本发明涉及一种鸭肝炎病毒的全悬浮培养方法，特别涉及一种用传代细胞系全悬浮培养鸭肝炎病毒的方法，属于兽用生物制品
技术领域：
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背景技术：
：近年来，鸭病毒性肝炎在中国水禽养殖地区广泛流行，给养鸭业的健康发展造成严重威胁。鸭病毒性肝炎由鸭肝炎病毒(dhv)引起，主要引起3周龄以内的雏鸭发病，病死率可达100％。目前已报道的鸭肝炎病毒有ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型3个血清型。中国已发现ⅰ型和ⅲ型鸭肝炎病毒，其中流行的主要是ⅰ型。目前尚无治该病的特效药物，接种鸭肝炎疫苗是预防和控制该病的最经济且行之有效的方法。在国内，鸭肝炎疫苗的生产主要还是依靠传统的鸡胚培养技术，通过在鸡胚中连续传代致弱，收集胚体，胚液等进行研磨，匀浆，收获病毒，制成疫苗。利用该方法虽然病毒滴度较高(108.3eld50/ml)，但是因生产需要大量spf鸡胚，不仅成本大，而且一旦爆发大规模禽流感，spf鸡胚供应不足，就将导致疫苗生产的停滞，给养殖业带来巨大的风险。同时，鸡胚组织苗的生产，需要研磨匀浆，过滤纯化，不仅工序复杂，效率低下，而且操作过程中极易污染外源病毒，大大降低了疫苗的质量及安全性。同时，生产疫苗所产生的废物废料对环境造成污染，具有较大的生物安全风险。为了解决上诉鸡胚培养的缺点，许多专家学者进行了鸭肝炎病毒的细胞培养，以期缩短病毒培养周期，提高疫苗质量和抗原纯度。已报到的用于鸭肝炎病毒培养的细胞主要有鸡胚或鸭胚成纤维细胞，鸭胚肾细胞等原代细胞，但是因为原代细胞的制备实质上也是取鸡胚或鸭胚胚体进行制作，工序反而更加复杂，而且采用上述细胞进行鸭肝炎病毒的培养滴度大大降低，一般只能达到103.0-105.0eld50/ml，无法达到生产要求，因无法突破这一瓶颈，因此利用细胞培养鸭肝炎病毒一直处于研究阶段，目前也没有细胞源鸭肝炎病毒疫苗上市的报道。随着无血清大规模培养技术的发展，采用传代细胞源悬浮培养病毒制备疫苗在生物医药行业的应用已经越来越广泛。规模化悬浮培养最大的优势在于通过更为精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。实现规模化悬浮培养的关键技术主要有4个，可适应病毒高效增殖的悬浮培养传代细胞，个性化培养基的研制，生物反应器的选择及培养工艺的选择及优化。技术实现要素：本发明提供了一种鸭肝炎病毒的全悬浮培养方法，目的在于提供用全悬浮传代细胞系鸭胚细胞衍生的传代细胞培养鸭肝炎病毒的方法，从而为实现鸭肝炎病毒疫苗的大规模生产提供参考。本发明提供了一种鸭肝炎病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：步骤1：鸭胚细胞衍生的传代细胞的复苏与传代培养。步骤2：采用二阶培养法，向全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞接种鸭肝炎病毒，实现病毒大规模培养。步骤3：接毒后，每隔12h取样测定病毒的tcid50，在病毒tcid50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的鸭肝炎病毒。进一步地，所述步骤2的二阶培养法操作方式如下，即全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞的密度培养生长至适于接毒时，进行鸭肝炎病毒的接种，接毒完成后，将摇瓶放置于5％co2培养箱中，在低转速下吸附0.5h-2h；吸附完成后补加病毒培养基，并放回到5％co2培养箱中，调节合适转速，继续培养。进一步地，本发明的全悬浮培养方法还包括步骤4：取步骤2所得培养后的鸭肝炎病毒作为下一代病毒传代培养的种毒，继续采用二阶培养法，将病毒接种至全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞中进行病毒的传代驯化与增殖，并按此方法连续传代2-30代，最终收获鸭肝炎病毒为鸭胚细胞衍生的传代细胞传代细胞的适应毒。进一步地，步骤1所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞复苏与传代培养方法如下：从液氮中迅速取出鸭胚细胞衍生的传代细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待细胞完全融化后，将复苏细胞加入约20倍体积的细胞培养基中，经离心机300g离心10min，倒掉上清液，使用细胞培养基将细胞吹打重悬均匀，细胞悬液接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养；每隔24h少量取样一次进行细胞计数，通过检查细胞密度和细胞活力等参数，监测细胞生长情况；培养约48-72h，达到一定细胞密度后，进行细胞传代；细胞经已连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代。更进一步地，所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞培养温度为35℃-37℃，优选为37℃；培养转速为130rpm-150rpm，优选为150rpm。更进一步地，当鸭胚细胞衍生的传代细胞密度达到6×106/ml-15×106/ml时，可用于鸭肝炎病毒的接种，优选的，细胞密度达到8×106/ml～10×106/ml时，用于接毒。更进一步地，鸭肝炎病毒接毒量为0.001moi-1moi之间接种，优选的0.01moi。更进一步地，所述的二阶培养法接毒，细胞接毒后吸附时间为0.5h-2h，培养温度为33℃-35℃，优选为33℃；培养转速为110rpm-140rpm，优选为110rpm。更进一步地，病毒接种吸附完成后，需补加新的病毒生产培养基，补加比例为原工作培养基体积的1-3倍，优选为补加原工作体积2倍的生产培养基。更进一步地，所述的鸭胚细胞衍生的传代细胞培养基中含有10-100mg/l氨基酸、1-10mg/l维生素、100-500mg/l无机盐、1000-8000mg/l葡萄糖、0.01-1mg/l微量元素、0.1-10mg/l生长因子，其中氨基酸选自丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、色氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的一种或多种，所述维生素选自维生素c、生物素、叶酸、氯化胆碱、肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醇、吡哆醛、维生素b12、核黄素、盐酸硫胺素中的一种或多种，所述无机盐选自氯化镁、氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠中的一种或多种，所述微量元素选自硫酸锰、亚硒酸钠、硝酸铁中的一种或多种，所述生长因子选自胰岛素、egf、bfgf中的一种或多种。该培养基属于无血清、化学界定培养基。进一步地，所述鸭肝炎病毒为弱毒株gd75株(由强毒gd株在鸡胚连续传代75代致弱)，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。本发明相对于现有技术具有如下有益效果：1、鸭胚细胞衍生的传代细胞系，属于鸭源细胞，对鸭肝炎病毒具有更高的敏感性和适应性，利用该细胞培养鸭肝炎病毒滴度高(可达到109.0eld50/ml以上)，相比于传统的鸡胚培养(108.0eld50/ml左右)提高至少一个滴度，具有明显的优势。2、鸭胚细胞衍生的传代细胞为全悬浮传代细胞，属于非贴壁依赖性细胞，具有传代方便(不需消化处理)，易于收获细胞等特点，且细胞密度最高可达3,000万个细胞/ml。相比于传统的贴壁细胞培养，细胞收获量大大增加。因细胞密度的增加，病毒增殖滴度也随之提高，生产出的病毒疫苗无需经过浓缩等下游繁琐的程序，大大节约了成本。3、鸭胚细胞衍生的传代细胞为无血清全悬浮细胞。对于传统的微载体悬浮培养和培养基需要添加血清的培养方式，鸭胚细胞衍生的传代细胞用于病毒疫苗的制备无需微载体，从而可以突破细胞生长需要基质表面贴附的限制，还可以节约设备空间，提高设备利用率，真正意义上实现大规模培养；并且采用本细胞培养病毒制备疫苗，无需血清和消化液，从而可大大减少产品杂质的引入，简化后期的产品分离纯化过程，有效的降低了成本。4、鸭胚细胞衍生的传代细胞使用的培养基为专利权人自制研发的无血清、化学界定的个性化培养基，无需购买国外昂贵的进口培养基，具有突出的价格优势，大大节约了成本。综上，本发明采用鸭胚细胞衍生的传代细胞悬浮培养鸭肝炎病毒，首先可以解决传统生产方式鸡胚供应不足及操作繁琐，工序复杂，效率低下，易污染外源病毒的风险；其次，目前采用细胞培养鸭肝炎病毒敏感性低适应性差导致病毒滴度低下，为了突破这一瓶颈，本发明采用鸭胚细胞衍生的传代细胞系进行鸭肝炎病毒的培养，具有非常好的适应性，病毒滴度大大提高，可达109.0eld50/ml，具有明显优势；其三采用鸭胚细胞衍生的传代细胞系培养鸭肝炎病毒，可实现大规模全悬浮培养，大大降低成本，且申请人人自制研发的无血清、化学界定的个性化培养基，相比于购买国外昂贵的进口培养基，具有突出的价格优势。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。实施例1-3所得鸭肝炎病毒的eld50检测方法如下：将收获的鸭肝炎病毒病毒用灭菌生理盐水做10倍系列稀释，取3个适宜稀释度，各尿囊腔内接种9-11日龄spf鸡胚5枚，每胚0.1ml，置37℃孵育120h，24h以内死亡的鸡胚弃去不计，根据接种后24-120h的死胚总数计算eld50。实施例1：不同接毒量及培养时间对鸭肝炎病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞中增殖的影响本发明实施例1所用材料来源如下：1.病毒：鸭肝炎病毒弱毒株gd75株，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。2.细胞：全悬浮传代细胞系鸭胚细胞衍生的传代细胞系。3.培养基：名称为培养基eblm004，含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf。本发明实施例1鸭肝炎病毒(gd75株)的培养方法如下：1.从液氮罐中取出冻存的鸭胚细胞衍生的传代细胞，置于37℃水浴融化后加入到约30ml的培养基中，经离心机300g离心10min，去掉上清液，使用125ml三角摇瓶将细胞重悬于15ml的培养基中，将培养基置于37℃，5％co2培养箱中，轨道摇床转速设置为150rpm，进行悬浮培养，第一天补充培养基15ml，第二天再次补充培养基15ml，第三天进行传代；2.对步骤1所得的鸭胚细胞衍生的传代细胞进行细胞密度计数，并接种至三角瓶中，接种密度为0.35×106cells/ml-0.75×106cells/ml，将三角瓶置于37℃，5％co2的培养箱中进行培养，设定轨道摇床转速为150rpm，继续培养2-3天后，重复此方法进行继续传代，对连续传代三代次后的细胞进行扩增，用于病毒接种实验；3.取用第3代扩增至第4代的种子细胞200ml，重复步骤2的操作，使细胞密度达到8.68×106/ml；4.取鸭肝炎病毒(gd75株)对步骤3所得细胞株进行病毒的接种，按接毒量分别为1moi，0.1moi，0.01moi，0.001moi分别接种至步骤3中的鸭胚细胞衍生的传代细胞；接毒完成后，放回至37℃、5％的co2培养箱中进行吸附培养1小时，此时轨道摇床转速为120rpm；吸附完成后补加2倍体积的病毒培养基，并放回到35℃、5％co2培养箱中继续培养，轨道摇床转速为120rpm，鸭肝炎病毒(gd75株)来源为肇庆大华农生物药品有限公司，毒价为108.0eld50/0.1ml；5.接毒后每隔12小时取样，进行eld50的检测。对实施例1取样检测eld50，结果(表1)如下：表1：不同接毒量对鸭肝炎病毒(gd75株)在鸭胚细胞衍生的传代细胞中增殖的影响接毒量(moi)eld50/ml1107.830.1107.960.01109.160.001108.20从表中可以看出，鸭肝炎病毒(gd75株)在鸭胚细胞衍生的传代细胞中的培养受到接毒量的影响，在接毒量过低或者过高都不能达到最佳的培养效果，当接毒量为0.01moi时，所得到鸭肝炎病毒的eld50滴度最高(109.16/ml)，因此后续的鸭肝炎病毒(gd75株)传代驯化按此比例进行病毒的接种。实施例2：鸭肝炎病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞系培养中不同收获时间的eld50比较本发明实施例2所用材料来源如下：1.病毒：鸭肝炎病毒(gd75株)在鸭胚细胞衍生的传代细胞中的适应毒株。2.细胞：全悬浮传代细胞系鸭胚细胞衍生的传代细胞系。3.培养基：名称为培养基eblm004，含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf。本发明实施例2鸭肝炎病毒的培养方法如下：1.对鸭胚细胞衍生的传代细胞进行传代及培养，传代方法与细胞培养条件同实施例1；其中，鸭胚细胞衍生的传代细胞接毒细胞代次限制为细胞工作库复苏后的3-30代之内；2.当步骤1中细胞生长至密度为8×106/ml～10×106/ml时，按接毒量为0.01moi进行鸭肝炎病毒的接种，接毒方法和病毒培养条件采用的为经实施例1优化的条件，接毒后24h开始，每隔12h取样进行eld50的检测，探索鸭肝炎病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞培养中的最佳收毒时间。3.对收获的鸭肝炎病毒(gd75株)进行eld50的检测。表3：鸭肝炎病毒(gd75株)在鸭胚细胞衍生的传代细胞培养中不同收获时间的eld50比较收毒时间(h)eld50/0.1ml24103.448106.672108.096109.0108108.5从表中可以看出，鸭肝炎病毒(gd75株)在鸭胚细胞衍生的传代细胞培养中的最佳收毒时间为96h左右。因此，后续的收毒时间定为96h。实施例3：鸭肝炎病毒在鸭胚细胞衍生的传代细胞中的稳定性传代本发明实施3所用材料来源如下：1.病毒：由上一代次收获的eld50最高时的鸭肝炎病毒作为种毒。2.细胞：全悬浮传代细胞系鸭胚细胞衍生的传代细胞。3.培养基：名称为培养基eblm004，含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf。本发明实施例3鸭肝炎病毒的培养方法如下：1.对鸭胚细胞衍生的传代细胞进行传代及培养，传代方法与细胞培养条件同实施例1；其中，鸭胚细胞衍生的传代细胞接毒细胞代次限制为细胞工作库复苏后的3-30代之内；2.当步骤1中细胞生长至密度为8×106/ml～10×106/ml时，按接毒量为0.01moi进行鸭肝炎病毒的接种，接种的病毒来源为上一代中收获的eld50最高时的鸭肝炎病毒，接毒方法和病毒培养条件采用的为经实施例1、2优化的最佳条件，按此方法连续传代7代次。每次接毒后，每隔12h取样进行eld50的检测，在eld50最高时进行鸭肝炎病毒收集；3.对收获的鸭肝炎病毒进行eld50的检测。对实施例3取样检测eld50，结果(表3)如下：表3：鸭肝炎病毒(gd75株)在鸭胚细胞衍生的传代细胞中的连续传代驯化从表中可以看出，随着鸭肝炎病毒(gd75株)在鸭胚细胞衍生的传代细胞中的连续传代驯化，鸭肝炎病毒(gd75株)能够很好的适应鸭胚细胞衍生的传代细胞，经检测，eld50最高可109.2/ml，且病毒的滴度稳定。因此选择全悬浮传代细胞系鸭胚细胞衍生的传代细胞作为鸭肝炎病毒培养的靶细胞具有非常广阔的前景。实施例4：不同培养基悬浮培养鸭胚细胞衍生的传代细胞生产鸭肝炎病毒比较本发明实施例4所用材料来源如下：1.病毒：鸭肝炎病毒(gd75株)，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。2.细胞：全悬浮传代细胞系鸭胚细胞衍生的传代细胞；3.培养基：名称为培养基eblm004，含有10mg/l的丙氨酸、10mg/l的精氨酸、10mg/l的半胱氨酸、10mg/l的酪氨酸、10mg/l的色氨酸、10mg/l的缬氨酸、10mg/l的亮氨酸、1mg/l维生素c、1mg/l生物素、1mg/l叶酸、1mg/l氯化胆碱、1mg/l肌醇、1mg/l烟酰胺、1mg/l盐酸吡哆醇、50mg/l氯化钾、50mg/l氯化钠、50mg/l磷酸氢二钠、50mg/l碳酸氢钠、1000mg/l葡萄糖、0.1mg/l硫酸锰、0.01mg/l硝酸铁、0.1mg/l胰岛素、0.5mg/legf、1mg/lbfgf。4.对比培养基ebxgro-i为商用无血清悬浮细胞培养基，购自于sigma公司。本发明实施例4方法如下：1.分别用两种培养基对鸭胚细胞衍生的传代细胞进行传代及培养，传代方法同实施例1；其中，鸭胚细胞衍生的传代细胞接毒细胞代次限制为细胞工作库复苏后的3-30代之内；2.当步骤1中细胞生长至密度为8×106/ml～10×106/ml时，按接毒量为0.01moi进行鸭肝炎病毒的接种，接毒方法和病毒培养条件为各自优化的最佳条件，按此方法连续传代10代次。每次接毒后，每隔12h取样进行eld50的检测，在eld50最高时进行鸭肝炎病毒收集，选择p6-p10五代次收获的病毒比较两种培养基对鸭肝炎病毒培养的效果。对实施例4取样检测eld50，结果(表4)如下：表4：两种培养基对鸭肝炎病毒(gd75株)培养效果比较从表中可以看出，鸭肝炎病毒(gd75株)在两种培养基中都能够生长，但是采用eblm004培养基培养鸭肝炎病毒(gd75株)eld50稳定在109.1/ml以上，相比于采用ebxgro-i培养的鸭肝炎病毒滴度(108.0-108.5/ml)高0.5至1个滴度，因此选择全悬浮传代细胞系鸭胚细胞衍生的传代细胞采用eblm004培养基培养鸭肝炎病毒培养具有非常广阔的前景。综上所述，本发明实施例通过以鸭胚细胞衍生的传代细胞作为鸭肝炎病毒(gd75株)的靶细胞，既可解决鸭肝炎病毒(gd75株)无法在传代细胞中培养或培养适应性差的问题，同时本发明采用无血清化学界定的个性化培养基又可实现鸭肝炎病毒(gd75株)在鸭胚细胞衍生的传代细胞中的全悬浮培养，大大提高了病毒培养规模和效率，符合未来疫苗培养的必然趋势。更重要的是，根据申请人的测试，鸭胚细胞衍生的传代细胞系不仅可用于培养鸭肝炎病毒，鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒同样在鸭胚细胞衍生的传代细胞中具有良好的适应性，因此，如果要生产细胞源多联苗时，可以解决生产联苗需要用多种细胞，工艺复杂，很难保证批次稳定性等缺陷。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。当前第1页12