HCV包膜蛋白高度保守区域的肽段502-518及其用途的制作方法

本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及一种来源于hcv包膜蛋白高度保守肽段502-518及其用途。

背景技术：

丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus，hcv)属于黄病毒科单股正链rna病毒。在全球大约3％的人口感染hcv，其中75％-85％发展为慢性肝炎，并有罹患肝硬化和肝癌的风险。此外，hcv具有非常高的基因变异性，依据其基因组系统发育学及序列的不同，可以将hcv分为1-7个基因型。在不同国家和地区占优势的基因型并不一样，我国以1b和2a基因型比较常见。由于直接抗病毒药物(directactingantivirals，daas)的成功研发，丙型肝炎的治疗取得了良好的效果。但是目前仍缺乏预防hcv感染的疫苗。根据我国《丙型肝炎防治指南(2015更新版)》的估计，我国约有1000万丙肝患者。由于相当大一部分患者不能支付daa高昂的医疗费用，并不能被完全治愈，成为hcv潜在的传染源。即使患者被daa完全治愈，由于hcv基因的高度变异性，仍然有被hcv重复感染的风险。因此，研发有效的抗hcv疫苗，既是一个重要的科学问题，也是一个紧迫的社会公共卫生问题。

在hcv感染过程中，其通过包膜蛋白与肝细胞受体srb1、cd81、claudin-1及occludin等蛋白分子相互作用介导入胞过程。同时hcv包膜蛋白也是激发宿主体液免疫和产生保护性中和抗体的主要靶标。然而，利用hcv包膜蛋白作为疫苗免疫原的效果并不理想，因为hcv包膜蛋白存在高度变异性，该免疫原其实并不能确保对各个基因型hcv均起到保护作用；同时，在包膜蛋白上存在高度变异区，如高度变异区1(hypervaribaleregion1，hvr1)，研究表明该区域不能诱导广谱中和抗体的产生，并且会干扰中和抗体的保护作用(参见文献：keckz.y.,etal..doi:10.1128/jvi.02.2016,90；prentoej,velazquez-moctezumar,foungsk,lawm&bukhj.hepatology64,2016,1881-1892)。利用hcv的core、ns3、ns4和ns5蛋白作为免疫原激发细胞免疫的疫苗亦在研发中，其效果有待验证(参见文献：houghtonm.immunologicalreviews239,2011,99-108)。还有研究利用dna载体同时表达hcv结构蛋白及非结构蛋白的疫苗正在进行1/2期的临床试验(参见文献：liangt.j..naturemedicine19,2013,869-878)。到目前为止，尚无数据表明以上疫苗可以完全保护宿主免于被hcv感染。针对hcv疫苗的研发任重而道远。

除了将整体的包膜蛋白作为疫苗免疫原，另外一种思路就是利用其包含的肽段进行免疫测试。torresi等发现利用某些包膜蛋白肽段免疫小鼠产生的抗血清可以有效阻断基因1型的h77株假病毒模型与肝细胞结合(参见文献：torresij.etal..immunologyandcellbiology85,2007,169-173)，提示肽段免疫也可以作为疫苗研发的思路(参见文献：el-awadym.k.etal..virologyjournal6,2009,66)。虽然hcv包膜蛋白高度变异，但是仍包含一些保守性很高的区域。我们之前曾利用536条涵盖1-6基因型hcv的序列进行分析，发现了hcv包膜蛋白若干保守性很高的位点或区域(参见文献：dengk.etal..plosone10,2015,e0138756)。将包膜蛋白保守性很高的位点或区域所在的肽段作为免疫原，可作为hcv疫苗研发的新方法。

在之前的研究中，有人对ncbiprotein数据库中1a、1b、4d基因型hcve2序列进行保守性评估和b-cell表位预测合成表位多肽，筛选了若干的hcv基因型特异性表位多肽，提示可作为预防hcv感染的候选免疫原(祁凌霞，吉林大学，2015)。也有报道利用计算机软件预测hcv包膜蛋白有效的抗原表位(郑宇，苏琴，林芳等，中华微生物学和免疫学杂志，2002，22(2):202-205)。然而，这些研究并未在体内验证上述表位肽能否诱导出高效价的抗体，或者在感染模型验证抗体是否对1-6基因型的hcv感染具有预防效果。

中国专利cn102227445b公开了一种结合丙型肝炎病毒的包膜蛋白的抗体及利用所述抗体鉴定丙型肝炎病毒的基因型的方法，该发明公开的抗体特异性结合基因型2a的hcv的包膜蛋白，但是不与基因型1a的hcv的包膜蛋白发生免疫反应，导致该抗体对应的氨基酸序列在hcv病毒中不保守；而且，该抗体只能用于减轻hcv造成的丙型肝炎带来的不良反应，不能用于治疗或预防hcv造成的丙型肝炎。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种来源于hcv包膜蛋白高度保守区域的肽段502-518及其用途。本发明提供的来源于hcv包膜蛋白高度保守区域的肽段，具有高度的保守性，同时可以诱导广谱中和性抗体的产生，为研究和开发丙型肝炎疫苗提供了新的抗原设计。

为实现上述目的，本发明提供了一种hcv包膜蛋白高度保守区域的肽段502-518，其氨基酸序列为val-cys-gly-pro-val-tyr-cys-phe-thr-pro-ser-pro-val-val-val-gly-thr。

本发明还提供了一种抗1-6型hcv的药物组合物，所述1-6型hcv药物组合物包括所述hcv包膜蛋白上高度保守区域的肽段502-518及药学上可接受的药用载体；所述药用载体为注射用水。

本发明提供的1-6型hcv药物组合物，还包括药用辅料，药学上可接受的盐；所述药用辅料包括润滑剂二甲基硅油、交联剂海藻酸钠、粘合剂乙基纤维素及防腐剂羟苯乙酯；所述药学上可接受的盐为巴比妥酸盐。

所述1-6型hcv药物组合物的制备方法为：

a.从ncbi网站上获取536条涵盖1-6基因型hcv的序列(参见文献：dengk.etal..plosone10,2015,e0138756)并进行比对，获得在hcv包膜蛋白上高度保守区域的肽段502-518，并将该肽段于上海吉尔生化公司进行合成，得氨基酸肽段；所述氨基酸肽段的纯度为99％；

b.将600ml注射用水加热至70℃，加入0.1g步骤a所得的氨基酸肽段，在300r/min下离心10min至完全溶解，得混合物i；

c.向步骤b所得的混合物i中加入二甲基硅油10g、海藻酸钠1.5g、乙基纤维素0.8g及羟苯乙酯1.5g，温度维持70℃，在500r/min下离心20min至完全溶解，得混合物ii；

d.向混合物ii中加入巴比妥酸盐8g，500r/min下搅拌至完全溶解，降温至30℃，即得。

本发明还提供了将所述包膜蛋白高度保守区域的肽段502-518与klh偶联作为免疫抗原，辅以弗式佐剂，并加入防腐剂硫柳汞、灭活剂甲醛、稳定剂乳糖及磷酸缓冲盐等，制备成预防和治疗性丙型肝炎疫苗的用途。

所述预防和治疗性丙型肝炎疫苗的制备方法为：

①将hcv包膜蛋白高度保守区域的肽段502-518与klh偶联，得偶联蛋白；所述肽段与klh的偶联过程是按照cellmosaic公司的klh-peptideconjugationkits试剂盒的厂商说明书进行操作的；

②将步骤①所得的偶联蛋白导入离体的黑猩猩肝细胞中，得重组的黑猩猩肝细胞；

③向步骤②所得的重组黑猩猩肝细胞中加入灭活剂甲醛，于37℃处理30h，得灭活的重组黑猩猩细胞；

④向步骤③所得的灭活的重组黑猩猩肝细胞中加入弗式完全佐剂，充分混合、分装，得灭活疫苗；

⑤向步骤④所得的灭活疫苗中按硫柳汞：乳糖：磷酸缓冲盐质量比为1：3：2的比例加入，充分混合、分装，进行冷冻真空干燥，制备成干燥疫苗。

本发明还提供了利用所述高度保守区域的肽段502-518与klh偶联作为免疫抗原，诱导b细胞产生对1-6型hcv具有广谱中和抗性的抗体。

所述中和抗性的抗体获得方法为：

s1将所述免疫抗原与佐剂等体积混合，得免疫原；

s2将步骤s1所得的免疫原分别于第0周、2周、4周、5周、6周、7周、8周以腹腔皮下多点注射法免疫8-10周龄的balb/c小鼠，共免疫7次，第1次加弗氏完全佐剂125μl，后6次均加弗氏不完全佐剂62.5μl，每只小鼠第1次加250μl乳化后抗原，抗原量为250g，后6次加125μl乳化后抗原，抗原量为125g；

s3免疫完成后，收集血清中的抗体，即得。

本发明还提供了一种阻断剂，所述阻断剂是针对高度保守区域的肽段502-518的一种抗体，可以高效阻断hcv病毒对正常细胞的侵害。

与现有技术相比，本发明提供的hcv包膜蛋白高度保守区域的肽段502-518，具有以下优点：

(1)本发明提供的hcv包膜蛋白高度保守区域的肽段，在1-6的hcv基因型中均高度保守；

(2)本发明提供的hcv包膜蛋白高度保守区域的肽段，可以用于制备预防和治疗性丙型肝炎疫苗，为研究和开发丙型肝炎疫苗提供了新的抗原设计；

(3)本发明提供的hcv包膜蛋白高度保守区域的肽段作为疫苗免疫原，均可以诱导广谱中和性抗体的产生，可以有效防止1-6基因型hcv细胞感染模型(hcvcc)的感染。

附图说明

图1为肽段502-518/klh免疫小鼠第9周采集的血清与肽段结合的elisa检测结果；

图2为肽段685-693/klh免疫小鼠第9周采集的血清与肽段结合的elisa检测结果；

图3为在不同稀释度下，肽段502-518免疫小鼠的抗血清对hcv的j6/jfh1株(2a基因型)感染的中和效果；

图4为在不同稀释度下，肽段502-518免疫小鼠的血清对hcv基因1型tncc株的中和活性及ic50值的影响；

图5为在不同稀释度下，肽段502-518免疫小鼠的血清对hcv基因2型j6/jfh1株的中和活性及ic50值的影响；

图6为在不同稀释度下，肽段502-518免疫小鼠的血清对hcv基因3型s52株的中和活性及ic50值的影响；

图7为在不同稀释度下，肽段502-518免疫小鼠的血清对hcv基因4型ed43株的中和活性及ic50值的影响；

图8为在不同稀释度下，肽段502-518免疫小鼠的血清对hcv基因5型sa13株的中和活性及ic50值的影响；

图9为在不同稀释度下，肽段502-518免疫小鼠的血清对hcv基因6型hk6a株的中和活性及ic50值的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

实施例1一种含hcv高度保守区域肽段502-518的药物组合物

所述含hcv高度保守区域肽段502-518的药物组合物，包括hcv包膜蛋白上高度保守区域的肽段502-518，药用载体为注射用水，药用辅料润滑剂二甲基硅油、交联剂海藻酸钠、粘合剂乙基纤维素、防腐剂羟苯乙酯，药学上可接受的巴比妥酸盐。

所述1-6型hcv药物组合物的制备方法为：

a.从ncbi网站上获取536条涵盖1-6基因型hcv的序列(参见文献：dengk.etal..plosone10,2015,e0138756)并进行比对，获得在hcv包膜蛋白上高度保守区域的肽段502-518，并将该肽段于上海吉尔生化公司进行合成，得氨基酸肽段；所述氨基酸肽段纯度为99％；

b.将600ml注射用水加热至70℃，加入0.1g步骤a所得的氨基酸肽段，在300r/min下离心10min至完全溶解，得混合物i；

c.向步骤b所得的混合物i中加入二甲基硅油10g、海藻酸钠1.5g、乙基纤维素0.8g及羟苯乙酯1.5g，温度维持70℃，在500r/min下离心20min至完全溶解，得混合物ii；

d.向混合物ii中加入巴比妥酸盐8g，500r/min下搅拌至完全溶解，降温至30℃，即得。

实施例2一种预防和治疗丙型肝炎的疫苗

预防和治疗性丙型肝炎疫苗包括所述包膜蛋白高度保守区域的肽段502-518与klh偶联获得的偶联蛋白，弗式佐剂，防腐剂硫柳汞、灭活剂甲醛、稳定剂乳糖及磷酸缓冲盐。

所述预防和治疗性丙型肝炎疫苗的制备方法为：

①将hcv包膜蛋白高度保守区域的肽段502-518与klh偶联，得偶联蛋白；所述肽段与klh的偶联过程是按照cellmosaic公司的klh-peptideconjugationkits试剂盒的厂商说明书进行操作的；

②将步骤①所得的偶联蛋白导入离体的黑猩猩肝细胞中，得重组的黑猩猩肝细胞；

③向步骤②所得的重组黑猩猩肝细胞中加入灭活剂甲醛，于37℃处理30h，得灭活的重组黑猩猩细胞；

④向步骤③所得的灭活的重组黑猩猩肝细胞中加入弗式完全佐剂，充分混合、分装，得灭活疫苗；

⑤向步骤④所得的灭活疫苗中按硫柳汞：乳糖：磷酸缓冲盐质量比为1：3：2的比例加入，充分混合、分装，进行冷冻真空干燥，制备成干燥疫苗。

实施例3balb/c小鼠的免疫

通过ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站下载1-6基因型hcv序列共536条，通过在网站https://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/上进行序列分析获得hcv包膜蛋白高度保守区域的肽段502-518；同时由于685-693位于包膜蛋白的跨膜区，并不暴露在外，理论上不会产生中和性抗体，在本发明实验中作为阴性对照肽段使用。

将肽段502-518及阴性对照肽段685-693在上海吉尔生化公司合成，纯度高达99％以上，并与klh偶联，作为免疫抗原。

2个肽段免疫抗原各免疫6只8-10周龄的balb/c小鼠，同时设置未经免疫的阴性对照小鼠6只，具体免疫流程及抗原、佐剂剂量见表1，腹腔或皮下多点注射，商品化福氏完全佐剂在使用前须振荡、摇晃，使沉淀的分枝杆菌充分混匀，要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状混合物，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。

免疫过程中，通过眼眶采血elisa监测抗体的产生滴度。在第9周，处死小鼠，采血后将血清倍比稀释检测抗体滴度；并纯化抗体igg检测其对1-6基因型hcvcc的中和活性。

表1balb/c小鼠免疫3个多肽抗原的流程

实施例4对小鼠血清抗体的elisa检测

对小鼠血清抗体的elisa检测，具体操作步骤如下：

(1)包板：将链霉亲和素溶解在ph值为9.6的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中，终浓度为10μg/ml，将链霉亲和素溶液包被在96孔酶联免疫吸附板上，100μl/孔，4℃过夜。第二天磷酸盐平衡生理盐水(pbs)洗板三次，300μl/孔，5分钟/次；

(2)封闭：每孔200μl封闭液(体积分数为10％的山羊血清-pbs)，37℃封闭1小时，pbs洗板三次，300μl/孔，5分钟/次；

(3)肽段结合：100μl的10μg/ml生物素标记肽段加入至96孔板，37℃孵育2小时，pbs洗板三次，300μl/孔，5分钟/次；

(4)待测抗体结合：将100μl不同稀释度(pbstg稀释：含0.05％tween20和10％山羊血清的pbs)的小鼠血清加入至96孔板，37℃孵育2小时，每份血清均设3个平行孔，同时设正常鼠对照血清及不加血清的空白组，其中，pbst(含0.05％tween20的pbs)洗板4次，300μl/孔，5分钟/次；

(5)二抗结合：100μl/孔辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg抗体(1/5000，pbstg稀释)加入至96孔板，37℃孵育1小时，pbst洗板4次，300μl/孔，5分钟/次。

(6)显色：将邻苯二胺盐酸盐底物溶解在枸橼酸盐缓冲液(0.05m)中，终浓度为0.4μg/ml，加入40μl浓度为3％的h2o2，混匀后立即加入至96孔板中，100μl/孔，室温反应30分钟，100μl/孔2nhcl终止反应；

(7)读数：反应终止后，以瑞士tecan公司elisa读板机读取od值，记录读数。

结果显示：肽段502-518及阴性对照肽段aa685-693均成功诱导了各自的特异性抗体的产生。小鼠免疫第9周采取的血清结合肽段抗原的elisa检测的od值见图1-图2。

实施例5小鼠血清抗体igg的纯化

为了明确肽段502-518免疫确实产生了具有中和活性的抗体，并排除血清内其他因子对实验结果可能造成的影响。我们将血清igg纯化并进行中和试验。纯化小鼠血清采用美国promega公司的magne^tmproteingbeadsforantibodypurification试剂盒(cat.g7471)，操作按照生产商提供的说明书进行操作。

实施例6hcv细胞感染模型(hcvcc)的培养

本实验所用hcvcc毒株及其基因型包括tncc(1a)，j6/jfh1(2a)，s52(3a)，ed43(4a)，sa13(5a)和hk6a(6a)。其培养及收集方法如下：

(1)种板：将huh7.5细胞接种至25t细胞培养瓶中，2×10⁶个细胞/瓶，放入细胞培养箱，第二天细胞密度为50％左右时进行感染；

(2)感染：将来自于各基因型的全长hcvrna转染huh7.5细胞的培养上清加入至25t细胞培养瓶中，感染复数(mutiplicityofinfection)为0.01，感染后的细胞每隔3天传代一次，按1:3比例传代；

(3)收集病毒：感染后14天，收集细胞培养上清，4000转/分钟4℃离心5分钟，0.45μm滤器过滤后，将过滤液收集，-80℃保存。

实施例7小鼠血清igg对不同基因型hcvcc的中和活性

(1)种板：将huh7.5细胞接种至96孔板，密度为6×10³/孔，放入细胞培养箱，第二天进行感染；

(2)感染：将100ffu不同基因型的hcvcc与不同浓度梯度(从100μg/ml开始2倍稀释至0.05μg/ml)的小鼠igg混合，37℃孵育1小时；孵育完成后，将混合液加入至96孔板板孔中，100μl/孔，每个稀释浓度做2个平行孔；37℃孵育6小时后，将混合液吸净，换成新鲜完全培养基，37℃孵育48小时；

(3)甲醛固定：吸去板孔中的培养基，pbs洗1遍，300μl/孔，4％多聚缓冲甲醛4℃固定15分钟；

(4)细胞打孔：0.5％tritonx-100-pbs缓冲液加入至板孔中，室温孵育20分钟，0.05％tween20-pbs洗板3遍，每次5分钟；

(5)封闭：5％bsa-0.05％tween20-pbs封闭液加入至板孔中，室温孵育2小时。0.05％tween20-pbs洗板3遍，每次5分钟；

(6)一抗结合：1:150一抗(5％bsa-0.05％tween20-pbs封闭液稀释)加入至板孔中，室温孵育2小时，0.05％tween20-pbs洗板4遍，每次5分钟；

(7)二抗结合：1:200二抗(5％bsa-0.05％tween20-pbs封闭液稀释)加入至板孔中，室温孵育2小时，0.05％tween20-pbs洗板4遍，每次5分钟；

(8)荧光显微镜观察：荧光显微镜下观察ffu个数，计算感染率和小鼠igg中和的ic50。

结果：肽段502-518产生的抗血清均可有效阻断hcv的感染，而阴性对照肽段685-693产生的抗体不能阻断感染(图3)。进一步纯化肽段502-518免疫小鼠所诱导的血清igg，对1-6基因型hcvcc均表现出了不同程度的中和活性(图4-图9)，表明肽段502-518可以有效诱导针对hcv包膜蛋白的保护性体液免疫反应。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围，均在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>广州市第八人民医院

<120>hcv包膜蛋白高度保守区域的肽段502-518及其用途

<130>2018.9.6

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17

<212>prt

<213>丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus)

<400>1

valcysglyprovaltyrcysphethrproserprovalvalvalgly

151015

thr