一种微藻藻株人工选育方法
【技术领域】
[0001]本专利属于微藻培养技术领域(C12N1/12),是一种微藻藻株人工选育方法。
【背景技术】
[0002]微藻为自养型微生物，因其细胞内存在光合作用系统也称为微藻植物。微藻具有高效吸收太阳能、固定二氧化碳产生生物质的能力(即光合作用能力)；同时微藻作为微生物的一种，其增殖速度较快。作为单细胞生物，微藻的主要组成为蛋白、脂肪、碳水化合物和核酸等。目前，微藻已经是重要的养殖饵料被养殖企业广泛应用，同时微藻也已经成为类胡萝卜素、蛋白质、多糖等保健食品的来源。随着化石能源枯竭的预期加剧，微藻在能源制品和精细化学品的潜在应用也得到了极大关注。
[0003]目前，实际生产应用的藻种多从自然界直接分离获得，后代的性状单一，容易出现对环境的适应能力差以及藻种退化等问题。以传统的方法进行藻种的复壮或重新选育优良藻株，往往需要较长的周期和花费大量的人力。为了获得高产及满足下游炼制需求的藻株，必须改进微藻的育种技术，从而对微藻的种质进行改良。
[0004]常压室温等离子体(ARTP)是近几年来发展起来的一种新的等离子体源，能够在常压(Iam)下产生温度在25?40°C之间的、具有高活性粒子(如处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流。科学研究表明，等离子体中适当剂量的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生致畸突变。
[0005]常规微藻藻株筛选也是一个耗时较长的工作，因为大多检测方法都是基于获得一定生物量基础上开展的。如，常规的微藻油脂评估至少需要数百毫升微藻藻液，从固体平板至所需要生物量平均需要一个月的培养时间。而同时，诱变筛选可能获得上百个备选藻株，因此，适宜的诱变后筛选技术也是微藻藻株选育的重要一环。
[0006]随着各种染色方法灵敏度的提高，利用染色法对微藻生物质进行评估需要生物量大大少于常规方法，为提高筛选提供了可能，如，碘液可以对细胞内的淀粉进行染色，以荧光染料尼罗红可以对细胞内的中性脂进行染色等。
[0007]因此，基于上述分析，本发明提出了一种新型微藻藻株人工选育方法，将等离子体诱变与基于染色的快速筛选相结合，具有高效、快速获得目标藻株的特点。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种微藻藻株人工选育方法。
[0009]野生藻株的驯化和改良是微藻工业化生产实现所必需的，为了提高微藻藻株选育的速度，本发明结合了绿色无污染的常压室温等离子体诱变、基于吸光度与特异性荧光染料荧光强度变化的藻株筛选技术，实现目标藻株高效、快速获得的目的。
[0010]本发明利用常压室温等离子体对野生藻株进行诱变，即使用室温常压等离子体仪对微藻培养液进行诱变。其中待诱变微藻细胞浓度在100-1000万细胞/毫升，诱变微藻藻液在10?200 μ L，电源输出功率为50?200W，工作气流量为I?20SLM，等离子体发射源与样品之间距离为I?1mm,放电时间5秒?2分钟。
[0011]所述诱变操作结束后，将诱变处理后的微藻涂布于固体培养基上，在选择压力(温度、光强、缺陷培养基)或正常培养条件下进行培养，同时以未诱变处理的藻液作为对照。诱变成功的判定标准:对于正常培养条件下，至藻落生长出后，分别对诱变和对照组进行藻落计数，以致死率=(1-诱变藻落数/对照藻落数)X 100%大于或等于90%为成功诱变的指标，对生长出诱变藻落进行96孔板培养筛选；对于选择压力下，生长出的藻落即用于96孔板培养筛选。
[0012]所述藻落在96孔板中进行液体培养，利用酶标仪或者具有孔板扫描功能的分光光度计对孔板培养的微藻OD值进行测定，获得藻细胞生长情况。根据不同微藻藻株可选用不同的检测波长，如金藻通常使用650?680nm检测，绿藻通常使用750nm检测。
[0013]所述液体培养微藻通过特异性染色剂进行染色，以显色强弱对目标代谢物生产情况进行检测。通常利用碘液对细胞内淀粉进行染色，以荧光染料尼罗红或者BODIPY对细胞内中性脂或者油脂进行染色。
[0014]最终，根据筛选目的，结合生长于代谢物生产情况，确定对应的诱变藻株，用于后续研究或生产实践。
[0015]本发明是在室温、大气压、低电压环境下使用等离子体对微藻进行诱变，避免了常规物理化学诱变方法的毒性或强细胞损伤，同时处理时间短，诱变处理过程仅有几分钟；利用96孔板培养作为筛选基础，将OD检测与特异性显色反应结合，避免了常规检测过程中需要较长培养时间以获得足量生物质的弊端，同时可对大量藻株进行测定，从藻落到初步筛选出目标藻株的时间缩短至一周左右。因此本发明相对常规微藻藻株选育是一种绿色、高效、快速的新方法。
【附图说明】
[0016]图1湛江等鞭金藻诱变处理时间与致死率曲线。
[0017]图2野生株与23株诱变藻株的相对生长速度。
[0018]图3诱变藻株相对野生株的相对生长速率与相对单位OD尼罗红荧光强度。
[0019]图4以耐高温和高油脂为目标的诱变藻株筛选。
【具体实施方式】
[0020]实施例1:
[0021]以湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis FACHB-1750,保藏于中国科学院武汉水生生物所藻种保藏中心)为对象，利用清华大学化学工程与工程物理系联合研制的常压室温等离子体育种机(ARTP)进行金藻的诱变。
[0022]1、将湛江等鞭金藻培养液浓度调整至100?1000万细胞/毫升，取10?200微升藻液放到载片上。
[0023]2、将载片放置在载台上，调整射流出口与载片的距离小于等于10mm。
[0024]3、电源输出功率为50?200W，工作气流量为I?20SLM，放电时间5秒?2分钟。
[0025]4、将载片用800微升金藻培养液(天然海水+F/2培养基)冲洗，并尽可能全部回收培养液，用于后续的固体培养基涂布。
[0026]5、在固体F/2培养基上涂布回收的不同处理条件下的诱变藻液,放置于25度,光照周期14h: 10h，光强50 μ Em-2S-1培养箱中进行培养。以同体积未诱变处理的藻作为对照在固体培养基上培养。
[0027]6、经过三至四天，可见固体培养基上生长出单个藻落。以致死率大于等于90%为标准，将该条件下固体培养基上的微藻藻落转移至96孔板中，每个藻落占用I个孔，孔中预先加好100微升金藻培养液。将96孔板放置于25度,光照周期14h:1Oh,光强50 μ EnT2S4培养箱中进行培养。
[0028]7、每天利用酶标仪在655nm处进行OD测定。
[0029]8、按照标准的尼罗红染色条件对孔板培养的金藻进行染色，使用具有孔板扫描功能的荧光分光光度计进行检测，用于检测细胞内中性脂含量。
[0030]9、根据OD变化进行最大比生长速率计算，同时，计算单位OD下的尼罗红荧光，并根据最大比生长速率和单位OD下尼罗红荧光为指标，确定候选诱变藻株，进行后续生产或研究工作。其中，处理时间与致死率关系、相对生长速率以及相对单位OD尼罗红荧光强度值见附图1?3。
[0031]实施例2:
[0032]诱变等操作同实施例1，以耐高温为目标进行筛选，将诱变后涂完的平皿置于36°C培养；光强为30?50 μ mo I.πΓ2.s_\光暗比为14:10。
[0033]最终获得9株耐高温和高油脂含量藻株，其中对照为正常培养条件下的野生株。
[0034]实施例3:
[0035]高产淀粉海洋绿藻亚心形四月藻(Tetraselmis subcordiformisFACHB_1751,保藏于中国科学院武汉水生生物所藻种保藏中心)藻株选育。以150万细胞/毫升四月藻进行诱变，等离子体发射源与样品之间距离为2mm，培养液为天然海水+康维方营养盐，诱变时间30s。诱变后将四月藻藻液稀释一万倍，涂康维方固体平板。其它操作同实施例1。
[0036]经过诱变，致死率为99.6%。诱变藻株的淀粉含量以碘染显色值为指标进行考察。
【主权项】
1.一种微藻藻株人工选育方法，，其特征在于:包括微藻藻株常压室温等离子体诱变和基于吸光度与特异性荧光染料荧光强度变化的藻株筛选流程，具体操作包括: (1)利用常压室温等离子体对天然藻株进行诱变:使用室温常压等离子体仪对微藻培养液进行诱变； (2)将诱变处理后的微藻涂布于固体培养基上，在选择性压力条件下或正常培养条件下进行培养，同时以未诱变处理的藻液作为对照，对于正常培养条件下，至藻落生长出后，分别对诱变和对照组进行藻落计数，以致死率=(1-诱变藻落数/对照藻落数)X 100%大于或等于90%为成功诱变的指标，对生长出诱变藻落进行96孔板培养筛选；对于选择压力下，生长出的藻落即用于96孔板培养筛选； (3)利用酶标仪或者分光光度计对孔板培养的微藻OD值进行测定，获得藻细胞生长情况； (4)利用染料对孔板中液体培养的微藻细胞进行染色，测定细胞内代谢物的积累情况； (5)以生长速度变化或代谢物含量变化情况为指标，最终确定目标藻株。
2.按照权利要求1中所述微藻藻株人工选育方法，其特征在于:天然藻株包括绿藻、金藻、硅藻单细胞藻类或者螺旋藻。
3.按照权利要求1所述微藻藻株人工选育方法，其特征在于:待诱变微藻细胞浓度在100-1000万细胞/毫升，诱变微藻藻液在10?200 μ L，电源输出功率为50?200W，工作气流量为I?20SLM，等离子体发射源与样品之间距离为I?10mm，放电时间5秒?2分钟。
4.按照权利要求1所述微藻藻株人工选育方法，其特征在于:正常培养条件为目标微藻常规培养条件；选择压力性条件为根据期望诱变藻株所具有的特点，在正常培养条件下，升高或降低温度，增强或减弱光照，使用营养缺陷型培养基或含有重金属离子、含卤素有机化合物、烃类化合物或抗生素的培养基。
5.按照权利要求1所述微藻藻株人工选育方法，其特征在于:根据期望得到的诱变藻株性状，以生长速度提高或降低、在选择性压力条件下能够存活以及细胞内目标代谢物的含量闻低为指标，确定最终的目标操株。
【专利摘要】本发明涉及一种微藻藻株人工选育方法，包括微藻藻株常压室温等离子体诱变和基于吸光度与特异性染料发光强度变化的藻株筛选流程。本发明的特征是将常压室温等离子体诱变技术、基于吸光度的微藻生长测试和基于荧光染料的微藻油脂评估方法结合，相对于已有微藻藻株选育方法，具有高效、快速获得目标藻株的特点。
【IPC分类】C12N13-00, C12N15-01, C12R1-89
【公开号】CN104711249
【申请号】CN201310691127
【发明人】薛松, 艾江宁, 曹旭鹏
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年12月13日