本发明属于植物种质资源的分类鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定区分龙眼属及其近缘属植物的分子标记及方法。
背景技术
无患子科植物约150属2000种（罗献瑞等，1985），不少种类具有材用、食用、药用和能源供应等重要经济价值。一直以来，植物分类学家对无患子科的界定范围、科内分类群系统位置的处理存在分歧，例如科下分类存在2个亚科（juddsetal.,1994）、4个亚科（umadeviietal.,1991）、不同的4个亚科（harringtonmgetal.,2005）以及5个亚科（thornerfetal.,2000）等数个观点。这些分类观点的依据大多为形态学、孢粉学、化石记录及化学成分，对分类者的经验要求高，且易受环境因素影响。dna分子标记是dna水平遗传变异的直接反映，可靠性高、信息量大、检测迅速，已在植物分类及系统进化研究中广泛应用，然而无患子科植物的分子标记研究仍相对薄弱；选择适合无患子科植物分类研究的分子标记并建立准确有效的鉴定区分方法具有重要的理论意义和应用价值。
ssr标记根据其来源可分为基因组ssr（gssr）和表达序列标签ssr（est-ssr或genicssr），具有高度重复、带型简单和共显性遗传等优点；其中est-ssr标记因来源于相对保守的转录区域，具有较好的属内种间及属间通用性（decroocqetal.,2003；vendraminetal.,2007），可作为物种鉴定区分及系统发育研究的重要分子标记。目前无患子科内植物仅在荔枝属（傅嘉欣，2010；孙清明等，2011）、龙眼属（洪仕南，2015；郭栋梁，2018）和文冠果属（刘玉林等，2017）等少数几个属上见有ssr标记开发的报道。迄今为止，未见利用龙眼ssr标记鉴定区分龙眼属及其近缘属植物的文献报道和专利申请。
技术实现要素：
为准确、有效地鉴定区分龙眼属及其近缘属植物，本发明利用龙眼est-ssr标记提供一种鉴定区分龙眼属及其近缘属植物的分子标记及方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
龙眼est-ssr引物设计：基于龙眼新品种“香脆”果实不同发育阶段的est序列数据，应用misa软件检索ssr位点，利用primerpremier5.0软件批量设计est-ssr引物，并随机合成不同重复类型的est-ssr引物，进行pcr有效性验证和多态性分析。
通用性est-ssr引物筛选：选择龙眼多态性est-ssr引物，分析其在无患子属、韶子属、荔枝属和龙荔属上的通用性，从中挑选出带型清晰、多态性优的通用性est-ssr引物9对，即lyp1-42、lyp2-8、lyp2-11、lyp2-23、lyp3-22、lyp4-3、lyp4-19、lyp4-22、lyp5-8。
用于鉴定区分龙眼属及其近缘属属间材料的9对通用性est-ssr引物如表1所示。
表1通用性est-ssr引物序列
一种鉴定区分龙眼属及其近缘属植物的方法，包括如下步骤：
（1）基因组dna提取：提取无患子科(sapindaceae)中龙眼属、无患子属、韶子属、荔枝属和龙荔属共5个属种质材料的基因组dna；
（2）pcr扩增：以基因组dna为模板，使用上述lyp1-42、lyp2-8、lyp2-11、lyp2-23、lyp3-22、lyp4-3、lyp4-19、lyp4-22、lyp5-8共9对通用性est-ssr引物进行pcr扩增；
（3）凝胶电泳：对扩增的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
（4）数据统计：读取图谱条带，建立0/1数据矩阵，计算遗传相似系数，进行聚类分析。
一种鉴定区分龙眼属及其近缘属的方法，包括如下具体步骤：
（1）基因组dna提取：采用改良ctab法提取无患子科(sapindaceae)中龙眼属、无患子属、韶子属、荔枝属和龙荔属共5个属种质材料的基因组dna。采用1wt%的琼脂糖电泳和微量紫外分光光度计检测所提取基因组dna的质量和浓度。稀释dna浓度至25ng/μl，-20℃保存备用。
（2）pcr扩增：以5个属种质材料的基因组dna为模板，使用上述9对est-ssr引物进行pcr扩增。
pcr反应体系：pcrmastermix5μl，10μmol/l正、反向est-ssr引物各0.5μl，模板dna2μl，ddh2o2μl，总体积10μl。
pcr扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性45s，53/55℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。lyp1-42、lyp3-22退火温度53℃，lyp2-8、lyp2-11、lyp2-23、lyp4-3、lyp4-19、lyp4-22、lyp5-8退火温度55℃。
（3）凝胶电泳：pcr扩增产物在6wt%聚丙烯酰胺凝胶上恒压电泳（120v，90~120min），用genegreen核酸染料染色15min，最后在凝胶成像系统上拍照记录。对于条带模糊的植株样本，进行pcr及电泳的3次重复验证。
（4）数据统计：对est-ssr图谱中扩增清晰且易于辨认的条带进行统计，在相同的迁移位置上有带标记为1，无带标记为0，建立0/1数据矩阵；计算dice遗传相似系数，upgma（unweightedpairgroupmethodusingarithmeticaverages）方法聚类。根据遗传距离和聚类分析的结果鉴定区分龙眼属及其近缘属植物。
本发明的优点和有益效果在于：
1．开发无患子科内龙眼属、荔枝属、龙荔属、韶子属和无患子属共5个属的通用性est-ssr引物，弥补了无患子科内通用性ssr标记的匮乏，为该科植物的分类研究提供有效标记；
2．本发明提供的est-ssr标记能够准确有效地区分龙眼属及其4个近缘属植物，具有高度重复、带型整洁、操作简单等优点，克服了形态学、孢粉学等传统鉴定方法的经验要求高和环境影响大的问题。
附图说明
图1：通用引物lyp1-42对55份无患子科种质材料的扩增结果；m:marker；1-55：不同材料对应的编号，同表2。
图2：通用引物lyp2-8对55份无患子科种质材料的扩增结果；m:marker；1-55：不同材料对应的编号，同表2。
图3：通用引物lyp2-11对55份无患子科种质材料的扩增结果；m:marker；1-55：不同材料对应的编号，同表2。
图4：通用引物lyp2-23对55份无患子科种质材料的扩增结果；m:marker；1-55：不同材料对应的编号，同表2。
图5：通用引物lyp3-22对55份无患子科种质材料的扩增结果；m：marker；1-55：不同材料对应的编号，同表2。
图6；通用引物lyp4-3对55份无患子科种质材料的扩增结果；m：marker；1-55：不同材料对应的编号，同表2。
图7：通用引物lyp4-19对55份无患子科种质材料的扩增结果；m：marker；1-55：不同材料对应的编号，同表2。
图8：通用引物lyp4-22对55份无患子科种质材料的扩增结果；m：marker；1-55：不同材料对应的编号，同表2。
图9：通用引物lyp5-8对55份无患子科种质材料的扩增结果；m：marker；1-55：不同材料对应的编号，同表2。
图10：55份无患子科种质材料的est-ssr聚类图。
具体实施方式
为了充分公开本发明，以下结合实施例加以说明，但本发明不仅限于此。
实施例1
鉴定区分龙眼属及其近缘属植物的分子标记及方法，以无患子科(sapindaceae)中龙眼属、无患子属、韶子属、荔枝属和龙荔属共5个属的植物为例。
1．试验材料
研究采用的无患子科(sapindaceae)种质资源材料共55份，其中龙眼属龙眼24份，无患子属无患子13份，韶子属红毛丹2份，荔枝属荔枝8份，龙荔属龙荔8份，如表2。龙眼和龙荔种质材料采自国家果树种质福州龙眼圃，荔枝种质材料采自福建省农业科学院果树研究所育种园，无患子种质材料采自福州市晋安区新店镇杨延路无患子绿化树（选取叶片表型差异明显的不同单株），红毛丹种质材料来自海南省保亭县。
表2供试55份无患子科种质资源的基本情况
2．试验方法
龙眼est-ssr引物设计：基于龙眼新品种“香脆”果实不同发育阶段的est序列数据，应用misa软件从13934条龙眼unigene中搜索到ssr位点6683个，利用primerpremier5.0软件设计出4670对est-ssr引物；随机合成185对不同重复类型的est-ssr引物进行有效性验证和多态性分析，有效扩增率为78.92%（146对），其中多态性引物占34.25%（50对）。
通用性est-ssr引物筛选：选择上述龙眼多态性est-ssr引物，在无患子11号、无患子8号、红毛丹1号、红毛丹2号、观音绿、凤山红灯笼、龙荔1号、龙荔6号等8份近缘属材料上进行通用性鉴定，筛选出条带清晰、多态性优的属间通用性引物9对；9对通用性est-ssr引物的序列如表3所示；9对通用性est-ssr引物的扩增结果如表4所示。
表3通用性est-ssr引物序列
表49对通用性est-ssr引物的扩增结果
一种鉴定区分龙眼属及其近缘属植物的方法，具体步骤如下：
（1）基因组dna提取：采集每份种质的新鲜嫩叶，采用改良ctab法提取基因组dna。dna质量和浓度的检测采用1wt%的琼脂糖电泳和微量紫外分光光度计（genequant，eppendorf）。稀释dna浓度至25ng/μl，–20℃保存备用。
（2）pcr扩增：以提取的5个属种质材料的基因组dna为模板，使用9对est-ssr引物进行pcr扩增。
pcr反应体系：pcrmastermix5μl，10μmol/l正、反向est-ssr引物各0.5μl，模板dna2μl，ddh2o2μl，总体积10μl。
pcr扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性45s，53/55℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。引物lyp1-42、lyp3-22退火温度53℃，lyp2-8、lyp2-11、lyp2-23、lyp4-3、lyp4-19、lyp4-22、lyp5-8退火温度55℃。
（4）凝胶电泳：在6wt%聚丙烯酰胺凝胶上恒压电泳（120v，90~120min），用genegreen核酸染料（北京天根生化科技有限公司）染色15min，最后在凝胶成像系统上拍照记录。对于条带模糊的植株样本，进行pcr及电泳的3次重复验证。9对通用性引物对55份无患子科材料的扩增结果如图1-图9所示。
（5）数据统计：对ssr图谱中扩增清晰且易于辨认的条带进行统计，在相同的迁移位置上有带标记为1，无带标记为0，建立0/1数据矩阵。多态率p（%）=（k/n）×100，其中k是多态性条带数，n为条带总数。采用ntsys-pc2.10e软件计算dice遗传相似系数，按upgma（unweightedpairgroupmethodusingarithmeticaverages）方法进行聚类分析。
3．结果分析
upgma聚类分析显示，55份材料在遗传相似系数0.561处可划分为韶子属、无患子属、荔枝属、龙眼属和龙荔属5个大类，支持龙荔独立成属，如图10所示。
sequencelisting
<110>福建省农业科学院果树研究所
<120>一种鉴定区分龙眼属及其近缘属植物的分子标记及方法
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