激活标签载体与罗布麻种子突变体库的构建方法与流程

本发明涉及植物遗传育种
技术领域：
，尤其涉及激活标签载体与罗布麻种子突变体库的构建方法。
背景技术：
：罗布麻(apocynumvenetuml.)，是夹竹桃科罗布麻属植物。别称红麻、茶叶花、红柳子等。我国对罗布麻植物的资源应用具有悠久的历史：罗布麻全株可入药，嫩叶蒸炒揉制后当茶叶饮用，有清凉去火，防止头晕和强心的功用。罗布麻的纤维具有有抗紫外线、抑菌、抗静电等保健功能，被誉为“野生纤维之王”，其茎皮纤维具有细长柔韧而有光泽耐腐耐磨耐拉的优质性能，为高级衣料、渔网丝、皮革线、高级用纸等原料，在国防工业、航空、航海、车胎帘布带、机器传动带、橡皮艇、高级雨衣等方面均有用途。叶含胶量达4-5％作轮胎原料。种毛白色绢质，可作填充物。麻秆剥皮后可作保暖建筑材料。根部含有生物碱供药用。罗布麻花多，美丽、芳香，花期较长，具有发达的蜜腺，是一种良好的蜜源植物。罗布麻植株具有抗逆性强、再生性强，喜光、耐旱、耐碱、耐寒、耐贫瘠等特点，是荒漠化治理和荒漠区生态修复中首选植物。然而，多年来由于生长环境恶化，人为开垦、过度放牧等因素，资源量急剧减少，全国面积已经不足50年前的十分之一。解决罗布麻供需矛盾，创制优异罗布麻新种质，减少人们对野生资源依赖，具有极其重要的意义。罗布麻组织培养和再生体系研究取得的系列进展，很大程度上促进了罗布麻重要农艺性状基因的挖掘与研究。但与其他作物相比，在无论是外源基因、受体材料，还是遗传转化方法上都仍有较大差距，传统的杂交或是组培再生的方法很难快速、高效地获得大量突变体。罗布麻种子小、结子量大，采用花蕾浸染转化的方法，利用罗布麻茎的柔韧性直接进行花器官浸染，成熟期便可获得大量的诱变种子，避免了大量繁重的组培转化工作，适用于大规模突变体库的构建。此外，相对于传统的化学、物理诱变法，通过激活标签技术来激活或增强邻近基因的转录来诱发植物基因突变，构建突变体构建具有如下优点：(1)激活标签法诱导产生显性突变，在t1代即可观察到可见的表型改变；(2)避免了因功能丧失型突变而产生的致死效应；(3)适用于对基因家族或是遗传丰余基因成员进行功能验证。激活标签的插入热点大多集中在基因组的活跃转录或具有转录潜力的区域，是理想的基因标记工具。随着植物转化技术的不断完善，在棉花、烟草、盐芥等许多重要的一年生经济作物中已经成功建立了激活突变文库，但在罗布麻等多年生宿根型草本作物中仍未有相关报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供激活标签载体与罗布麻种子突变体库的构建方法，该构建方法转化率高。本发明提供了包含4×35s增强子和gus报告基因的质粒载体。4×35s增强子是4个串联的35s增强子，其作为激活标签序列，随机分布于整个罗布麻基因组，增强其邻近基因的表达、诱发形成突变体，并且产生的突变体为显性突变，避免了因功能丧失型突变而产生的致死效应。而gus报告基因能够用于瞬时转移检测。本发明提供的质粒载体的骨架载体为pski074载体。所述4×35s增强子的插入位点是bsssi与bamhi双酶切位点；所述gus报告基因的插入位点是noti与kpni双酶切位点。本发明所述质粒载体的构建方法：利用多步酶切连接反应，在pski074载体中引入gus报告基因和4×35s增强子。本发明还提供了转染包含4×35s增强子和gus报告基因的质粒载体的农杆菌。本发明中，所述农杆菌为lb4404。本发明还提供了罗布麻种子突变体库的构建方法，维持罗布麻植株正常生长，在罗布麻花蕾发育过程中，以含有本发明所述农杆菌的菌悬液进行3次浸渍；收集成熟种子，以头孢霉素和卡那霉素筛选，获得抗性种子苗。本发明提供的一种罗布麻种子激活标签突变体库的构建方法，包括激活标签突变体库的构件，农杆菌浸染悬浮液的制备，罗布麻花蕾浸染，突变体种子筛选培养。本发明以含激活标签载体的重组农杆菌为介导，采用喷洒法对罗布麻雌花花蕾进行浸染，可实现在短时期内获得大量的罗布麻种子显性突变体，容易产生大规模的表型可见且遗传稳定的突变体库。本发明中，所述浸渍为对花蕾喷施含有本发明所述农杆菌的菌悬液。实验表明，3次浸渍的时期对转化率的影响明显，通过摸索，本发明提供方法中的浸染时期能够最大限度的提高转化率。本发明中，所述3次浸渍分别在花蕾长度为0.8mm～1.2mm、3mm～5mm、0.8cm～1.2cm时进行。本发明中，所述每次浸渍后暗培养24h。本发明中，所述浸渍的量为1ml菌悬液/10个花蕾～2ml菌悬液/10个花蕾。研究表明，表面活性剂的种类、浓度和添加的时期对转化率的影响十分显著。第一次浸染不添加表面活性剂、第二次浸染添加低浓度的表面活性剂，而第三次浸染添加高浓度的表面活性剂。本发明中，所述菌悬液中包括水、0～0.05wt％表面活性剂、5wt％蔗糖、1×108cfu/ml本发明所述的农杆菌。本发明中，所述表面活性剂为silwetl-77。在本发明方法中，该表面活性剂的种类、浓度和添加时期能够获得高达43.2％的转化率。本发明中，所述3次浸渍具体为：花蕾长度为0.8mm～1.2mm，喷施包括水、5wt％蔗糖、1×108cfu/ml权利要求2所述的农杆菌的菌悬液；花蕾长度为3mm～5mm，喷施包括水、5wt％蔗糖、0.03wt％表面活性剂、1×108cfu/ml权利要求2所述的农杆菌的菌悬液；花蕾长度为0.8cm～1.2cm，喷施包括水、5wt％蔗糖、0.05wt％表面活性剂、1×108cfu/ml权利要求2所述的农杆菌的菌悬液。所述筛选包括：将种子用0.1wt％的升汞溶液消毒5min后，置于含200mg/l头孢霉素的ms培养基中遮光培养；培养至种子萌发后转移至含100mg/l头孢霉素和50mg/l卡那霉素的ms基本培养基中进行筛选培养，每2周继代培养一次，获得抗性苗。所述构建方法还包括pcr验证的步骤。所述pcr验证的模板的制备方法为：将罗布麻继代培养植株的叶片组织，经浓度为50mm的氢氧化钠溶液于95℃裂解10min，然后与浓度为1m的tri-hcl缓冲液混合，作为模板。所述pcr验证的引物为：正向引物：5’gactcactatagggcgaattg3’；反向引物：5’gatatcacatcaatccacttgc3’。pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火45s，；72℃延伸3min，35个循环；最后72℃延伸5min。与现有技术相比，本发明通外植体的选择、遗传转化和再生体系的建立，能够迅速获得大规模的罗布麻突变体种子群体；该突变群体中激活标签序列(4个串联的35s增强子)激活标签随机分布于整个罗布麻基因组，增强其邻近基因的表达、诱发形成突变体，并且产生的突变体为显性突变，避免了因功能丧失型突变而产生的致死效应；此外，通过调整重组农杆菌菌悬液中表面活性剂的种类和浓度范围(silwet77,0.03％～0.05％)、菌悬液的喷洒量以及罗布麻花蕾的不同喷洒浸渍时期，优化和建立了喷洒式罗布麻花蕾浸染转化体系，获得较高的转化率，同时也很大程度上克服了菌悬液浸渍对罗布麻花蕾结实率的影响。所以本发明不仅能简单快速的构建起罗布麻激活标签突变体种子库，直接为罗布麻新品种的选育提供有效的突变体材料，同时由于激活标签的插入对邻近基因的增强表达也有利于功能基因挖掘、分子育种等科学问题的深入研究。附图说明图1激活标签载体的图谱；图2pcr验证结果。具体实施方式本发明提供了激活标签载体与罗布麻种子突变体库的构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1、含激活标签载体pski074-gus的重组农杆菌菌株构建：利用多步酶切连接反应，在含有4个串联的35s增强子的pski074载体中引入gus瞬时转染报告基因(核苷酸序列来自genebank,geneid:946149)。改造后的psk074-gus激活标签载体中所述激活标签为4个串联的35s增强子并含有用于瞬时转移检测的gus报告基因，构建的质粒载体图谱如图1。2、重组农杆菌浸染菌悬液的制备：以上述构建的质粒载体转染农杆菌lb4404，转染方法为电击转化法，获得农杆菌重组菌株；挑取重组菌株，接种于含5ml含50mg/l卡娜霉素的lb液体培养基中。28℃、250r/min震荡培养至od600至0.8(od值在0.5到1之间均可接受)，菌液按1:50比例接种到卡娜霉素终浓度为50mg/l的新鲜lb液体培养基中，28℃，200rmp/min恒温震荡培养至od600为0.5-1.0；再取扩大培养后的菌液50ml于4℃，5000rmp/min条件下离心10min，去除上清液，收集菌体。并将菌体重悬于浓度为5.0％的蔗糖溶液，并根据需求添加不同浓度的表面活性表面活性剂silwetl-77，构建的菌悬液如下：菌悬液a：5wt％蔗糖、1×108cfu/ml农杆菌；菌悬液b：5wt％蔗糖、0.03wt％表面活性剂、1×108cfu/ml农杆菌；菌悬液c：5wt％蔗糖、0.05wt％表面活性剂、1×108cfu/ml农杆菌。3、罗布麻浸染：2017年9月，进行罗布麻的浸染实验，实验设置6个处理组，处理方法如表1：表1各处理组浸染时期处理一处理二处理三处理四处理五处理六花蕾早期(约1mm)浸染浸染浸染------花蕾中期(3-5mm)浸染--浸染浸染--浸染花蕾晚期(约1cm)浸染------浸染浸染浸染的方法为：将新鲜制备菌悬液均匀喷洒至花蕾上，每10个罗布麻花蕾喷洒菌悬液1-2ml。喷洒结束后，喷洒结束后用顶部透气的黑色塑料袋将整颗罗布麻植株盖住，保持高度湿润，暗培养24小时候后正常生长。至2017年10月，各处理组经过激活标签转化后的10株罗布麻植株均能正常结实，种子总量与不经浸染对照株相比差异不显著。4、突变体种子筛选培养：取成熟后的罗布麻种子，用0.1％的升汞溶液消毒5min后，置于含200mg/l头孢霉素的ms培养基中遮光培养；培养约1周待种子萌发后转移至含100mg/l头孢霉素和50mg/l卡那霉素的ms基本培养基中进行筛选培养，每2周继代培养一次，培养抗性苗。5、突变体植株验证：从经卡那霉素筛选后的罗布麻种子苗植株中取叶片组织样品5～10mg，加入200μl浓度为50mm的氢氧化钠溶液，于95℃裂解10min后加20μl浓度为1m的tri-hcl缓冲液。取上述溶液1μl直接用于突变体植株pcr验证。pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火45s，；72℃延伸3min，35个循环；最后72℃延伸5min。pcr验证所用特异性正向引物为：5’gactcactatagggcgaattg3’，反向引物为：5’gatatcacatcaatccacttgc3’。各组获得突变植株的pcr检测图如图2，结果显示：经卡那霉素筛选出的抗性植株中均能扩增出特异性的目的条带，表明激活标签载体成功整合到植株基因组中。对各处理组转化率进行统计，结果如表2：表2各处理组对罗布麻种子突变体库转化率的影响处理一处理二处理三处理四处理五处理六收获种子总数726178357786780480097813阳性转化株数313730133115288226152699转化率43.2％38.5％40％36.8％32.6％34.5％结果表明，处理一的转化率最高，该组处理虽然获得的种子总数较少，但能够获得的阳性转化株数更高；相对于处理二阳性转化株数高4.1％、相对于处理三阳性转化株数高0.7％、相对于处理四阳性转化株数高8.8％、相对于处理五阳性转化株数高20.0％、相对于处理六阳性转化株数高16.2％。将经pcr验证后的阳性罗布麻种子苗突变株系分别编号，进行深液流水培培养。后期根据生育期记载突变体相关性状，在突变体生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选，获得罗布麻激活标签突变体植株。将经过性状调查的突变体株系和突变体种子一并保存，从此建立大规模的罗布麻激活标签突变体库，用于后续罗布麻新种质的创制和功能基因组学等方面的研究。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12