梅毒螺旋体(TP)-PCR荧光检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，更具体涉及利用实时荧光pcr技术检测梅毒螺旋体pola基因的试剂盒。
背景技术：
：螺旋体是梅毒的病原体，传染性极强，主要传播方式为性行为传播和母婴传播，也可经血液传播，甚至有报道也可通过其他间接途径传播，如被梅毒患者分泌物污染过的毛巾、衣被、马桶圈等。现今梅毒感染率已经是90年代的25倍；近年来，在我国，梅毒感染率以及梅毒与hiv的合并感染率都处于逐年上升态势，这种上升态势尤其表现在青年群体中。仅2018年7月，全国(不含港澳台)梅毒发病数为48206例，居甲乙类传染病合计发病数前三。梅毒感染人体所引起的一种系统性、慢性性传播疾病，可引起人体多系统多器官的损害，产生多种临床表现，导致组织破坏、功能失常，甚至危及生命。根据其感染途径可分为先天性梅毒(胎传梅毒)和后天性(获得性)梅毒；根据病程又可分为ⅰ期、ⅱ期、ⅲ期梅毒；神经系统受累的病例不按分期计为神经梅毒。由于梅毒螺旋体的活性与人体抵抗力之间的关系密切，临床表现为潜伏状态和显发症状交替出现的迁延状态。梅毒侵入人体后，经过2-4周的潜伏期，在此期间，梅毒螺旋体在入侵部位大量繁殖，通过免疫反应引起侵入部位出现破溃，即硬下疳；由于局部免疫力的增强，硬下疳经3-8周可自行消失；硬下疳产生的同时，梅毒螺旋体可侵入附近的淋巴结，再经血液播散到全身其他组织和器官。梅毒早发现的意义：①有过不洁性行为或者其他可能感染梅毒的高危行为的群体以及临床疑似患者，在血清学检测的窗口期，思想负担大，恐惧心理重，给心理健康造成了极大的危害，甚至影响工作、学习和生活；②患者在一期梅毒的感染阶段，在血清学检测的窗口期，可能无意间会将梅毒通过性行为传染给性伴，或者通过输血行为传染给用血者，或者通过其他间接方式传染给他人；尤其在硬下疳的皮损产生后，患者梅毒的传染性极强；③妊娠梅毒是孕期发生的显性或隐性梅毒，极有可能传染给胎儿，造成死胎、畸形胎或者梅毒儿，但若在血清学检测的窗口期之前能够早发现早治疗，则可以尽可能大的减少对胎儿的损伤；若在哺乳期感染梅毒，在血清学检测的窗口期中，通过哺乳也极有可能无意间传染给婴儿。另外，梅毒感染脑血管和中枢神经后引发的神经梅毒，这在感染初期就有可能发生，神经梅毒会让人产生幻觉，外在表现为行为暴力，语无伦次等，梅毒的早发现早治疗将会减小这一风险。最后，尽管药物可以治疗梅毒，却无法修复已经造成的身体损伤，所以梅毒早发现早治疗的原则可以尽可能的减少身体损伤的发生。梅毒是可以完全治愈的，但需要强调早期发现积极治疗。因梅毒可产生多种多样的临床症状和体症，其诊断依赖于实验室检查结果，而主要的实验室检查方法为血清学检查。血清学检查在一期梅毒中存在窗口期，即梅毒感染之后到机体产生特异性抗体之前的时期，此期内，实时荧光pcr检测的灵敏度高于血清学检查(硬下疳皮损产生同时荧光pcr检测即为阳性)；此外，非梅毒螺旋体血清学试验中(如rpr)非特异性抗体的产生也可由免疫接种，慢性肝病，其他免疫系统疾病等引起，假阳性率较高，且存在前带现象和血清固定现象；而梅毒螺旋体血清学试验中(如tppa)特异性抗体一旦产生即终身存在，无法判断是否为现行感染，也无法进行疗效观察，且在继发性梅毒感染患者中，其临床辅助诊断的参考意义不大。荧光pcr检测梅毒螺旋体具有检出时间早的优势，其在一期梅毒的检测灵敏度，居数种临床检测方法中最高；再者，根据体内病原体拷贝数的高低和复制情况，有助于判断疾病阶段，选择治疗方案及检测治疗效果等。此时，梅毒螺旋体(tp)-pcr荧光检测方法就显示出独特价值。因此，梅毒螺旋体(tp)-pcr荧光检测试剂盒能够很好地补充血清学方法的不足之处，检测结果可用于梅毒感染的早期诊断、临床辅助诊断、联合筛查、治疗方案的选择、疗效观察等多个领域。技术实现要素：本发明选用梅毒螺旋体的polya基因作为扩增靶序列，设计特异性引物和荧光探针。pola基因(dnapolymeraseⅰgeneoft.pallidum)，是梅毒螺旋体的持家基因，序列具有高度的保守性，其特别功能区，有丰富的半胱氨酸(绝大多数微生物含量少)和四个独一无二的插入区，在dna复制与修复中起重要的作用。应用pola基因检测梅毒螺旋体，有较高的敏感性和特异性。本发明选用人的管家基因beta-actin作为内参，actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白，在不同物种之间高度保守；beta-actin广泛分布于各种组织细胞浆中，在各个组织细胞中都有表达且表达量差异不大，通常作为内参来使用。同时，本发明试剂盒中还添加了beta-actin的阳性对照品，可以有效减少试剂盒的人为误差，提高准确度。本发明提供了一种梅毒螺旋体(tp)-pcr荧光检测试剂盒，包括实时荧光pcr反应液，pcr反应酶预混液，内参阳性对照品；进一步地，所述实时荧光pcr反应液包括特异性扩增梅毒螺旋体pola基因的引物对及探针，引物1，其碱基序列为:5’-cgacaatgtgcctggtgt-3’(seqidno:1)；引物2，其碱基序列为:5’-gcatctttcttcccacacacta-3’(seqidno:2)，用于检测梅毒螺旋体核酸的mgbtaqman探针，其碱基序列为:5’-aagacggctgcacatc-3’(seqidno:3)，进一步地，还包括特异性扩增内参的引物对及探针，特异性扩增引物对包括引物4、5，引物4的碱基序列为：5’-caggagtatgacgagtccgg-3’(seqidno:4)，引物5的碱基序列为：5’-gcgcaagttaggttttgtc-3’(seqidno:5)，所述taqman探针的碱基序列为：5’-cggactatgacttagttgcg-3’(seqidno:6)；进一步地，所述内参阳性对照品含有beta-actin的基因片段，序列如seqidno:8所示。进一步地，所述的pola基因是梅毒螺旋体的持家基因，高度保守，应用pola基因检测梅毒螺旋体，有较高的敏感性和特异性。进一步地，所述的检测梅毒螺旋体的mgbtaqman探针的5’端设有荧光报告基团，3’端设有mgb修饰；所述的检测内参的taqman探针的5’端设有荧光报告基团，3’端设有荧光猝灭基团。进一步地，所述的荧光报告基团选自fam、vic、hex、rox、cy3或cy5，且检测梅毒螺旋体和内参探针中的荧光报告基团不同；所述的荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1和tamra中任一荧光淬灭基团。进一步地，所述检测梅毒螺旋体的引物浓度为5-20μm，探针浓度为1-10μm；所述的检测内参的引物浓度为5-20μm，探针浓度为1-10μm。进一步地，所述试剂盒还包括梅毒螺旋体的阳性对照品，及阴性对照品，所述的梅毒螺旋体的阳性对照品为含有合成的梅毒螺旋体pola基因的质粒，所述的阴性对照品为灭菌的生理盐水。进一步地，所述pcr反应酶预混液包括具有5’→3’dna聚合酶活性、5’→3’dna外切酶活性并耐热的dna聚合酶1u/μl-5u/μl以及尿嘧啶dna糖基化酶0.05u/μl-0.2u/μl。进一步地，所述的pcr反应预混液还包括含mg2+的缓冲液，以及dutp，datp，dctp，dgtp，采用dutp-ung防污染技术。本发明的目的是这样实现的：(1)针对梅毒螺旋体保守序列pola基因设计的能够与靶多聚核苷酸结合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针；(2)将寡核苷酸探针标记上荧光基团，使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多聚核苷酸间接结合；(3)选择适宜于pcr扩增的反应体系和荧光检测体系；(4)确定荧光发生基团所产生的荧光量，分析循环扩增后的荧光产生量以确定靶多聚核苷酸的存在；(5)设立内参、内参阳性对照、梅毒螺旋体阳性对照，及阴性对照，对试剂盒的检测稳定性和检测结果的有效性进行把控。根据本发明的一个优选实施方案，进一步包括：确定样品中的靶多聚核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数。根据本发明的一个优选实施方案，所述的试剂盒，梅毒螺旋体的靶多聚核苷酸序列为：caacggtggacggtcatgccaacacaattacttgatttgttctctctcatgggagattcctccgacaatgtgcctggtgtgagagggattggtcctaagacggctgcacatcttctccactgttttggcacacttgatggtatttatcgtcatacctattccttaaaagaagcgctgcgcacgaagatagtgtgtgggaagaaagatgcatttttttctcgttcactcattgagt(seqidno:7)。根据本发明的一个优选实施方案，所述的试剂盒，其特征在于扩增的内参beta-actin靶多聚核苷酸序列为：tcctcagatcattgctcctcctgagcgcaagtactccgtgtggatcggcggctccatcctggcctcgctgtccaccttccagcagatgtggatcagcaagcaggagtatgacgagtccggcccctccatcgtccaccgcaaatgcttctaggcggactatgacttagttgcgttacaccctttcttgacaaaacctaacttgcgcagaaaacaagatgagattggcatggctttatt(seqidno:8)。根据本发明提供的试剂盒，对梅毒螺旋体进行检测，该方法包括下列步骤：(1)用dna提取试剂进行待测样本(血浆和皮损渗出液)的dna提取。dna提取试剂可以使用成熟的dna提取方法和试剂盒。(2)将阴、阳性对照品和提取的待测样本的dna分别加入到含有核酸扩增反应体系的反应管中，进行pcr扩增，使用荧光定量pcr检测仪进行检测。(3)根据本发明提供的用于检测梅毒螺旋体的实时荧光pcr试剂盒，其中含有两条两端分别标记有荧光基团和mgb(或荧光猝灭基团)的特异性荧光探针，其设计为与靶序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’末端，而mgb(或荧光猝灭基团)则在3’末端。当探针完整时，5’端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端mgb基团(或荧光猝灭基团)，发生荧光共振能量转移，检测不到该探针5’端荧光基团发出的荧光；但在pcr扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，子链沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，taq酶的5’-3’外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)将探针5’端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3’端mgb基团(或荧光猝灭基团)的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。通过循环域值(ct，thresholdcycle)的大小可对样本中的梅毒螺旋体进行定性检测。(4)本试剂盒的结果判定原则为：阳性对照品，以及内参扩增的ct值<40，且有明显的s型扩增曲线，此次pcr反应结果有效；梅毒螺旋体靶基因扩增的ct值<38，且有明显的s型扩增曲线，判定为阳性结果；若38≤ct值＜40，且有明显的s型扩增曲线，判定为检测灰区，需重新检测；若ct值＝40或无ct值，判定为阴性结果。本发明所述的试剂盒，针对梅毒螺旋体检测中的特殊性，对核酸扩增反应体系中引物探针浓度、mg2+浓度以及反应的退火温度等均进行了优化，结合实时荧光pcr技术，用于梅毒螺旋体的定性检测，通过优化方案，反复实验，建立了体外定性检测梅毒螺旋体的方法，并研制出用于梅毒螺旋体体外定性检测的试剂盒，该试剂盒的检测的灵敏度可达到7copies/μl，即35copies/反应。本发明与现有技术相比，具有下列优点：(1)特异性更强，灵敏度更高，尤其是对一期梅毒的灵敏度，文献报道居数种临床检测方法最高；同时采用本发明的试剂盒，检测的灵敏度可达7copies/μl，即35copies/反应。(2)试剂盒采用阴、阳性对照品作为质控，能够对试剂盒的稳定性进行把控；还添加了内参的阳性对照品，依据本发明试剂盒的结果判断方法，可以有效提高检测的准确度。(3)全封闭反应，提取梅毒螺旋体dna后，直接用于pcr检测，避免了污染发生；(4)试剂盒采用dutp-ung防污染技术，可有效地消除或减弱因pcr产物污染造成的假阳性；(5)检测速度快，整个过程仅需1-2小时；(6)操作简单，可控性强，成本较低，可进行大批量样品检测，有利于产业化。附图说明图1显示本发明试剂盒对样本的检测曲线图，其中a：fam通道阈值线，b：vic通道阈值线。图2显示本发明试剂盒对梅毒螺旋体的灵敏度检测曲线图，结果表明试剂盒具有很高的灵敏度。图3显示利用本发明的试剂盒，检测的灵敏度可达7copies/μl，即35copies/反应。图4显示本发明试剂盒对梅毒螺旋体的特异性检测曲线图，结果表明试剂盒具有很高的特异性。实施方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1：梅毒螺旋体(tp)-pcr荧光检测试剂盒的制备及使用制备包括下列组成成分的试剂盒：实时荧光pcr反应液，pcr反应酶预混液，阳性对照品和阴性对照品。其中，实时荧光pcr反应液包括含有25mmmg2+的缓冲液和10mmdntps(含dutp)；一对特异性扩增梅毒螺旋体pola基因的引物和一条检测梅毒螺旋体pola基因的探针；以及一对特异性扩增内参beta-actin基因的引物和一条检测beta-actin基因的探针；其中，四条引物的碱基序列分别为seqidno.1，seqidno.2，seqidno.4和seqidno.5所示；探针的碱基序列为seqidno.3和seqidno.6所示。pcr反应酶预混液包括耐热性的taq酶和ung酶，所选taq酶具有5’到3’的端外切酶活性，浓度为1u/μl-5u/μl；ung酶为尿嘧啶-n-糖基化酶，浓度为0.05u/μl-0.2u/μl。阳性对照品包括内参阳性对照品和梅毒螺旋体阳性对照品，分别为含有beta-actin基因片段和含有梅毒螺旋体pola基因片段的质粒；阴性对照品为灭菌的生理盐水。本发明试剂盒的使用方法包括下列步骤：1、用成熟的dna提取方法或已商品化的试剂盒提取待测样本(血浆和皮损渗出液)中的dna。2、每个pcr反应管加入组分如表1中所示：表1：pcr反应液组分反应液组分加量(μl)/人份实时荧光pcr反应液19pcr反应酶预混液1模板(所提取的dna)5总体积25在荧光定量pcr扩增仪中扩增，按照下列程序进行pcr扩增：4、扩增结束后，根据荧光曲线和阈循环次数(ct值)判断是否感染梅毒螺旋体，扩增曲线如图1所示。5、质量标准评价：本试剂盒阴阳性对照应同时符合以下条件，否则判定实验无效。5.1阴性对照fam通道内应无典型扩增；5.2阳性对照fam通道内荧光曲线应呈“s”型曲线且ct≤38.0；vic通道内荧光曲线应呈“s”型曲线且ct≤35.0。6、结果判定：6.1tp阴性(低于检测限)：fam通道无典型“s”型扩增或ct>40.0；vic通道内荧光曲线呈“s”型曲线且ct≤35.0。6.2tp阳性：fam通道内荧光曲线呈“s”型曲线且ct≤38.0；vic通道内荧光曲线呈“s”型曲线且ct≤35.0。6.3样本检测灰区：fam道内荧光曲线呈“s”型曲线且38.0≤ct≤40.0，或vic通道内荧光曲线呈“s”型曲线且ct>35.0；建议复检。如复检曲线呈“s”型曲线且38.0≤ct≤40.0，且vic通道内荧光曲线呈“s”型曲线，ct≤35.0；判定为tp阳性。实施例2试剂盒的灵敏性试验为了检测本发明梅毒螺旋体(tp)-pcr荧光检测试剂盒的灵敏性，将合成的含有梅毒螺旋体pola基因的质粒梯度稀释后，用本发明试剂盒检测；每个浓度样品检测20次，95％检出阳性的最低浓度值为分析灵敏度。检测结果表明本发明试剂盒具有良好的灵敏性，并且ct值随浓度减少呈梯度改变，见图2。试验结果表明，本发明试剂盒对于梅毒螺旋体的诊断具有高度的灵敏性，可达7copies/μl，即35copies/反应，见图3。实施例3试剂盒的特异性试验为了检测本发明梅毒螺旋体(tp)-pcr荧光检测试剂盒的特异性，用本发明试剂盒检测临床常见干扰样本，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、尖锐湿疣赘生物、淋球菌、解脲支原体、白色念珠菌、阴道毛滴虫、沙眼衣原体、白假丝酵母菌、单纯疱疹病毒(hsv-2)、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌。检测结果表明：fam通道仅对梅毒螺旋体进行扩增，表明本发明检测试剂盒能特异性扩增梅毒螺旋体，而不与其它核酸发生交叉反应，见图4。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>江苏医诺万细胞诊疗有限公司<120>梅毒螺旋体(tp)-pcr荧光检测试剂盒<130>2018<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgacaatgtgcctggtgt18<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gcatctttcttcccacacacta22<210>3<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aagacggctgcacatc16<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4caggagtatgacgagtccgg20<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gcgcaagttaggttttgtc19<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cggactatgacttagttgcg20<210>7<211>235<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7caacggtggacggtcatgccaacacaattacttgatttgttctctctcatgggagattcc60tccgacaatgtgcctggtgtgagagggattggtcctaagacggctgcacatcttctccac120tgttttggcacacttgatggtatttatcgtcatacctattccttaaaagaagcgctgcgc180acgaagatagtgtgtgggaagaaagatgcatttttttctcgttcactcattgagt235<210>8<211>237<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tcctcagatcattgctcctcctgagcgcaagtactccgtgtggatcggcggctccatcct60ggcctcgctgtccaccttccagcagatgtggatcagcaagcaggagtatgacgagtccgg120cccctccatcgtccaccgcaaatgcttctaggcggactatgacttagttgcgttacaccc180tttcttgacaaaacctaacttgcgcagaaaacaagatgagattggcatggctttatt237当前第1页12