一种通用长片段染色体步移的方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通用长片段染色体步移的方法。

背景技术：

染色体步移(chromosomewalking)是一种常用的分子生物学技术，使用这种技术可以分离已知序列dna片段上下游的未知序列。在非模式物种的基因组研究中，常用染色体步移的方法来获取目的基因的全长序列，比如在缺少某物种全基因组序列信息时，可以根据其它亲缘关系比较近的物种中目的基因的同源基因序列，寻找一段序列保守的区域设计一条目的基因特异引物，利用染色体步移来扩增目的基因的全部序列。

目前，市场上有四家公司提供染色体步移的kit，分别是美国clontech公司(clontechlaboratories,inc,www.clontech.com)的genomewalker^tmuniversalkit(catalogno.638904)；韩国seegene公司(seegene,www.biogene.com)的dnawalkingspeedup^tmkit(catalogno.dwsk-v101)；美国invitrogen公司(lifetechnologies,www.invitrogen.com)的walkerkit(catalogno.k8000-01)；北京庄盟国际生物基因科技有限公司(beijingzomanbiotechnologyco.,ltd,www.zomanbio.com)的模板锁定染色体步移试剂盒(kxgenomewalkingkit,catalogno.zt601-1)。这些kit利用了不同的原理。genomewalker^tmuniversalkit利用的是adaptorligationpcr的原理，具体而言，是利用限制性内切酶酶切基因组dna，然后再连接可以与酶切产生的粘性末端序列退火的dna接头，接下来用dna接头上的引物和目的基因特异引物配对，来进行染色体步移。dnawalkingspeedup^tmkit则是利用了序列独特的acp(annealingcontrolprimer)引物与目的基因特异引物配对，来扩增目的基因片段。acp引物由三部分组成，5’端为一段长度约25bp的非目标区域通用序列(non-targetuniversalsequence)，3’端为长度约为6-10bp(根据其kit的说明书和相关的文献推测)的目标区域核心序列(targetcoresequence)，介于二者之间的是调和子(regulator)序列，由5个多聚脱氧次黄苷(di)组成，脱氧次黄苷与dna序列中的四种脱氧核苷酸a、t、c、g都可以配对，在分子生物学实验中常用来替代简并引物中的高简并位点，可大幅度降低简并程度，显著提高扩增产物的特异性及扩增效率。walkerkit则利用了技术将linker连接到经过限制性内切酶酶切、去磷酸化、目的基因特异引物单链延伸后形成的dna分子上，以此为pcr模板，用目的基因特异引物和linker上的引物扩增目的基因片段。而kxgenomewalkingkit利用的是tail-pcr(thermalasymmetricinterlacedpcr，即热不对称交错式pcr)的原理，根据目的基因dna序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异引物，与试剂盒中提供的九种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物进行热不对称交错式pcr反应，该反应程序的设计使之可以有利于目标基因的扩增，而抑制兼并引物引发的非特异扩增，从而达到扩增目标基因片段的目的。除了上述四种商业化的kit外，反向pcr(inversepcr)也是一种常用的染色体步移的方法，其实验原理是将已知序列酶切，然后环化，根据已知序列设计正向和反向引物，扩增目的基因片段。

这四家公司提供染色体步移的kit和反向pcr存在以下缺陷，使其进行长片段染色体步移时效率低下，甚至不能进行长片段染色体步移。第一，clonetech的genomewalker^tmuniversalkit和invitrogen的walkerkit以及反向pcr，进行染色体步移时能够扩增出来的dna长度是由所用的限制性内切酶的酶切位点与目的基因上特异引物的之间的距离决定的，由于序列未知，因此这段距离具有很大的偶然性，为了得到合适的pcr片段，往往需要测试不同的酶和dna接头。例如，genomewalker^tmuniversalkit中提供了四种不同的限制性内切酶和相应dna接头；walkerkit也推荐了多种可以产生3′粘性末端的限制性内切酶。第二，seegene的dnawalkingspeedup^tmkit和庄盟的kxgenomewalkingkit利用的是引物或兼并引物，这些特殊引物在基因组上的退火也具有偶然性，不能控制pcr产物的长度，dnawalkingspeedup^tmkit中提供了4种不同的引物供测试；kxgenomewalkingkit中也提供了9种不同的简并引物供测试。第三，这些kit提供的方法，实验操作复杂，效率低下，为了提高实验成功率，需要对一份样品进行多个限制性内切酶或引物的测试。第四，这些kit提供的方法，一次只能对一个目的基因进行染色体步移，缺乏通用性，当需要对多个目的基因进行染色体步移时，需要重新制备pcr模板。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种通用长片段染色体步移的方法universallong-stepsgenomewalking(uls-gw)。不仅可以对目的基因进行长片段染色体步移，而且制备的pcr模板库可以同时用于多个目的基因的染色体步移，在对多个基因(如基因家族)进行研究时，可以提高效率。

一种通用长片段染色体步移的方法，包括如下步骤：

(1)利用tn5转座酶复合体将基因组dna随机打断，且在dna断点处加上uls-gw接头，uls-gw接头由两条退火在一起的dna单链组成，作为后续pcr反应的引物结合位点；

(2)纯化转座酶打断后的dna产物，检测片段大小，然后将纯化产物进行片段分选；

(3)选择7-9kb左右的片段，利用目的基因特异引物和位于uls-gw接头上的引物gw1配对，扩增目的基因片段；

(4)对第一轮pcr产物再次进行片段分选，选择7-9kb的片段；

(5)以分选得到的7-9kb的pcr产物为模板，利用目的基因特异引物和位于uls-gw接头上的引物进行第二轮巢式pcr扩增；经过两轮pcr扩增，已知序列dna片段的上下游的未知序列能够被扩增出来，后续可用ta克隆的方法将目的片段克隆进载体，进行sanger测序，得到完整的未知序列的信息。

步骤(1)通过调整tn5转座酶复合体和基因组dna的比例，以及反应buffer的成分，将打断的dna的长度控制在峰值为8kb左右，弥散分布于4-12kb。

所述引物gw1的核苷酸序列如序列表seqidno：1所示。

所述目的基因特异引物为target_l1与target_l2；所述target_l1的核苷酸序列如序列表seqidno：2所示；所述target_l2的核苷酸序列如序列表seqidno：3所示。

目前tn5转座酶一般用于新一代测序(nextgenerationsequence)小片段文库的构建(nexteradnalibrarypreparationkit,catalogno.fc-121/1030/1031)和大片段文库构建(nexteramatepairsamplepreparationkit,catalogno.fc-132-1001)，其中，构建小片段文库时，tn5转座酶可以将dna打断成200-1000bp长的片段；而构建大片段文库时，通过控制所用的酶的量和转座酶反应buffer，可以将dna打断成2-15kb的长度。此外，二者所用的接头序列不一样，nexteradnalibrarypreparationkit中的接头连接到dna上以后，可以进行pcr扩增；而nexteramatepairsamplepreparationkit中的接头连接到dna上以后，不能进行pcr扩增。本发明的方法将这两者相结合，使用来源于nexteradnalibrarypreparationkit中转座酶，配合nexteramatepairsamplepreparationkit中的转座酶反应buffer，优化酶与dna的比例，使之可以将打断的dna的长度控制在峰值为8kb左右，弥散分布于4-12kb，而且接头连接上以后可以进行pcr扩增，用于开发一种新的染色体步移技术，使长片段染色体步移变得简单、易行。

和限制性内切酶切割dna不同，tn5转座酶是随机打断dna，因此，当dna被打断成8kb左右的片段时，可以保证目的基因特异引物上游8kb左右的各个长度都有转座酶的打断位点，通过对片段进行两次分选，可以保证长片段染色体步移的成功率。

tn5转座酶是随机打断dna，因此，打断的dna进行片段分选后，得到的8kb左右的片段，可以作为模板来进行任意基因的长片段染色体步移，具有通用性。

本发明的有益效果：本发明的方法利用转座酶tn5复合体通过一步反应在打断dna的同时，在其两端断点处上加上dna接头，操作简单，连接高效；一次制备的打断产物，可作为模板库进行任意基因的长片段染色体步移，通用快捷。可根据需要，选择较长分选模板进行pcr扩增，能获得更长的侧翼序列，且可以同时从已知序列dna片段的两端同时设计引物，分离上下游的侧翼序列，获得更长的序列。

附图说明

图1为本发明的方法原理示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

下述本发明的实例中所用的tn5转座酶复合体来自nexteradnalibrarypreparationkit(illumina,catalogno.fc-121/1030/1031)中的成分。反应所用的buffer则是nexteramatepairsamplepreparationkit(catalogno.fc-132-1001)中的tagmentbuffer。

本发明方法的原理如图1所示。

实施例1利用uls-gw技术分离水稻gapdh片段左端大约8kb的序列

1.1转座酶复合体打断水稻基因组并在dna片段断点处连接uls-gw接头

按表1成分在灭菌pcr管中配置反应体系：

表1.转座酶复合体反应体系

然后将pcr管置于pcr仪中，进行表2设置的反应程序：

表2.转座酶复合体反应程序

1.2利用柱式纯化试剂盒对转座酶复合体打断后的产物进行纯化

反应结束后，立即纯化，产物纯化所用的kit为cycle-purekit(omega，货号：d6492-01/02)，向打断后的产物中加入5倍体积的buffercp，混合充分，将混合液加入收集管中，12000rpm离心2min，然后加入700ul的dnawashbuffer洗两遍，最后空离2min并晾干，将收集管放入新的ep管中，加水分两次洗脱，洗脱体积为30ul，取2ul用3.0荧光计进行浓度测定。具体纯化步骤及浓度测定方法参见相关protocol。

1.3利用sageelf对纯化后的产物进行片段选择

对打断回收后的产物进行分选，通过sagescience公司的sageelf回收仪(sagescience，货号：elf0001)来实现，将回收后的28ul样品与3ul的6×loadingbuffer混合处理，然后将混合液按照说明书要求，加入到sageelf0.75％的琼脂糖凝胶回收胶盒(sagescience，货号：eld7510)中，并使用如下设置的程序来回收不同大小的片段：分离时间(separationtime)：2h。电泳结束后，每个片段(well)取1ul进行浓度测定，并用agilentalilenthighsensitivitydnakit(alilent，货号：5067-4626)与2100bioanlyzer(alilent，货号：g2939a)检测每一个片段的大小。

1.4利用半巢式pcr特异性扩增gapdh片段左端的侧翼序列

本发明中用到的gapdh基因(seqidno：4)，pcr扩增所需引物序列及引物结合位置信息如下：

表3.pcr扩增gapdh左右两端侧翼序列所需引物序列及引物结合位置信息

选择回收后大小约7-9kb的片段为模板，按表4、表5成分在灭菌的pcr管中配置两轮pcr反应体系并在pcr仪中运行表6设置的反应程序，扩增gapdh片段的左右两端的侧翼序列。

表4.第一轮pcr反应体系

表5.第二轮pcr反应体系

注：template1为第一轮pcr的反应产物，经磁珠法纯化后的产物(具体方法见1.5)。

表6.第一轮与第二轮pcr的反应程序

1.5利用磁珠法纯化半巢式pcr扩增后的产物

反应完成后，将第二轮的pcr的反应终产物，用vazyme公司vahts^tmdnacleanbeads(vazyme，货号：n411-01/02/03)进行纯化，采用1.8×beads纯化，即25μl打断产物中加入45μl磁珠，洗脱体积为30μl，取2μl用3.0荧光计进行浓度测定。具体纯化步骤及浓度测定方法参见相应protocol。

1.6对纯化后的pcr产物进行末端加“a”反应

在灭菌的pcr管中配置如表7的pcr产物末端加“a”体系：

表7.pcr产物末端加“a”反应体系

然后并将pcr管置于pcr仪中，运行如下表的反应程序：

表8.pcr产物末端加“a”反应程序

反应结束后，将反应产物补水至50μl，再次用1.8×beads纯化，回溶20ul的无菌水，纯化步骤与浓度测定方法见实例1.5。

1.7末端加“a”后的pcr产物与t载体连接及连接产物转化

在灭菌的pcr管中配置下表片段与pmd19-t载体的连接反应体系，并将反应管置于pcr仪中，运行如下反应程序：16℃连接过夜。

表9.片段与pmd19-t载体连接体系

注：目的片段与t载体之间摩尔比介于3：1～10：1之间

反应完成后，将连接体系加入到大肠杆菌的dh5α感受态细胞(vazyme，货号：c502)中，复苏后的菌液涂布到含蓝白斑(iptg，生工，货号：b541006,50mg/ml；x-gal，上海生工，货号：b541007，20mg/ml)筛选及氨苄霉素(上海生工，货号：b540722,10mg/ml)的lb培养皿中，待菌液在超净台中被吹干后，于37℃培养箱中，倒置平板，过夜培养。

1.8菌落pcr验证阳性单克隆

取培养过夜的平板，以白色单菌落各23个为扩增模板，并以水稻基因组作为阳性对照，以距离target_l1引物上游8.5kb处均设计可扩增长约500bp的产物的正反引物，(见表10)，然后按表11成分在96孔板中配置反应体系并置于pcr仪中运行表12的反应程序，进行菌落pcr扩增。

表10.菌落pcr鉴定所需的引物

表11.菌落pcr反应体系

表12.菌落pcr反应程序

1.9利用琼脂糖凝胶电泳检测阳性克隆并对其进行sanger测序分析

取10个无菌的2ml的ep管中，加入1ml带氨苄霉素抗性的lb液体培养基，然后从鉴定的阳性菌落中挑取5个单克隆加入培养基，并置于37℃，140rpm摇床上培养3-4h，送至生物公司，以m13f与m13r为测序引物进行sanger测序。然后将每个阳性单克隆测序得到的结果，分别与水稻的参考基因组进行blastn比对，找到插入的片段在参考基因组上对应的位置，经过计算即可得到插入片段的具体大小。

通过本发明，我们分离到了gapdh片段左端的侧翼序列，且分离到侧翼序列距离特异引物的距离达到了8.5kb以上，这对获得非模式物种的完整的基因具有重要的意义。

序列表

<110>中国农业科学院深圳农业基因组研究所

<120>一种通用长片段染色体步移的方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>14

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

caaaccctcaacaataccaaacctg25

<210>4

<211>18000

<212>dna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>4

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