一种液态发酵制备高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的方法与流程

本发明涉及高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的液态发酵综合开发应用领域，特别涉及一种液态发酵制备高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的方法。

背景技术：

铁皮石斛(dendrobiumofficinalekimuraetmigo)是一种重要的药用兰花，在世界各地的传统草药制剂和药典中具有重要意义。最近，来自铁皮石斛的多糖由于其重要的生物学特性引起了人们的特别关注，如体外免疫调节和体内、改善肺功能、维持结肠健康、抗肿瘤、抗氧化、抗诱变活性等。由于其广泛的生物学特性，铁皮石斛被广泛用作药物、营养品和食品中的有效成分。然而，对这些极为稀缺的野生资源的需求日益增加，导致其过度开发和栖息地受损，这使得重要的兰花物种目前面临灭绝的威胁。同时，不断增长的需求也导致价格急剧上涨，因此越来越多的研究人员开始关注铁皮石斛。然而，迄今为止，关于从铁皮石斛分离的内生真菌的多糖可以获得有限的信息，以改变当前的情况，例如供应短缺和植物资源的高价格。

当植物内生真菌在宿主植物的细胞间和/或细胞内健康组织中定殖时，一些内生真菌可以产生与宿主相同或相似的次级代谢产物。研究发现，红豆杉(taxusbrevifolia)的韧皮部(内皮)分离出的真菌内生菌taxomycesandreanae产生的紫杉醇和相关化合物也是短叶红豆杉(taxusbrevifolia)的主要生物成分。根据上述理论和实践，本发明从铁皮石斛中分离内生真菌，具有生产生物多糖的能力，并对其液体发酵培养基进行优化，提高内生真菌多糖的产量，为以后工业化生产奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种液态发酵制备高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的方法。本发明的铁皮石斛内生真菌多糖所采用的基础培养基为pdb培养基，补充添加成分为葡萄糖，酵母粉，kcl和kh2po4，在此条件下，发酵结束后，经过浓缩、醇沉、提取、纯化得到4种多糖组分：dy1、dy2、dg1、dg2，得到的多糖组分不仅产量高而且具有很强的免疫活性。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

一种液态发酵制备高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的方法，包括以下步骤：

(1)将活化后的铁皮石斛内生真菌种子液接种到已灭菌的添加了葡萄糖、酵母粉、kcl和kh2po4的马铃薯葡萄糖水(pdb)培养基中发酵培养；

(2)将步骤(1)所得发酵液过滤、浓缩、醇沉、透析、纯化后得到铁皮石斛内生真菌多糖。

优选的，步骤(1)所述活化所用的培养基为ph6.0-6.5的pdb培养基。

优选的，步骤(1)所述活化25-28℃活化5-7d。

进一步优选的，活化的条件为28℃、160rpm、5d。

优选的，步骤(1)所述铁皮石斛内生真菌为fusariumsolanido7，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctccno:m2017145，保藏日期为2017年3月27日，专利申请号为201710512714.4。

优选的，步骤(1)中，活化后的铁皮石斛内生真菌种子液接种量为15-20vol％。

优选的，步骤(1)中，添加了葡萄糖、酵母粉、kcl和kh2po4的pdb培养基的ph为6.0-6.5。

优选的，步骤(1)中，pdb培养基添加了9.0-9.8g/l葡萄糖，0.60-0.69g/l酵母粉，0.01-0.05g/lkcl和0.01-0.05g/lkh2po4。

优选的，步骤(1)中，采用1mhcl调整pdb培养基的ph为6.5。

优选的，步骤(1)所述灭菌的条件为121℃灭菌20min。

优选的，步骤(1)所述发酵培养的温度为26-28℃。

优选的，步骤(1)所述发酵培养的时间为13-15d。

进一步优选的，液体培养基培养条件为：28℃，13d，pdb培养基添加了9.8g/l葡萄糖，0.69g/l酵母粉，0.05g/lkcl和0.05g/lkh2po4。

优选的，步骤(2)中，将醇沉后的粗多糖配置为0.1-0.2g/ml的溶液，然后采用sevage法脱除蛋白和色素、deae-52纤维素树脂和sephadexg-200葡聚糖凝胶进一步纯化。

进一步优选的，醇沉后的粗多糖配置为0.2g/ml的溶液。

进一步优选的，已收集的粗多糖经sevage法(氯仿：正丁醇＝5：1，v/v)脱除蛋白，对收集的洗脱组分减压浓缩，收集洗脱液于紫外可见分光光度计进行扫描，确认蛋白和色素已被去除。其中采用ab-8大孔吸附树脂脱除蛋白和色素，避免了使用有机溶剂脱除蛋白质造成的危害。

进一步优选的，对脱除蛋白和色素的组分进一步采用deae-52纤维素阴离子交换树脂进行纯化，洗脱液分别为0、0.2、0.4、0.6m的nacl溶液，苯酚硫酸法检测洗脱液中多糖浓度，根据苯酚硫酸法测定的吸光度变化绘制洗脱曲线，得到不同多糖组分，合并相同组分的收集管浓缩后，蒸馏水透析(截留分子量3500da)48h，去除nacl,减压浓缩，得到不同的纯化组分dy1、dy2、dg1、dg2。

进一步优选的，采用sephadexg-200对所得到dy1、dy2、dg1、dg2进一步纯化，确定其是否为单一多糖组分，洗脱液为蒸馏水，苯酚硫酸法跟踪监测所收集的组分。

优选的，发酵完成后，过滤，减压浓缩，5000rpm离心5min，流水透析72-80h(透析袋截留分子量3500da),减压浓缩，即得固态发酵粗多糖。

一种液态发酵制备高活性铁皮石斛内生真菌多糖的方法，包括以下步骤：

(1)将活化的fusariumsolanido7菌株接种于已灭菌的液态培养基中，培养后过滤、浓缩、醇沉、提取、纯化后获得纯化多糖组分，收集纯化多糖组分；

(2)取对数生长期的raw264.7细胞，调整密度为2×105/ml，加到96孔板，37℃、5％co2贴壁培养24h后，吸取培养液，分别加入纯化的多糖组分dy1、dy2、dg1、dg2(62.5、125、250、500、1000μg/ml)、20ng/ml的脂多糖lps，每个样本设置3个平行组，封口膜封好板后置于37℃、含5％co2恒温培养箱孵育24h，收集上清液；

(3)根据grisee试剂盒说明取已收集的上清液100ul于96孔板，加入等体积的grisee试剂混合，室温下震荡反应10min后在540nm波长处测定吸光度，根据no2-标准曲线计算上清液中no释放量；

根据elisa试剂盒说明测定已收集上清液的细胞因子(tnf-α、il-6)的释放量。

进一步地，步骤(2)中在对raw264.7细胞加药之前，首先通过mtt(四甲基偶氮唑蓝)比色法进行细胞毒性试验，检查内生真菌多糖组分的细胞毒性，即对raw264.7细胞的生长抑制作用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明采用pdb培养基补充葡萄糖，酵母粉，kcl和kh2po4进行多糖发酵，产物产量、活性均有提高，制备过程绿色、环保。

(2)本发明制备方法工艺简单易行，条件温和，设备要求低，为实现铁皮石斛内生真菌多糖的有效综合开发应用提供了新途径。

附图说明

图1a、图1d是在补充成分的pdb培养基发酵获取的粗多糖经deae-52纯化的曲线图。

图1b、图1c、图1e、图1f在补充成分的pdb培养基发酵获取的粗多糖经sephadexg200纯化的曲线图。

图2a-图2e分别是气相色谱法测定所获取单糖标准曲线、纯化多糖组分dy1,dy2,dg1,dg2的单糖组成图。

图3a-图3d分别是气相色谱法测定所获取纯化多糖组分dy1,dy2,dg1,dg2的分子量图。

图4a-图4e分别是纯化的多糖组分对小鼠巨噬细胞raw264.7的细胞毒性，细胞增殖，细胞因子il-6，tnf-α,no的影响柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的描述，但本发明并不局限于此。

实施例1

(1)铁皮石斛内生真菌fusariumsolanido7在ph6.5的pdb培养基中28℃活化培养5d，得到发酵菌种种子液；

(2)根据确定的组成配置pdb发酵培养基并添加9.8g/l葡萄糖，0.69g/l酵母粉，0.05g/lkcl和0.05g/lkh2po4，1mhcl调整ph6.5,分装到1l的锥形瓶中，每瓶200ml，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种15％(v/v)的种子液，28℃发酵13天；待发酵完成后，过滤、浓缩、醇沉、透析、浓缩、冻干得到粗多糖样品，产量2.92±0.36g/l；

(3)将得到的粗多糖样品用蒸馏水溶解为2mg/ml的溶液，采用sevage法脱除蛋白(氯仿：正丁醇＝5：1，v/v)和色素，全波长扫面检测蛋白和色素脱出效果，然后减压浓缩得脱蛋白色素的粗多糖；然后采用deae-52纤维素阴离子交换树脂纯化粗多糖，洗脱液为浓度0、0.2、0.4、0.6、0.8的nacl溶液，自动收集器收集不同浓度的洗脱液，苯酚硫酸法检测洗脱液多糖浓度，绘制洗脱曲线，得到多糖组分dy1、dy2、dg1、dg2，对得到的组分采用sephadexg-200进一步纯化，确定deae-52纯化的组分为单一组分(见图1a-图1f)；对收集到的多糖组分采用气相色谱法测定其分子量及单糖组成(见图2a-图2e，图3a-图3d)，结果表明dy1、dy2、dg1、dg2单糖组成分别为鼠李糖：木糖：葡萄糖：半乳糖＝1.5:1.7:4.1:3.9，鼠李糖：阿拉伯糖：葡萄糖：半乳糖＝1.7:1.3:3.4:2.9，阿拉伯糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝1:2.1:3.2:2.8，阿拉伯糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝1:2.8:1.9:4.3；分子量分别为：1.3kda，174.6kda，147.3kda，152.8kda。

(4)取已传代培养2～3代的小鼠单核巨噬细胞raw264.7通过mtt比色法测定多糖纯化组分dy1、dy2、dg1、dg2对其生长抑制作用，结果表明所得多糖组分对raw264.7几乎无抑制作用，即无明显的细胞毒性(见图4a-图4e)，可进行后续实验研究；然后评价所得纯化组分对raw264.7细胞的增殖活性及免疫活性的影响，结构表明不同浓度的多糖组分均能促进raw264.7细胞的增殖；并且均能不同程度激活raw264.7细胞分泌肿瘤坏死因子(tnf-α)、白细胞介素-6(il-6)，表明dgs1和dgs2具有较高的增强机体免疫的作用。

实施例2

(1)铁皮石斛内生真菌fusariumsolanido7在ph6.5的pdb培养基中28℃活化培养5d，得到发酵菌种种子液；

(2)配置pdb发酵培养基，1mhcl调整ph6.5,分装到1l的锥形瓶中，每瓶200ml，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种15％(v/v)的种子液，28℃发酵13天；待发酵完成后，过滤、浓缩、醇沉、透析、浓缩、冻干得到粗多糖样品，产量2.42±0.36g/l，本实施例的多糖产量明显低于补充添加9.8g/l葡萄糖，0.69g/l酵母粉，0.05g/lkcl和0.05g/lkh2po4的发酵培养基。

实施例3

(1)铁皮石斛内生真菌fusariumsolanido7在ph6.5的pdb培养基中26℃活化培养5d，得到发酵菌种种子液；

(2)根据确定的组成配置pdb发酵培养基并添加9.8g/l葡萄糖，0.69g/l酵母粉，0.05g/lkcl和0.05g/lkh2po4，1mhcl调整ph6.5,分装到1l的锥形瓶中，每瓶200ml，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种15％(v/v)的种子液，28℃发酵13天；待发酵完成后，过滤、浓缩、醇沉、透析、浓缩、冻干得到粗多糖样品，产量2.13±0.24g/l；多糖产量明显低于种子培养基在28℃培养时的产量(≤2.92±0.36g/l)。

实施例4

(1)铁皮石斛内生真菌fusariumsolanido7在ph6.5的pdb培养基中28℃活化培养7d，得到发酵菌种种子液；

(2)根据确定的组成配置pdb发酵培养基并添加9.8g/l葡萄糖，0.69g/l酵母粉，0.05g/lkcl和0.05g/lkh2po4，1mhcl调整ph6.5,分装到1l的锥形瓶中，每瓶200ml，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种15％(v/v)的种子液，28℃发酵13天；待发酵完成后，过滤、浓缩、醇沉、透析、浓缩、冻干得到粗多糖样品，产量2.77±0.13g/l；多糖产量与种子培养基培养5d时的产量(≤2.92±0.36g/l)无显著性差异(p＞0.05)，所以从成本效益考虑选取种子培养基培养时间为5d。

实施例5

(1)铁皮石斛内生真菌fusariumsolanido7在ph6.5的pdb培养基中26℃活化培养5d，得到发酵菌种种子液；

(2)根据确定的组成配置pdb发酵培养基并添加9.8g/l葡萄糖，0.69g/l酵母粉，0.05g/lkcl和0.05g/lkh2po4，1mhcl调整ph6.5,分装到1l的锥形瓶中，每瓶200ml，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种15％(v/v)的种子液，28℃发酵15天；待发酵完成后，过滤、浓缩、醇沉、透析、浓缩、冻干得到粗多糖样品，产量2.82±0.25g/l；多糖产量与发酵时间为13天时产量稍低，但无明显差别(≤2.92±0.36g/l)，所以选取发酵时间为13d。

实施例6

(1)铁皮石斛内生真菌fusariumsolanido7在ph6.5的pdb培养基中26℃活化培养5d，得到发酵菌种种子液；

(2)根据确定的组成配置pdb发酵培养基并添加9.8g/l葡萄糖，0.69g/l酵母粉，0.05g/lkcl和0.05g/lkh2po4，1mhcl调整ph6.5,分装到1l的锥形瓶中，每瓶200ml，封口后121℃灭菌20min，取出后冷却，接种15％(v/v)的种子液，26℃发酵15天；待发酵完成后，过滤、浓缩、醇沉、透析、浓缩、冻干得到粗多糖样品，产量2.62±0.25g/l；多糖产量与发酵时间为13天时的产量有显著差异(≤2.92±0.36g/l)，且偏低，所以选取发酵时间为13d。