一株抗恩拉霉素A组分单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

本发明涉及食品安全免疫学检测技术领域。特别涉及抗恩拉霉素单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤细胞株2h1f91，以及该抗体的免疫检测应用。

背景技术：

恩拉霉素（enramycin）是链霉菌streptomycesfungicidious分泌的由17种氨基酸和13种脂肪酸所组成的一种多肽类化合物，主要成分为恩拉霉素a（c107h138c12n26o31）和恩拉霉素b(c108h140c12n26o31)，其中a组分活性要大于b组分，且残留中主要成分为a组分。恩拉霉素对梭状芽孢杆菌、链球菌、葡萄球菌和肺炎双球菌等革兰氏阳性菌有强大的抗菌活性，能够调节动物胃肠道菌群，因此作为一种的促生长类饲料添加剂用于畜禽动物使用。

1974年，恩拉霉素作为药物在日本正式注册，由于其优良的促生长作用，被用作抗生素生长促进剂（agp）添加到饲料中使用。2006年，日本在食品中引入肯定列表制度，禁止含量超过一定水平（一律标准）的食品销售，恩拉霉素残留量限定在0.01mg/kg。2010年，韩国农林渔业食品部也在《饲料管理法案》中禁止将恩拉霉素作为饲料添加剂。2016年，中国农业部第2271号规定了恩拉霉素预混剂在饲料中的添加量，每1000kg饲料，猪2.5-20g；鸡1-5g，蛋鸡产蛋期禁用，且禁止与四环素类、吉他霉素、杆菌肽、维吉尼亚霉素配伍使用。近年来，由于抗生素耐药性迅速增加，特别是多重耐药（mdr）微生物的出现，使人们对这些抗生素进行了重新评估。尽管恩拉霉素在畜禽生产中使用具有优势，但一旦它们在饲料中被滥用或者停药期缩短，都有可能导致动物机体中的药物残留，进而在食物中残留。长期食用含有抗生素残留的食物，会使mdr病原体进入人体，从而减少抗生素对细菌感染疾病的疗效，从而导致更多的死亡。中国目前还未有关于恩拉霉素在动物性食品中残留的限定标准，且检测水平较发达国家落后，因此制备高灵敏度的抗恩拉霉素a组分单克隆抗体用于动物性食品中恩拉霉素的快速检测势在必行。

目前检测恩拉霉素的方法主要为微生物法、仪器分析方法和免疫检测法，目前国内用于恩拉霉素含量测定还是按照农业部1999年发布的《进口兽药质量标准》和中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局在2008年发布的《饲料中恩拉霉素的测定微生物学法》中的液相检测法和微生物检测法。微生物检测法具有不需要特殊设备、操作简单、适用于大批量检测等优点，缺点是重复性差，结果判定易受主观条件干扰。仪器分析方法如液相色谱法（hplc）、液质联用技术（lc-ms）等可以定量检测样品，但是设备昂贵，操作繁琐，且需要经过培训的专业人员，不适用于现场大量样品的快速筛查。免疫分析方法是基于抗原抗体的免疫分析方法，如elisa方法，胶体金检测方法等，由于其检测快、灵敏度高、通量高，已广泛用于食品中各类抗生素残留的快速检测。因此，迫切需要开发出基于高灵敏度抗恩拉霉素a组分单克隆抗体的免疫学快速检测方法。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一株稳定分泌能特异性识别恩拉霉素的高亲和力单克隆抗体杂交瘤细胞株，及其分泌的单克隆抗体在制备用于检测恩拉霉素免疫检测工具中的应用。

本发明通过以下技术方案加以实现：

本发明的第一方面，提供分泌恩拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为cgmccno.15785，是由纯度为97%以上得恩拉霉素a组分偶联载体蛋白，免疫balb/c小鼠后，尾部采血，取血清效价大于1：12800的balb/c小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%peg1450进行细胞融合；用含20%胎牛血清的hatrpmi-1640培养基筛选融合细胞。经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗恩拉霉素a组分单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的第二方面，提供一种恩拉霉素单克隆抗体，由保藏编号为cgmccno.15785的杂交瘤细胞株产生。

本发明的第三方面，提供第二方面所述单克隆抗体在制备用于免疫检测工具中的应用。

具体实施例中，所述检测工具为试纸、试剂盒或生物芯片。

具体实施例中，所述应用为在检测恩拉霉素含量中的应用；即所述单克隆抗体应用于检测样品中是否含有恩拉霉素残留。

具体实施例中，所述样品选自动物性食品。

具体实施例中，所述动物性食品选自猪肉、鸡肉、牛肉中的至少一种，视本领域需求而选择。

本发明的第四方面提供了用于检测恩拉霉素含量的试剂盒，其中包括发明第二方面所述单克隆抗体。

具体实施例中，所述试剂盒，包括但不限于酶联免疫试剂盒、化学发光检测试剂盒及免疫荧光检测试剂盒。

具体实施例中，所述试剂盒为定量检测恩拉霉素残留的间接竞争酶联免疫（ic-elisa）试剂盒，其中，本发明的第二方面所述单克隆抗体作为检测抗体。

本发明还提供了上述试剂盒在检测动物性食品中恩拉霉素含量的应用。

具体实施例中，所述动物性食品为猪肉。

本发明以高纯度恩拉霉素a组分作为半抗原偶联载体蛋白免疫小鼠，获得的单克隆抗体亲和力高，特异性强，制备出的检测方法特异性好，灵敏度高，线性范围广。目前，市场上没有针对恩拉霉素的抗体出售，仅有以恩拉霉素a、b组分混合物作为半抗原，免疫动物，制备多克隆抗体的类似免疫检测方法。本发明的间接竞争elisa方法批内变异系数低于10%，线性范围为1.9-150ng/ml在猪肉中的检测限为39.4μg/kg。因此，本发明的单克隆抗体灵敏度更高，且制备的方法的检测限低，有更广泛的应用空间。

保藏信息：

一株抗恩拉霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株，其分类命名为2h1f91，保藏编号为cgmccno.15785，保藏日期为2018年05月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

附图说明

图1为纯度97%以上的恩拉霉素a组分液相色谱图；

图2为纯度97%以上的恩拉霉素a组分的液质图；

图3为抗恩拉霉素a组分单克隆抗体的亲和力测定结果图；

图4为猪肉样品提取液不同稀释倍数下添加一定浓度恩拉霉素标准品下的标准曲线图；

图5为使用本发明制备的间接竞争elisa试剂盒检测恩拉霉素标准品的标准曲线图。

具体实施方式

通过下面的实施例对本发明作进一步说明，结合附图可以进一步理解本发明的优点和特点，但不限制本发明的范围。

骨髓瘤细胞sp2/0来源于中国典型培养物保藏中心（武汉大学），6-8周龄的balb/c雌性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。胎牛血清购自维森特生物技术有限公司，细胞融合用peg1450，50xhat贮液，50xht贮液，bsa，ova均购自sigma，rpmi-1640培养基购自美国gibco公司。

实施例1

动物免疫及杂交瘤细胞株2h1f91的获得：

一、动物免疫及杂交瘤细胞株2h1f91的获得

1.恩拉霉素完全抗原er-a-bsa的制备:室温下，将72mg的恩拉霉素-a（0.03mmol），300mg（0.09mmol）的n，n'-羰基二咪唑和220mg的4-二甲基氨基吡啶（0.09mmol）在2.5ml的二甲基甲酰胺中反应过夜。在连续搅拌期间将溶液滴加到200mgbsa的pbs溶液（0.1moll^-1，ph8.0）中。将混合物在4℃下搅拌24小时，然后以5000rpm离心10分钟。使用pbs（0.01moll^-1，ph7.4）彻底透析纯化上清液混合物，并在使用前储存在-20℃。即得恩拉霉素a组分完全抗原溶液，其中，恩拉霉素a组分的液相色谱图见图1，液相质谱图见图2。

2.恩拉霉素包被抗原er-a-ova的制备：将上述bsa换成ova即可。

3.动物免疫：选择健康的6-8周龄的balb/c小鼠进行免疫。取恩拉霉素a组分完全抗原（1mg/ml）与等量quickantibody^tm免疫佐剂（北京博奥龙免疫技术有限公司）混合均匀后，50μl每只免疫注射小鼠后腿肌肉，每次免疫间隔21天，第二次免疫10天后，尾部取血，用间接elisa测定抗血清效价，包被原er-a-ova的浓度为7μg/ml。选择效价高、抑制好的小鼠进行加强免疫，腹腔注射完全抗原，不加佐剂，3天后取脾细胞进行细胞融合。

4.细胞融合：在加强免疫三天后，按照常规peg（聚乙二醇，分子量1450）法进行细胞融合，具体步骤如下：

（1）拉颈处死小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏，将其放置100μm滤网上，用注射器筒芯轻轻研磨，待脾脏无血色后，收集脾细胞悬液，细胞计数；

（2）取处于对数生长期的sp2/0细胞，悬浮于rpmi-1640培养基中，细胞计数；

（3）将脾细胞与sp2/0细胞按10：1的数量比混合，用无血清培养基清洗2遍，1min内往沉淀中加入1ml50%peg，轻轻混匀，之后按照从慢到快加入rpmi-1640基础培养液，离心去除peg之后悬浮于含20%胎牛血清、2%50×hat的rpmi-1640培养基中，再铺到96孔细胞培养板，置于37℃、5%co2培养箱中培养。

5.细胞筛选与细胞株建立：细胞融合三天后对细胞补液，第五天半换液，第七天取细胞培养基上清检测，检测分别用间接elisa和间接竞争elisa进行，阳性细胞株采用有限稀释法亚克隆，7天后采用同样的方法检测。重复三次，获得分泌抗恩拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株2h1f91。

实施例2

单克隆抗体的制备与鉴定。

1.腹水制备和纯化：

预先用腹水制备佐剂处理10周龄balb/c小鼠，12-15天后腹腔接种细胞株1-2×10⁶，7-10天后采集腹水。将腹水通过饱和辛酸-硫酸铵法纯化，纯化后的单抗分装保存于-20℃备用。

2.抗体亚型鉴定：

采用单克隆抗体亚型检测试剂盒（北京博奥龙免疫技术有限公司）对步骤一获得的抗体进行鉴定：用浓度为0.01mol/lph9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释成7μg/ml后包被酶标板，4℃过夜，弃包被液，用pbst洗板，5次，每次30s；加入含1%酪蛋白的pbs封闭液每孔0.1ml，37℃孵育1h，弃封闭液，pbst洗板5次；将纯化后的单克隆抗体用含0.1%明胶的pbst以1：1000稀释后，以0.1ml/孔加入到酶标板，37℃孵育1h后洗板；依次加入辣根过氧化物酶标记的各类抗抗体（igg1、igg2a、igg2b、igg3、igm、iga、kappa及lambda）37℃孵育1h后洗板，加入新鲜配置的tmb显色液，每孔0.1ml，37℃避光反应20min，0.05ml/孔加入2m硫酸终止反应，反应液变为黄色所对应孔的亚型即为单克隆抗体的亚型。

结果表明单克隆细胞株2h1f91分泌的抗体亚型为igg1,kappa型。

3.抗体亲和力常数测定：

(1)包被抗原er-ova梯度稀释后（浓度依次为2、5、7、9μg/ml）后elisa板包被，100μl/孔，4℃过夜；

(2)弃去包被液，pbst洗板5次，毎次30s扣置于吸水纸上拍干，用含1%酪蛋白的cbs封闭，每孔200μl，37℃封闭1h，pbst洗板5次，每次30s，滤纸拍干；

(3)封闭完成后，pbst洗涤，加入倍比稀释的抗恩拉霉素a组分单克隆抗体(1:500，1:1000，1:2000，1:4000，1:8000,1:16000,1:32000倍稀释)，每个浓度3个平行，37℃作用1h；

(4)pbst洗涤后，加入1:5000稀释的羊抗鼠抗体，37℃作用45min；

(5)pbst洗涤后，加入新鲜配置的tmb显色液，每孔0.1ml，37℃避光反应20min，0.05ml/孔加入2m硫酸终止反应，酶标仪od450nm读取吸光度。亲和常数（kaff）根据以下公式计算亲和力常数：

ka=（n-1）/2（n*ab1－ab2）,n=ag2／ag1

式中:ag1、ag2为不同的包被抗原的质量浓度（μg/ml）；ab1、ab2为包被抗原所对应的抗体浓度。

亲和力测定结果见图3：结果表明单克隆细胞株2h1f91分泌的抗体的亲和力常数为3.88×10¹⁰l/m,属于高亲和力抗体。

4.抗体交叉反应测定：

通过ic-elisa测定几种多肽类抗生素的ic50值来评估交叉反应（cr）程度，cr值的计算如下：cr=×100%

交叉反应测定结果见表1，结果表明获得单克隆细胞株2h1f91仅对er-a、er-b有交叉反应，对其他多肽类抗生素无交叉反应。

表1

5.杂交瘤细胞株的保藏：

获得的杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15785。

实施例3

用单克隆细胞株2h1f91分泌的单克隆抗体制备间接竞争elisa试剂盒。

一、抗原抗体工作浓度的确定：

1）用碳酸盐缓冲液（cbs）稀释好的1、3、5、7、9μg/mler-a-ova作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μl，4℃过夜后，pbst洗板5次，每次30s，滤纸拍干；

2）用含1%酪蛋白的cbs封闭，每孔200μl，37℃封闭1h，pbst洗板5次，每次30s，滤纸拍干；

3）每列每孔分别加入100μl1：500、1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000稀释的单克隆抗体，37℃反应1h，洗板拍干；

4）每孔加入100μl用含0.01%明胶的pbst1：5000稀释的hrp标记的羊抗鼠igg，37℃反应1h后，洗板拍干；

5）每孔加入100μltmb显色液，37℃显色20min后，每孔加入50μl2m浓硫酸终止反应，450nm处测吸光值。

6）最后选取od值在1.0左右的包被原浓度和单克隆抗体稀释倍数为间接竞争elisa的工作浓度。

二、间接竞争elisa方法的建立：

1）用碳酸盐缓冲液（cbs）稀释好的1μg/mler-a-ova作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μl，4℃过夜后，pbst洗板5次，每次30s，滤纸拍干；

2）用含1%酪蛋白的cbs封闭，每孔200μl，37℃封闭1h，pbst洗板5次，每次30s，滤纸拍干；

3）用pbs分别配置0、0.019、0.039、0.078、0.15、0.3125、0.625、1.25μg/ml的恩拉霉素标准溶液，将标准溶液50μl/孔，加入到封闭好的酶标板中，每个样品重复三个孔，之后每列每孔再分别加入50μl1：8000稀释的单克隆抗体，37℃反应1h，洗板拍干；

4）每孔加入100μl用含0.01%明胶的pbst1：5000稀释的hrp标记的羊抗鼠igg，37℃反应45min后，洗板拍干；

5）每孔加入100μltmb显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μl2m浓硫酸终止反应，450nm处测吸光值；

6）根据不同标准品浓度下od值的不同可以建立od值与标准品浓度的标准曲线。

三、采用本发明建立的间接竞争elisa方法检测猪肉中的恩拉霉素含量：

1.样品制备：

称取10g猪肉，分别添加200、100、50、0μl恩拉霉素标准品(0.2mg/ml)至锥形瓶底部，使终浓度为4000、2000、1000、0μg/kg。加入30ml50%甲醇、ph2.0，放置摇床，150r，1h后8000r离心10min后，取出上清，沉淀继续加30ml50%重复浸提一次，合并两次上清，氮吹仪吹干至20ml左右。

2.样品基质效应

1)首先将没添加标准品的猪肉样品浸提液分别10、30、50倍稀释，然后加入一系列浓度的标准品，浓度依次为0、0.019、0.039、0.078、0.15、0.3125、0.625、1.25μg/ml，作出标准曲线，并与之前的标准曲线作比较，选出与之前的标准曲线最符合的稀释倍数，见图4。

2)绘制本发明的标准曲线见图5，通过s型曲线计算出单克隆抗体的ic50值，线性曲线用于计算样本中的恩拉霉素含量。ic50值为108.5ng/ml性范围为1.9-150ng/ml。将样品提取液稀释50倍后，上样量50μl，进行elisa检测。

本发明得到的抗体能够特异性地与恩拉霉素结合，因此可以用在检测恩拉霉素残留的试剂盒中，制备的试剂盒灵敏度高，线性范围广，并且具有简单快速的优点。