本发明涉及一种鸡传染性法氏囊病病毒的全悬浮培养方法，特别涉及一种用传代细胞系全悬浮培养鸡传染性法氏囊病病毒的方法，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术：
鸡传染性法氏囊病(infectiousbursaldisease，ibd)是一种由鸡传染性法氏囊病病毒(infectiousbursaldiseasevirus，ibdv)感染引起的鸡急性、高度接触性传染病，是我国规定要严格防控的ii类动物疫病。ibdv主要侵害雏鸡体液免疫器官法氏囊，损伤淋巴细胞，从而导致鸡的免疫机能障碍，进而增加对其他病原的易感性，甚至造成对其他疫苗的免疫应答能力下降。感染ibdv后，雏鸡群在短时间内大量死亡或鸡群产肉、产蛋等生产性能大幅度下降，带来直接经济损失。由于ibdv超强毒株的出现及环境因素、免疫程序等诸多因素的影响，鸡ibd在我国发病情况呈现新趋势：流行面积日益扩大、发病鸡群日龄变宽、伴随严重继发感染和并发症等。鸡ibd疫情不容忽视，防控工作应有效开展。
除了严格的环境卫生制度外，疫苗的使用仍然是目前鸡ibd的主要防控手段，生产中应用最广泛的ibdv疫苗种类是灭活疫苗和弱毒疫苗。接种鸡胚后收获尿囊液是上述两类疫苗的传统生产方式，现也有使用鸡胚成纤维细胞(cef)生产弱毒疫苗，但无论是使用鸡胚或是cef，都存在spf鸡胚消耗大、单位材料生产力低、生产周期长、总体生产成本高等天然问题。传统生产工艺的缺陷对ibdv疫苗的应用产生了一定的限制，不符合现阶段养禽业疫病防控、健康发展的需求，因此，迫切需要一种低成本、大规模、高效的ibdv疫苗生产方式适应行业的生产。
细胞悬浮培养技术是指细胞在生物反应器中自由悬浮于培养基内生长增殖的一种培养方法，细胞能达到较高密度，可用于多种产品生产。该方法是当前国际上生物制品生产的主流模式，最大优势是通过精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。随着我国畜牧产业集约化程度提高和养殖规模的扩大，兼具低成本、高质量的疫苗必然顺应时代的需求，利用细胞悬浮培养技术进行疫苗生产是我国兽用生物制品行业发展的必然趋势。使用mdck细胞(犬肾细胞)全悬浮培养禽流感病毒、使用bhk-21细胞(乳仓鼠肾细胞)全悬浮培养口蹄疫病毒等均已在生产中得到验证，但关于ibdv的全悬浮培养方法国内未见报道，生产方式仍有很大的优化空间。鸭胚细胞衍生的传代细胞系可实现无血清全悬浮培养，比普通细胞悬浮培养技术更进一步实现产品质量可控。本发明选择使用鸭胚细胞衍生的传代细胞系，应用细胞全悬浮方式培养ibdv，在实现大规模生产的同时，保证了较高的病毒滴度，兼顾生产成本和产品质量，具有广阔的应用前景及蕴含良好的经济效益。
技术实现要素：
本发明提供了一种鸡传染性法氏囊病病毒的全悬浮培养方法，鉴于传统ibdv培养方法存在局限性，本发明的目的在于提供用全悬浮鸭胚细胞衍生的传代细胞系培养鸡传染性法氏囊病病毒的方法，从而为实现鸡传染性法氏囊病病毒疫苗的大规模生产提供参考。
本发明提供了一种鸡传染性法氏囊病病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：
步骤1：鸭胚细胞衍生的传代细胞的复苏与传代培养。
步骤2：采用二阶培养法，向全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞接种鸡传染性法氏囊病病毒，实现病毒大规模培养。
步骤3：接毒后，每隔12h取样测定病毒的tcid50，在病毒tcid50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的鸡传染性法氏囊病病毒。
进一步地，所述步骤2的二阶培养法操作方式如下，即全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞的密度培养生长至适于接毒时，进行鸡传染性法氏囊病病毒的接种，接毒完成后，将摇瓶放置于5％co2培养箱中，在低转速下吸附0.5h-2h；吸附完成后补加病毒培养基，并放回到5％co2培养箱中，调节合适转速，继续培养。
进一步地，本发明的全悬浮培养方法还包括步骤4：取步骤2所得培养后的传染性法氏囊病病毒作为下一代病毒传代培养的种毒，继续采用二阶培养法，将病毒接种至全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞中进行病毒的传代驯化与增殖，并按此方法连续传代2-30代，最终收获传染性法氏囊病病毒为鸭胚细胞衍生的传代细胞系的适应毒。
进一步地，步骤1所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞复苏与传代培养方法如下：
从液氮中迅速取出鸭胚细胞衍生的传代细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待细胞完全融化后，将复苏细胞加入约20倍体积的细胞培养基中，经离心机300g离心10min，倒掉上清液，使用细胞培养基将细胞吹打重悬均匀，细胞悬液接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养；每隔24h少量取样一次进行细胞计数，通过检查细胞密度和细胞活力等参数，监测细胞生长情况；培养约48-72h，达到一定细胞密度后，进行细胞传代；细胞经已连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代。
更进一步地，所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞培养温度为35℃-37℃，优选为37℃；培养转速为130rpm-150rpm，优选为150rpm。
更进一步地，当鸭胚细胞衍生的传代细胞密度达到6×106/ml-15×106/ml时，可用于传染性法氏囊病病毒的接种，优选的，细胞密度达到8×106/ml～10×106/ml时，用于接毒。
更进一步地，传染性法氏囊病病毒接毒量为0.001moi-1moi之间接种，优选的0.01moi。
更进一步地，所述的二阶培养法接毒，细胞接毒后吸附时间为0.5h-2h，培养温度为35℃-37℃，优选为37℃；培养转速为110rpm-140rpm，优选为110rpm。
更进一步地，病毒接种吸附完成后，需补加新的病毒生产培养基，补加比例为原工作培养基体积的1-3倍，优选为补加原工作体积2倍的生产培养基。
更进一步地，所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞培养基中含有10-100mg/l氨基酸、1-10mg/l维生素、100-500mg/l无机盐、1000-8000mg/l葡萄糖、0.01-1mg/l微量元素、0.1-10mg/l生长因子，其中氨基酸选自丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、色氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的一种或多种，所述维生素选自维生素c、生物素、叶酸、氯化胆碱、肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醇、吡哆醛、维生素b12、核黄素、盐酸硫胺素中的一种或多种，所述无机盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠中的一种或多种，所述微量元素选自硫酸锰、亚硒酸钠、硝酸铁中的一种或多种，所述生长因子选自胰岛素、egf、bfgf中的一种或多种。该培养基属于无血清、化学界定培养基。
进一步地，所述的传染性法氏囊病病毒为ibdv(gt株)，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。
本发明相对于现有技术具有如下有益效果：
1、传染性法氏囊病病毒传统培养方法仅有鸡胚和鸡胚成纤维细胞两种材料，未见有悬浮培养的报道，病毒培养或疫苗生产均有一定限制。本发明独创性的使用鸭胚细胞衍生的传代细胞系悬浮培养鸡传染性法氏囊病病毒，病毒适应性好，且滴度高，为鸡传染性法氏囊病病毒的培养提供了一种新的、更好的培养方法，丰富了鸡传染性法氏囊病病毒生产培养的途径；
2、本发明通过采用全悬浮传代细胞系鸭胚细胞衍生的传代细胞系进行传染性法氏囊病病毒培养，培养过程实现可控的无血清、全悬浮培养方式，相比传统的鸡胚和鸡胚成纤维细胞培养，大大提高了病毒培养规模和效率，符合未来疫苗生产的趋势，有广阔的应用前景及蕴含良好的经济效益；
3、采用本发明培养的传染性法氏囊病病毒，具有较高的病毒滴度，免疫原性好，且生产工艺简单，培养周期短，生产效率高，生产成本降低。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
实施例1-2所得传染性法氏囊病病毒的tcid50(半数组织培养感染剂量)检测方法如下：
使用10日龄spf鸡胚制备鸡胚成纤维细胞，加入到96孔板中，使用含10％fbs的dmem基作为培养基，放置于37℃、5％co2培养箱中，待单层细胞长满孔底后，培养基更换为含2％fbs的dmem；将收获的传染性法氏囊病病毒样品做离心处理后，吸取上清后用无菌dmem溶液做10倍系列稀释，稀释度从10-1至10-11，吸取100μl病毒液加入一个孔，每个稀释度做8个重复，留出8个孔作为空白对照；把96孔板放入37℃、5％co2培养箱，每天观察细胞病变情况，直至病变孔数不再增加，记录各个稀释度出现细胞病变孔的数量，使用reed-muench法计算tcid50。
实施例1：不同接毒量及培养时间对鸡传染性法氏囊病病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞中增殖的影响
本发明实施例1所用材料来源如下：
1.病毒：鸡传染性法氏囊病病毒为ibdv(gt株)，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。
2.细胞：全悬浮鸭胚细胞衍生的传代细胞，由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
3.培养基：名称为培养基eblm004，含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf。
本发明实施例1鸡传染性法氏囊病病毒的培养方法如下：
步骤1.从液氮罐中取出冻存的鸭胚细胞衍生的传代细胞，置于37℃水浴融化后加入到约20ml的培养基中，经离心机300g离心10min，去掉上清液，使用125ml三角摇瓶将细胞重悬于15ml的培养基中，将培养基置于37℃，5％co2培养箱中，轨道摇床转速设置为150rpm，进行悬浮培养，第一天补充培养基15ml，第二天再次补充培养基15ml，第三天进行细胞传代；
步骤2.对步骤1所得的鸭胚细胞衍生的传代细胞进行细胞密度计数，并接种至三角瓶中，接种密度为0.35×106cells/ml-0.75×106cells/ml，将三角瓶置于37℃，5％co2的培养箱中进行培养，设定轨道摇床转速为150rpm，继续培养2-3天后，重复此方法进行继续传代，对连续传代三代次后的细胞进行扩增，用于病毒接种实验；
步骤3.取用第3代扩增至第4代的种子细胞200ml，重复步骤2的操作，使细胞密度达到8.08×106/ml或以上；
步骤4.取步骤3中所得鸭胚细胞衍生的传代细胞系悬液80ml，平均分装至4个摇瓶，每瓶20ml，分别标记为实验组1、实验组2、实验组3、对照组；使用ibdv(gt株)按1moi，0.1moi，0.01moi，0.001moi分别接种实验组1～4，moi＝细胞密度×细胞液体积/tcid50，ibdv(gt株)原始毒价107.6tcid50/ml；病毒接种后，将摇瓶放置在37℃、5％的co2培养箱中，吸附培养1小时，调节摇床速度为110rpm；吸附完成后，向各组补加20ml的病毒培养基，并放回到37℃、5％co2培养箱中继续培养，轨道摇床转速为150rpm；在培养的第24、48、72、96小时分别收取样品，置于-80℃保存备用。
5.所有样品收获完成后，进行tcid50检测。
对实施例1取样检测tcid50，结果(表1)如下：
表1全悬浮培养ibdv(gt株)不同接毒量、不同培养时间的tcid50检测结果
从tcid50数据可以看出，ibdv(gt株)能在全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞系中增殖，增殖受到接毒量和培养时间的影响，在接毒量过低或者过高都不能达到最佳的培养效果，当接毒量为0.01moi时，所得到ibdv的tcid50滴度最高(104.6/ml)，因此后续的ibdv传代驯化按此比例进行病毒的接种。
实施例2：鸡传染性法氏囊病病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞系中的传代驯化
本发明实施2所用材料来源如下：
1.病毒：由上一代次收获的eid50最高时的ibdv作为种毒；
2.细胞：全悬浮鸭胚细胞衍生的传代细胞系，由甘肃健顺生物科技有限公司提供；
3.培养基：名称为培养基eblm004，含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf。
本发明实施例2传染性法氏囊病病毒的培养方法如下：
步骤1.对鸭胚细胞衍生的传代细胞进行传代及培养，传代方法与细胞培养条件同实施例1；其中，鸭胚细胞衍生的传代细胞接毒细胞代次限制为细胞工作库复苏后的3-30代之内；
步骤2.当步骤1中细胞生长至密度为8×106/ml～10×106/ml时，按接毒量为0.01moi进行ibdv的接种，接种的病毒来源为上一代培养96h的病毒，按此方法连续传代7代次；
步骤3.对收获的ibdv进行tcid50检测。
对实施例2所取样品的tcid50检测，结果(表2)如下：
表2不同代次全悬浮培养ibdv(gt株)tcid50检测结果
从数据可以看出，随着ibdv(gt株)在鸭胚细胞衍生的传代细胞中的连续传代驯化，ibdv能够很好的适应鸭胚细胞衍生的传代细胞，经检测，tcid50最高可达108.9/ml，且病毒的滴度稳定，相较于原种毒(cef贴壁培养)，在病毒滴度和单位生产成本方面均有优势。
实施例3：不同培养基悬浮培养鸭胚细胞衍生的传代细胞系生产ibdv比较
本发明实施例3所用材料来源如下：
1.病毒：ibdv(gt株)，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。
2.细胞：全悬浮鸭胚细胞衍生的传代细胞系
3.培养基：名称为培养基eblm004，含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf。
4.对比培养基ex-
本发明实施例4方法如下：
1.分别用两种培养基对鸭胚细胞衍生的传代细胞进行传代及培养，传代方法同实施例1；其中，鸭胚细胞衍生的传代细胞接毒细胞代次限制为细胞工作库复苏后的3-30代之内；
2.当步骤1中细胞生长至密度为8×106/ml～10×106/ml时，按接毒量为0.01moi进行ibdv的接种，接毒方法和病毒培养条件为各自优化的最佳条件，按此方法连续传代10代次。每次接毒后，每隔12h取样进行tcid50的检测，在tcid50最高时进行鸡传染性法氏囊病毒收集，选择p6-p10五代次收获的病毒比较两种培养基对鸡传染性法氏囊病毒培养的效果。
对实施例4取样检测tcid50，结果(表4)如下：
表4：两种培养基对ibdv(gt株)培养效果比较
从表中可以看出，ibdv(gt株)在两种培养基中都能够生长，但是采用eblm004培养基培养ibdv(gt株)的tcid50稳定在108.9/ml以上，相比于采用ex-
综上所述，本发明实施例通过以鸭胚细胞衍生的传代细胞系作为鸡传染性法氏囊病病毒的靶细胞，丰富了传染性法氏囊病病毒的培养方式，采用无血清、化学界定的培养基可实现鸡传染性法氏囊病病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞系中的全悬浮培养，大大提高了病毒培养规模和效率的同时也降低了生产成本，符合现代疫苗工业生产的需求。更重要的是，本发明实施例采用无血清全悬浮培养方案生产的病毒，培养基各组分清晰明了，有效降低获得病毒中杂蛋白含量，提升制成抗原质量，确保得到病毒的质量稳定可控。基于上述优点，应用本发明方法可以用效用于培养制备鸡传染性法氏囊病疫苗。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。