用于测定生物材料中目标序列甲基化率的方法及试剂盒与流程

本发明属于生物
技术领域：
，特别是涉及一种用于测定生物材料中目标序列甲基化率的方法及试剂盒。
背景技术：
：dna甲基化是真核生物表观遗传学重要的机制之一，在基因的表达调控中发挥着重要的作用。dna甲基化是真核生物基因组进行局部调整的主要方式，如基因组序列中腺嘌呤的n-6位、鸟嘌呤的n-7位和胞嘧啶的n-4位以及胞嘧啶的c-5位均可能发生甲基化，其中胞嘧啶的c-5位是最常见的甲基化位点，已成为当前该领域研究的热点问题。现有研究表明，dna甲基化参与了生物体中多种代谢与生理生化过程，如基因的时空特异性表达(包括基因沉默)、自交不亲和、x染色体失活、衰老以及癌症的发生及物种进化等。camv35s启动子是指来自花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子。它是转基因植物中使用频率最高的启动子，能在许多植物物种，几乎所有发育阶段及所有组织中高效表达，被广泛用于构建转基因植株，如玉米、棉花、大豆、番茄等。转基因沉默是转基因植物中经常被发现的现象，有研究表明，在转基因沉默的棉花植株中，camv35s启动子的甲基化是造成标记基因沉默的主要原因。因此测定转基因植物中camv35s启动子的甲基化是分析转基因植物是否可能发生转基因沉默的重要内容之一。在过去数十年中，dna甲基化的分析方法得到了长足的发展，人们已建立了多种检测dna甲基化的方法与技术。针对基因组dna特定序列，目前，dna甲基化分析技术主要分为以下两类：第一类是依托各种测序技术，针对特定序列进行dna甲基化位点检测与分析；第二类是依托pcr技术的甲基化分析技术。由于pcr技术的普遍性与快速方便等特点，因此，目前dna甲基化分析检测方法以第二类应用最为广泛。目前常用的dna甲基化分析是采用亚硫酸盐处理基因组dna，再通过pcr扩增目的区域，克隆测序。通过序列比对来分析目标区域的甲基化情况。这种方法尽管获得的甲基化信息比较全面，但操作步骤多，耗时也较长，由于要进行多个克隆的测序，成本也很高。技术实现要素：本发明基于本领域存在的上述缺陷，提供了一种利用荧光定量pcr快速测定待测生物材料中目标序列甲基化率的方法，尤其是测定转基因植物中camv35s启动子甲基化率的试剂盒及方法。采用本发明的试剂盒及方法，可快速、准确地定量检测出待测生物材料中目标序列的甲基化程度，更能准确测定出转基因植物中camv35s启动子甲基化率，从而进一步获知目标转基因植物中是否存在因启动子甲基化导致的可能的基因沉默。本发明的技术方案如下：本发明第一个方面提供一种用于测定待测生物材料中目标序列甲基化率的方法，其特征在于，包括：(1)用内切酶酶切处理所述待测生物材料的基因组dna；所述内切酶对cpg甲基化敏感，且所述目标序列上分布有所述内切酶的切割位点序列；经所述酶切处理后得到的酶切产物为包含有酶切后的目标序列的待测生物材料的基因组dna；(2)用目标序列的特异性引物对步骤(1)所得到的酶切产物进行荧光定量pcr扩增，获得酶切后的待测生物材料目标序列的ct值：ctm；所述目标序列的特异性引物基于含有所述内切酶切割位点序列的目标序列设计而得，且其上下游引物之间的扩增片段区域覆盖所述内切酶切割位点序列；(3)用所述目标序列的特异性引物对未经所述内切酶酶切的待测转基因植物的基因组dna进行荧光定量pcr扩增，获得对照处理的所述待测生物材料目标序列的ct值：ctk；(4)计算待测生物材料的目标序列甲基化率：m；m＝2-δctm；其中，δctm＝ctm-ctk。采用上述方法测定待测生物材料的目标序列甲基化率的原理在于：用对cpg甲基化敏感、且酶切位点位于目标序列内部的内切酶酶切待测转基因植物的基因组dna，可使目标序列内部cpg甲基化的部位不被内切酶切开，而未被甲基化的部位就会被内切酶切开；用目标序列特异性引物对酶切后的待测转基因植物基因组dna进行定量pcr扩增，未被甲基化的目标序列由于被内切酶切开，则扩增不出目的片段，相应的ct值小；而已被甲基化的目标序列则不会被内切酶切开，可以扩增出目的片段，相应的ct值大，总体上，酶切处理所得到的ct值能反映出现目标序列的甲基化程度，而ct值则将其量化。同时，对照处理的待测转基因植物的基因组dna，由于不经内切酶酶切处理，则全部能够经目标序列特异性引物扩增出目的片段，相应的ct值大；在相对定量的情况下，将酶切处理所得的ct值减去对照的ct值，能够反映目标序列因甲基化造成的ct值扰动，经计算公式计算得到甲基化率。本领域技术人员可根据本发明的上述方法内容的披露，根据其实际操作中的具体需求，基于所选择的生物材料中，被锁定的有待测定甲基化率的目标序列，设计特异性引物，筛选内切酶，特异性引物和内切酶都必须符合上述方法所记载的各项特征描述，方可有效地对目标序列进行荧光定量pcr，获得准确地能反映甲基化程度变化的ct值，进而获得目标序列的甲基化率。本领域技术人员为了内部校准、校准dna总体用量、或者出于绝对定量的目的，可以优选地采用内参基因(本领域也称内标基因)进行校准，比如，在本发明的一些优选实施例中，所述方法还包括：用内参基因校准；采用所述内参基因的特异性引物分别对步骤(1)所得到的酶切产物，和未经所述内切酶酶切的待测生物材料的基因组dna，分别进行荧光定量pcr扩增，分别得到酶切处理的内参基因的ct值：ctmnc，和对照处理的内参基因的ct值：ctknc；所述内参基因特异性引物的扩增片段区域不包含所述内切酶的切割位点序列；所述待测生物材料目标序列甲基化率：m＝2-δδct；其中，δδct＝δctm-δctk；δctk＝ctmnc-ctknc。在进一步的实施例中，所述步骤(2)和步骤(3)中的pcr扩增为同时进行，且进行荧光定量pcr扩增时的模板dna用量一致。此处同时进行的含义包括，同一批上样pcr仪跑pcr扩增，或者同一个反应体系，同一管跑pcr，目的是为了消除不同反应批次带来的反应条件上的细微差别从而造成的误差。在具体的实施例中，所述内参基因选自待测生物材料领域的公知内参基因。一般而言，内参基因选择本领域常用的公知的标准基因，本领域技术人员可以根据文献记载、标准公开的内容选择相应的内参基因，只要符合该内参基因的扩增片段不被所述内切酶酶切即可。在一些具体的实施例中，所述待测生物材料选自：转基因植物材料、转基因动物材料、转基因微生物材料、普通植物材料、普通动物材料、普通微生物材料。上述普通植物材料、普通动物材料、普通微生物材料是相对于转基因植物、动物、微生物而言，其生物材料本身并未经过任何转基因操作，和/或，其基因组dna并未插入、剪切、连接任何转基因序列片段。在另一些具体的实施例中，所述目标序列选自dna序列。基于上述甲基化率的通用测定方法，本发明的第二个方面提供了一种用于测定转基因植物中camv35s启动子序列甲基化率的方法，其特征在于，采用所述的方法，用内切酶酶切处理待测转基因植物的基因组dna，并camv35s启动子序列的特异性引物对酶切后的待测转基因植物的基因组dna进行荧光定量pcr，获得酶切后的待测转基因植物的camv35s启动子序列的ct值：ctm35s；用所述camv35s启动子序列的特异性引物对未经酶切的待测转基因植物的基因组dna进行荧光定量pcr获得对照处理的所述转基因植物camv35s启动子的ct值：ctk35s；计算待测转基因植物的camv35s启动子序列甲基化率：m35s；m35s＝2-δctm；其中，δctm＝ctm35s-ctk35s。本发明的第二组实施例提供的这种测定转基因植物中camv35s启动子序列甲基化率的方法，正是基于上述本发明第一个方面所提供的甲基化率通用测定方法具体引申得来。第一个方面提供的甲基化率通用测定方法中所提及的待测生物材料在本组实施例中具体为所述转基因植物，而第一个方面提及的目标序列在本组实施例中则具体指camv35s启动子序列。本领域技术人员可根据本发明的披露，还可拓展延伸至其他待测生物材料，比如普通植物材料、转基因/普通动物材料、转基因/普通微生物材料。目的序列可以是除camv35s启动子序列以外，可能存在甲基化现象的需要测定甲基化率的待测生物材料基因组dna中的其它序列。在优选的一个实施例中，所述camv35s启动子特异性引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示；所述内切酶为hpych4iv内切酶。经实验证明，采用所述特异性引物及内切酶，通过上述方法中的各个步骤环节，所得到的甲基化率与采用常规方法所得到的甲基化率，结果基本一致，说明本发明的方法准确度高。同时，采用本发明的方法，无需像本领域的常规方法(用亚硫酸盐处理基因组dna，再通过pcr扩增目的区域，克隆测序)那样繁琐，亦无需耗费更多的时间费用，本发明的方法操作简单、成本低廉、快速准确；由于只需进行荧光定量pcr即可获知结果，因此可以实现高通量样品检测。本发明的第三个方面提供了一种用于测定转基因植物中camv35s启动子序列甲基化率的试剂盒，其特征在于，包括：hpych4iv内切酶，以及，序列如seqidno.1和seqidno.2所示的camv35s启动子特异性引物；所述hpych4iv内切酶用于酶切处理转基因植物中camv35s启动子序列；所述camv35s启动子特异性引物用于对酶切后的待测转基因植物基因组dna，和，未经酶切的待测转基因植物基因组dna分别进行荧光定量pcr扩增，进而分别获得酶切后的待测转基因植物中camv35s启动子序列的ct值：ctm35s，以及，对照处理的转基因植物camv35s启动子的ct值：ctk35s；所述camv35s启动子序列甲基化率m35s＝2-δctm；其中，δctm＝ctm35s-ctk35s。在进一步的实施例中，所述的试剂盒还包括：用于扩增所述转基因植物内参基因的特异性引物；所述内参基因特异性引物的扩增片段区域不包含hpych4iv内切酶的酶切位点序列；所述内参基因的特异性引物用于对酶切后的待测转基因植物基因组dna，和，未经酶切的待测基因植物的基因组dna，分别进行荧光定量pcr扩增，进而分别得到酶切处理的内参基因的ct值：ctmnc，和对照处理的内参基因的ct值：ctknc；所述待测转基因植物的camv35s启动子序列甲基化率：m35s＝2-δδct；其中，δδct＝δctm-δctk；δctk＝ctmnc-ctknc。本发明的第四个方面还请求保护所述试剂盒在测定转基因植物camv35s启动子序列甲基化率方面的用途，其特征在于，在标有转基因植物camv35s启动子序列甲基化率测定用途的商品包装盒内装有hpych4iv内切酶和，如seqidno.1和seqidno.2所示序列的camv35s启动子特异性引物；和/或，将所述camv35s启动子特异性引物和hpych4iv内切酶用于转基因植物camv35s启动子序列甲基化率的商业检测。本发明的第五个方面还提供一种定量检测转基因棉花中camv35s启动子序列甲基化率的方法，其特征在于，采用所述方法，和/或，所述试剂盒，用其中的所述camv35s启动子特异性引物对酶切后的待测转基因植物基因组dna，和，未经酶切的待测转基因植物基因组dna分别进行荧光定量pcr扩增，进而分别获得酶切后的待测转基因植物中camv35s启动子序列的ct值：ctm35s，以及，对照处理的转基因植物camv35s启动子的ct值：ctk35s；计算所述camv35s启动子序列甲基化率m35s＝2-δctm；其中，δctm＝ctm35s-ctk35s。在进一步的实施例中，所述方法还包括：采用内参基因校准；内参基因选用棉花内参基因acp1基因；所述acp1基因荧光定量pcr扩增反应所采用的引物、探针、pcr反应体系和程序按照国家标准《农业部1943号公告-1-2013》中所记载的进行；采用所述内参基因acp1基因的特异性引物分别对所述内切酶酶切后的待测转基因棉花材料的基因组dna，和未经所述内切酶酶切的待测转基因棉花材料的基因组dna，分别进行荧光定量pcr扩增，分别得到酶切处理的内参基因的ct值：ctmacp，和对照处理的内参基因的ct值：ctkacp；所述待测转基因植物的camv35s启动子序列甲基化率：m35s＝2-δδct；其中，δδct＝δctm-δctk；δctk＝ctmacp-ctkacp。本发明利用部分限制性内切酶对甲基化碱基敏感的特性，即不能切割甲基化的dna酶切位点，开拓性地研发出一套生物材料目标序列甲基化率测定的通用方法，这种方法仅需筛选合适的内切酶、设计合适的特异性引物，进行常规的荧光定量pcr即可通过前后ct值的改变计算出待测目的序列的甲基化率，操作简单、省时省力、节约成本、快速准确，同时又能实现高通量样本检测。而本发明最具体的实验例通过对camv35s启动子序列甲基化敏感内切酶的系统分析筛选，从58种内切酶中筛选到一种内切酶，能有效地辨别camv35s启动子序列。使用该内切酶对样品dna进行酶切，甲基化的camv35s启动子将不能被切割，最后通过实时荧光pcr方法测定酶切后的camv35s启动子的量，通过设置对照和采用棉花内标基因acp1基因对dna量进行校准，从而能准确测定转基因棉花中camv35s启动子的甲基化程度。与目前常用的基于亚硫酸盐处理-克隆的方法相比较，极大地简化了操作步骤，大大节省了时间和成本，同时也极大地提高了检测通量，能同时对多个样品进行分析比较。附图说明图1.camv35s启动子检测引物位置和酶切位点示意图；其中，方框内为引物序列，红色阴影为hpych4iv酶切位点；图2.定量pcr方法扩增曲线；其中，a为acp1基因的扩增曲线；b为camv35s启动子的扩增曲线。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等的分子克隆：实验室手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress，2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。生物材料的来源鄂杂棉1号(润富棉839)(生厂商：湖北中香米业有限责任公司，生产批号：2009-10，审定编号：鄂审棉001-2000)，2010年购自湖北省棉花种子市场。不同蛋白表达量材料筛选：鄂杂棉1号在中国农业科学院植物保护研究所温室种植，经单株分子鉴定和蛋白测定，自交繁殖等获得mon757转化体的不同蛋白表达量的纯合材料。试剂分子生物学试剂，如premixextaqtm、sybrpremixextaqtm等购自大连宝生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和探针由北京三博生物技术有限责任公司合成。植物dna提取试剂盒购自tiangen生物技术有限公司。实验仪器定量pcr扩增仪：型号abi7500(abi公司)；其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。第1组实施例本组实施例提供一种用于测定待测生物材料中目标序列甲基化率的方法，其特征在于，包括：(1)用内切酶酶切处理所述待测生物材料的基因组dna；所述内切酶对cpg甲基化敏感，且所述目标序列上分布有所述内切酶的切割位点序列；经所述酶切处理后得到的酶切产物为包含有酶切后的目标序列的待测生物材料的基因组dna；(2)用目标序列的特异性引物对步骤(1)所得到的酶切产物进行荧光定量pcr扩增，获得酶切后的待测生物材料目标序列的ct值：ctm；所述目标序列的特异性引物基于含有所述内切酶切割位点序列的目标序列设计而得，且其上下游引物之间的扩增片段区域覆盖所述内切酶切割位点序列；(3)用所述目标序列的特异性引物对未经所述内切酶酶切的待测转基因植物的基因组dna进行荧光定量pcr扩增，获得对照处理的所述待测生物材料目标序列的ct值：ctk；(4)计算待测生物材料的目标序列甲基化率：m；m＝2-δctm；其中，δctm＝ctm-ctk。采用上述方法测定待测生物材料的目标序列甲基化率的原理在于：用对cpg甲基化敏感、且酶切位点位于目标序列内部的内切酶酶切待测转基因植物的基因组dna，可使目标序列内部cpg甲基化的部位不被内切酶切开，而未被甲基化的部位就会被内切酶切开；用目标序列特异性引物对酶切后的待测转基因植物基因组dna进行定量pcr扩增，未被甲基化的目标序列由于被内切酶切开，则扩增不出目的片段，相应的ct值小；而已被甲基化的目标序列则不会被内切酶切开，可以扩增出目的片段，相应的ct值大，总体上，酶切处理所得到的ct值能反映出现目标序列的甲基化程度，而ct值则将其量化。同时，对照处理的待测转基因植物的基因组dna，由于不经内切酶酶切处理，则全部能够经目标序列特异性引物扩增出目的片段，相应的ct值大；在相对定量的情况下，将酶切处理所得的ct值减去对照的ct值，能够反映目标序列因甲基化造成的ct值扰动，经计算公式计算得到甲基化率。本领域技术人员可根据本发明的上述方法内容的披露，根据其实际操作中的具体需求，基于所选择的生物材料中，被锁定的有待测定甲基化率的目标序列，设计特异性引物，筛选内切酶，特异性引物和内切酶都必须符合上述方法所记载的各项特征描述，方可有效地对目标序列进行荧光定量pcr，获得准确地能反映甲基化程度变化的ct值，进而获得目标序列的甲基化率。本领域技术人员为了内部校准、校准dna总体用量、或者出于绝对定量的目的，可以优选地采用内参基因(本领域也称内标基因)进行校准。例如，优选地，所述方法还包括：用内参基因校准；采用所述内参基因的特异性引物分别对步骤(1)所得到的酶切产物，和未经所述内切酶酶切的待测生物材料的基因组dna，分别进行荧光定量pcr扩增，分别得到酶切处理的内参基因的ct值：ctmnc，和对照处理的内参基因的ct值：ctknc；所述内参基因特异性引物的扩增片段区域不包含所述内切酶的切割位点序列；所述待测生物材料目标序列甲基化率：m＝2-δδct；其中，δδct＝δctm-δctk；δctk＝ctmnc-ctknc。进一步地，所述步骤(2)和步骤(3)中的pcr扩增为同时进行，且进行荧光定量pcr扩增时的模板dna用量一致。此处同时进行的含义包括，同一批上样pcr仪跑pcr扩增，或者同一个反应体系，同一管跑pcr，目的是为了消除不同反应批次带来的反应条件上的细微差别从而造成的误差。具体地，所述内参基因选自待测生物材料领域的公知内参基因。一般而言，内参基因选择本领域常用的公知的标准基因，本领域技术人员可以根据文献记载、标准公开的内容选择相应的内参基因，只要符合该内参基因的扩增片段不被所述内切酶酶切即可。另外，所述待测生物材料具体选自：转基因植物材料、转基因动物材料、转基因微生物材料、普通植物材料、普通动物材料、普通微生物材料。上述普通植物材料、普通动物材料、普通微生物材料是相对于转基因植物、动物、微生物而言，其生物材料本身并未经过任何转基因操作，和/或，其基因组dna并未插入、剪切、连接任何转基因序列片段。另一些实施例中，所述目标序列选自dna序列；所述dna序列又可以选自：启动子序列、终止子序列、内含子序列、外显子序列。第2组实施例基于第1组实施例所提供的甲基化率的通用测定方法，本组实施例提供了一种用于测定转基因植物中camv35s启动子序列甲基化率的方法。本组所有的实施例中，所述方法都具有如下共同特征：采用第1组实施例所提供的方法，用内切酶酶切处理待测转基因植物的基因组dna，并camv35s启动子序列的特异性引物对酶切后的待测转基因植物的基因组dna进行荧光定量pcr，获得酶切后的待测转基因植物的camv35s启动子序列的ct值：ctm35s；用所述camv35s启动子序列的特异性引物对未经酶切的待测转基因植物的基因组dna进行荧光定量pcr获得对照处理的所述转基因植物camv35s启动子的ct值：ctk35s；计算待测转基因植物的camv35s启动子序列甲基化率：m35s；m35s＝2-δctm；其中，δctm＝ctm35s-ctk35s。本组实施例提供的这种测定转基因植物中camv35s启动子序列甲基化率的方法，正是基于第1组实施例所提供的甲基化率通用测定方法具体引申得来。第1组实施例提供的甲基化率通用测定方法中所提及的待测生物材料在本组实施例中具体为所述转基因植物，而第1组实施例提及的目标序列在本组实施例中则具体指camv35s启动子序列。本领域技术人员可根据本发明的披露，还可拓展延伸至其他待测生物材料，比如普通植物材料、转基因/普通动物材料、转基因/普通微生物材料。目的序列可以是除camv35s启动子序列以外，可能存在甲基化现象的需要测定甲基化率的待测生物材料基因组dna中的其它序列。优选地，所述camv35s启动子特异性引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示；所述内切酶为hpych4iv内切酶。所述camv35s启动子特异性引物的设计过程与所述内切酶的筛选方法可具体参见实验例1记载的内容。本组实施例最优选的实施例检测转基因植物中camv35s启动子甲基化率的具体过程和操作步骤详见实验例2。第3组实施例本组实施例提供了一种用于测定转基因植物中camv35s启动子序列甲基化率的试剂盒。在本组实施例中，所述试剂盒都具有如下共同的特征：包括：hpych4iv内切酶，以及，序列如seqidno.1和seqidno.2所示的camv35s启动子特异性引物；所述hpych4iv内切酶用于酶切处理转基因植物中camv35s启动子序列；所述camv35s启动子特异性引物用于对酶切后的待测转基因植物基因组dna，和，未经酶切的待测转基因植物基因组dna分别进行荧光定量pcr扩增，进而分别获得酶切后的待测转基因植物中camv35s启动子序列的ct值：ctm35s，以及，对照处理的转基因植物camv35s启动子的ct值：ctk35s；所述camv35s启动子序列甲基化率m35s＝2-δctm；其中，δctm＝ctm35s-ctk35s。进一步地，所述的试剂盒还包括：用于扩增所述转基因植物内参基因的特异性引物；所述内参基因特异性引物的扩增片段区域不包含hpych4iv内切酶的酶切位点序列；所述内参基因的特异性引物用于对酶切后的待测转基因植物基因组dna，和，未经酶切的待测基因植物的基因组dna，分别进行荧光定量pcr扩增，进而分别得到酶切处理的内参基因的ct值：ctmnc，和对照处理的内参基因的ct值：ctknc；所述待测转基因植物的camv35s启动子序列甲基化率：m35s＝2-δδct；其中，δδct＝δctm-δctk；δctk＝ctmnc-ctknc。第4组实施例本组实施例还请求保护所述试剂盒在测定转基因植物camv35s启动子序列甲基化率方面的用途。本组实施例的共同特点是：所述用途包括：在标有转基因植物camv35s启动子序列甲基化率测定用途的商品包装盒内装有hpych4iv内切酶和，如seqidno.1和seqidno.2所示序列的camv35s启动子特异性引物；和/或，将所述camv35s启动子特异性引物和hpych4iv内切酶用于转基因植物camv35s启动子序列甲基化率的商业检测。任何规模的出于商业目的地将上述引物和内切酶用来测定转基因植物camv35s启动子序列甲基化的行为均落入本发明的保护范围。第5组实施例本组实施例还提供一种定量检测转基因棉花中camv35s启动子序列甲基化率的方法，其特征在于，采用所述方法，和/或，所述试剂盒，用其中的所述camv35s启动子特异性引物对酶切后的待测转基因植物基因组dna，和，未经酶切的待测转基因植物基因组dna分别进行荧光定量pcr扩增，进而分别获得酶切后的待测转基因植物中camv35s启动子序列的ct值：ctm35s，以及，对照处理的转基因植物camv35s启动子的ct值：ctk35s；计算所述camv35s启动子序列甲基化率m35s＝2-δctm；其中，δctm＝ctm35s-ctk35s。进一步地，所述方法还包括：采用内参基因校准；内参基因选用棉花内参基因acp1基因；所述acp1基因荧光定量pcr扩增反应所采用的引物、探针、pcr反应体系和程序按照国家标准《农业部1943号公告-1-2013》中所记载的进行；采用所述内参基因acp1基因的特异性引物分别对所述内切酶酶切后的待测转基因棉花材料的基因组dna，和未经所述内切酶酶切的待测转基因棉花材料的基因组dna，分别进行荧光定量pcr扩增，分别得到酶切处理的内参基因的ct值：ctmacp，和对照处理的内参基因的ct值：ctkacp；所述待测转基因植物的camv35s启动子序列甲基化率：m35s＝2-δδct；其中，δδct＝δctm-δctk；δctk＝ctmacp-ctkacp。本组实施例的具体操作步骤如实验例2所示。实验例1、内切酶的筛选和引物设计通过对neb(newenglandbiolabs)公司商业化的近300种限制性内切酶进行筛选分析，其中对cpg甲基化敏感的内切酶有58种。它们的dna识别序列和切割位点各不同。进一步地分析这58种内切酶在camv35s启动子上的分布，发现内切酶hpych4iv分布在camv35s启动子序列的中间区域，识别位点为acgt，3个识别位点紧邻，非常适合在两端设计引物进行pcr定量扩增(见附图1)。在确定camv35s启动子内切酶切割区域后，在其区域上下游分别设计引物，以期建立定量pcr检测方法。经过优选的引物为：35s-mf：5‘-agatgcctctgccgacagtg-3’，(seqidno.1)35s-mr：5‘-gaaggatagtgggattgtgc-3’，(seqidno.2)扩增片段长度为153bp(seqidno.3)。另外本发明还需采用棉花内标准基因定量pcr来检测dna的总体用量，经分析，国家标准《农业部1943号公告-1-2013》中所记载的棉花内标准基因acp1基因的扩增片段区域内没有hpych4iv酶切位点，可以满足本发明对内标准基因的要求，因此直接采用国家标准的方法。实验例2、转基因棉花中camv35s启动子序列甲基化的测定实验方法和过程1样品前处理取mon757转化体的蛋白表达量高和低种子(分别命名为a和b)，单粒研磨。2棉花基因组dna提取依照植物dna提取试剂盒的操作手册，进行棉花种子总dna的提取。取5μl提取的dna溶液，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取dna的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的dna的浓度和纯度。用超纯水将dna稀释到50ng/μl。3基因组dna的酶切处理样品dna进行分别进行酶切处理和对照处理，酶切处理为采用内切酶hpych4iv酶切样品dna，对照处理为除内切酶用超纯水替代外其余与酶切处理相同，具体体系如下：组分酶切处理对照处理10倍酶切缓冲液2μl2μl基因组dna10μl10μlhpych4iv内切酶1μl0μl超纯水7μl8μl总体积20μl20μl酶切反应条件：37℃反应2小时，65℃失活处理20分钟，处理结束后，加入80μl超纯水进行稀释。4camv35s启动子定量pcr扩增camv35s启动子的定量pcr反应体系：sybrpremixextaqtm10μl，上下游引物(10μmol/l)各1.0μl，50×rox0.4μl，dna模板2μl，补超纯水至总体积20μl。使用abiprism7500荧光定量pcr仪(美国)扩增，反应程序：95℃预变性2min，95℃变性5s，60℃退火和延伸34s，扩增反应进行40个循环。pcr扩增荧光信号在60℃收集。设置荧光基线，获得各分析样品camv35s启动子的ct值。5acp1基因定量pcr扩增以国家标准《农业部1943号公告-1-2013》中公开的acp1基因的引物，探针，pcr程序和体系,进行操作，获得各分析样品acp1基因的ct值。6camv35s启动子甲基化率的计算(1)将a和b样品的相同处理和相同参数的不同平行测试的ct进行平均，获得平均值；(2)δct值的计算：δctm＝ctm35s–ctmacpδctk＝ctk35s–ctkacp其中ctm35s表示酶切处理的camv35s启动子的ct值，ctmacp表示酶切处理的acp1基因的ct值，ctk35s表示对照处理的camv35s启动子的ct值，ctkacp表示对照处理的acp1基因的ct值。(3)δδct值的计算：δδct＝δctm-δctk(4)camv35s启动子甲基化率的计算：m35s＝2-δδct计算结果表明，a样品(mon757转化体蛋白表达量高)的camv35s启动子甲基化率为49.71％，b样品(mon757转化体蛋白表达量低)的camv35s启动子甲基化率为99.89％。此外，本实验例还进行了本发明的方法测定camv35s启动子序列甲基化率的准确性验证，即，针对同一批样品来源，分别采用本领域常规的dna甲基化分析方法(包括采用亚硫酸盐处理基因组dna，再通过pcr扩增目的区域，克隆测序等步骤)，以及本发明的方法，测定camv35s启动子序列甲基化率，所得到的结果，本发明的方法与本领域常规方法在甲基化率的计算结果上高度一致，说明本发明的camv35s启动子序列甲基化率测定方法准确度高。鉴于篇幅考虑，此部分的实验过程和数据不再一一赘述。sequencelisting<110>中国农业科学院植物保护研究所<120>用于测定转基因植物中camv35s启动子甲基化率的方法及试剂盒<130>p170319/zwb<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>camv35s启动子特异性引物35s-mf<400>1agatgcctctgccgacagtg20<210>2<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>camv35s启动子特异性引物35s-mr<400>2gaaggatagtgggattgtgc20<210>3<211>153<212>dna<213>artificialsequence<220><223>camv35s启动子扩增序列<400>3agatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtgga60aaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactga120cgtaagggatgacgcacaatcccactatccttc153当前第1页12