7)；

m3:5’-attgcgatgataccgtcatt-3’(seqidno：8)；

nc:5’-tgccgctcatccgccacata-3’(seqidno：9)。

其中下划线字母代表错配碱基。

将10nm的不同干扰物标准溶液和10nmmeca基因溶液分别加入到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察体系荧光变化，结果如图3所示，10nm的m1、m2、m3和nc荧光强度均远远低于10nm的meca基因，其中m1体系和m2的荧光强度分别为meca基因的32％和1％。m3体系和nc的荧光强度与空白组一样。这证明该方法对meca基因的检测具有较好的特异性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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<110>广东省生态环境技术研究所

<120>一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌meca基因的方法及检测试剂盒

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