本发明属于生物与新医药中轻工和化工生物技术的天然产物有效成份的分离提取技术，涉及提取与应用领域，尤其涉及一种螺旋藻藻蓝蛋白的制备方法及其应用。
背景技术：
螺旋藻是一种生长在热带及亚热带碱性湖泊中的微藻类植物，富含各种营养物质及活性成分，被联合国粮食与农业组织称之为“21世纪人类最理想的天然保健食品”。随着生活水平提高，人们的健康、养生理念逐渐增强，营养品和保健品的需求也逐步增加，螺旋藻保健品具有很大的市场潜力。螺旋藻中含有大量蛋白质及各种营养物质，其中藻蓝蛋白具有抗癌、提高免疫力、抗氧化等活性功能，具有很高的营养价值和经济价值，因此越来越多地被开发为保健品、功能性食品。传统的螺旋藻藻蓝蛋白冻融提取工序复杂，成本较高。本发明结合传统工艺，采用溶胀-超细剪切法进行破壁，用时较短，节约成本，提高了提取率。通过对提取的螺旋藻藻蓝蛋白进行抗肿瘤活性实验，评价螺旋藻藻蓝蛋白提取物在抗肿瘤方面的作用。
技术实现要素：
本发明提供了螺旋藻藻蓝蛋白的制备方法与应用，本发明将传统工艺与现代工艺相结合，细化工艺参数，采用溶胀-超细剪切法相结合的破壁技术，具有用时短，节约成本，提高提取率等特点。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种螺旋藻藻蓝蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）将螺旋藻于40℃烘干、采用万能粉碎机将其粉碎，过30目筛网；
（2）向螺旋藻粉末中加入磷酸盐缓冲液，混合均匀；
（3）将料液置于4℃环境中溶胀，溶胀后将料液进行超细剪切；
（4）将超细剪切后的料液进行离心，取上清液；
（5）向上清液中缓慢加入硫酸铵，静置，离心得到上清液；
（6）向上清液中继续加入硫酸铵，静置，离心得到蓝色沉淀；
（7）将沉淀冷冻干燥得藻蓝蛋白提取物。
优选的，所述步骤（2）中加入螺旋藻粉末与磷酸盐缓冲液的料液体积比为1:15~1:30g/ml。
优选的，所述步骤（2）中加入的磷酸盐缓冲液中包括0.05~0.15mol/l磷酸盐和0.004mol/l的叠氮钠。
优选的，所述步骤（3）中溶胀温度为4℃，溶胀时间为4~8小时。
优选的，所述步骤（3）中对料液的超细剪切时间为10~20min。
优选的，所述步骤（5）中向上清液中加入的硫酸铵至其饱和度为10%~30%。
优选的，所述步骤（6）中向上清液中加入硫酸铵至其饱和度为35%~70%。
优选的，所述步骤（7）中采用冷冻干燥法进行干燥，干燥时间为18~24小时。
本发明操作简单易懂，与现有技术相比，本专利所述的一种螺旋藻藻蓝蛋白的制备方法及其应用具有以下有益效果。本发明结合传统工艺与现代工艺，采用磷酸盐缓冲液作为提取溶剂，在浸提时采用溶胀-超细剪切法破壁技术，节约了提取时间，提高了提取率，节约了成本。本发明制备的螺旋藻藻蓝蛋白提取物对肿瘤细胞具有较强的抑制作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明所作出的变化或等同替换，均应属于本发明的保护范围。
实施例一
准确称取干燥粉碎的螺旋藻粉末20g，按照料液体积比1:15g/ml加入由0.05mol/l磷酸盐和0.004mol/l叠氮钠配制的磷酸盐缓冲液，混匀；将其置于4℃环境中溶胀4小时，采用超细剪切机剪切10min，将剪切后的料液离心，取上清液；向上清液中缓慢加入硫酸铵至其饱和度为10%，除去其他蛋白杂质，离心，取上清液；继续向上清液中缓慢加入硫酸铵溶液至其饱和度为40%，离心，得蓝色沉淀物；将析出的沉淀物冷冻干燥18小时，得到藻蓝蛋白，藻蓝蛋白得率为9.23%。
实施例二
准确称取干燥粉碎的螺旋藻粉末20g，按照料液体积比1:30g/ml加入磷酸盐缓冲液（浓度为0.15mol/l，含有0.004mol/l的叠氮钠），混匀；将其置于4℃环境中溶胀8小时，采用超细剪切机剪切20min，将剪切后的料液离心，取上清液；向上清液中缓慢加入硫酸铵至其饱和度为20%，除去其他蛋白杂质，离心，取上清液；继续向上清液中缓慢加入硫酸铵溶液至其饱和度为50%，离心，得蓝色沉淀物；将析出的沉淀物冷冻干燥24小时，得到藻蓝蛋白，藻蓝蛋白得率为10.08%。
实施例三
准确称取干燥粉碎的螺旋藻粉末20g，按照料液体积比1:25g/ml加入磷酸盐缓冲液（浓度为0.15mol/l，含有0.004mol/l的叠氮钠），混匀；将其置于4℃环境中溶胀6小时，采用超细剪切机剪切10min，将剪切后的料液离心，取上清液；向上清液中缓慢加入硫酸铵至其饱和度为30%，除去其他蛋白杂质，离心，取上清液；继续向上清液中缓慢加入硫酸铵溶液至其饱和度为60%，离心，取蓝色沉淀物；将析出的沉淀物-40℃真空冷冻干燥24小时，得到藻蓝蛋白，藻蓝蛋白得率9.83%。
实施例四
准确称取干燥粉碎的螺旋藻粉末20g，按照料液体积比1:20g/ml加入磷酸盐缓冲液（浓度为0.1mol/l，含有0.004mol/l的叠氮钠），混匀；将其置于4℃环境中溶胀6小时，采用超细剪切机剪切15min，将剪切后的料液离心，取上清液；向上清液中缓慢加入硫酸铵至其饱和度为30%，除去其他蛋白杂质，离心，取上清液；继续向上清液中缓慢加入硫酸铵溶液至其饱和度为70%，离心，得蓝色沉淀物；将析出的沉淀物冷冻干燥18小时，得到藻蓝蛋白，藻蓝蛋白得率10.54%。
实施例1-4所得提取物的活性测试
培养hela细胞，将其分为正常组和螺旋藻藻蓝蛋白提取物组，取对数生长期的hela细胞，将细胞混悬液按每孔1×104个细胞接种于96孔板中，37℃、5%co2及饱和湿度下培养24h后换无血清培养基，继续培养24h后，使细胞进入生长静止期。吸弃各孔培养基，正常组加入空白培养基，螺旋藻藻蓝蛋白提取物组加入含藻蓝蛋白提取物的培养基，继续培养，48h后取出96孔板，每孔加入cck-8溶液20μl，继续孵育30min。酶标仪测定450nm处各孔的吸光值（a），计算抑制率，结果见表1。
表1螺旋藻藻蓝蛋白提取物对hela细胞增殖的影响（n=6）
由表1可以看出，螺旋藻藻蓝蛋白提取物对hela细胞的增殖具有明显的抑制作用。
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。