本发明涉及医药制备
技术领域：
，具体涉及的是一种用作caspase-3激活剂的缩氨基脲类衍生物，以及它在制备治疗和/或预防癌症和其它增生性疾病的药物中的应用。
背景技术：
：肿瘤是一种严重威胁人类生命健康的疾病，近年来，肿瘤的发生率和死亡率呈逐年上升的趋势。细胞毒性药物能够杀死肿瘤细胞，但对癌细胞和正常细胞缺乏选择性，因此具有较强的毒副作用，寻找能够选择性地杀死癌细胞且对正常增殖细胞无影响的靶向性抗肿瘤药物已成为新型抗肿瘤药物研发的重要方向。细胞凋亡是指一种由基因所调控的细胞内自主性、有序的死亡过程，一般认为，恶性转化的肿瘤细胞是因为失控生长、过度增殖引起的，从细胞凋亡的角度看则认为是肿瘤的凋亡机制受到抑制而不能正常进行细胞死亡清除的结果。肿瘤细胞中有一系列的癌基因和原癌基因被激活，并呈现过表达状态。这些基因的激活和肿瘤的发生发展之间有着极为密切的关系。许多种类的癌基因表达以后，阻断了肿瘤细胞的凋亡过程，使肿瘤细胞数目增加。因此，通过细胞凋亡角度和机制来设计对肿瘤的治疗方法就是重建肿瘤细胞的凋亡信号转递系统，即抑制肿瘤细胞生存基因的表达，激活死亡基因的表达。caspase家族属于天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶，对于在多细胞生物体内的细胞凋亡过程起着关键作用。caspase-3作为caspase家族中最重要的一员，处于细胞凋亡的共同路径上，是细胞凋亡的关键执行者之一。正常情况下caspase-3在胞质中以无活性的酶原形式(procaspase-3)存在，只有当外界凋亡信号使之激活为有活性的caspase-3时，才会引起细胞质、细胞核及细胞构架的关键蛋白酶失活，导致细胞凋亡。在肿瘤细胞中，caspase-3是受到抑制的，如果能够重新激活caspase-3，那么将会重启细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖。目前，研究已证实由于caspase-3受到抑制，导致procaspase-3在很多肿瘤细胞中呈现高度表达的状态，如：淋巴瘤；白血病；黑色素瘤；神经母细胞瘤；肝癌；肺癌；乳腺癌和结肠癌。更值得一提的是，procaspase-3属于细胞凋亡信号通路中的下游蛋白，如果癌症的发生是由于下游蛋白突变引发的，那么上游的凋亡信号将不能正确传送给下游蛋白，从而导致作用于中/上游凋亡信号的抗肿瘤药物将不能发挥抑制肿瘤细胞增长的作用。因此，设计合成直接激活caspase-3的小分子化合物，继而催化水解多种蛋白底物诱导肿瘤细胞凋亡将会是一条安全有效的寻找抗肿瘤药物的新方法。pac-1是报道的第一个能直接作用于半胱天冬蛋白酶-3-酶原procaspase-3，活化其成为活性的caspase-3的小分子化合物。实验表明，pac-1通过直接活化procaspase-3成为caspase-3，进而诱导肿瘤细胞凋亡，继而催化水解多种蛋白底物，最终发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用；目前pac-1处于临床一期研究阶段，2016年被授予孤儿药。技术实现要素：本发明要解决的技术问题，在于提供一种用作caspase-3激活剂的缩氨基脲类衍生物及其应用，本发明具有显著的caspase‐3激活活性和抗肿瘤活性，可应用于制备治疗或预防癌症疾病和其它增生性疾病的药物，从而实现治疗或预防癌症疾病和其它增生性疾病。本发明是这样实现的：一种用作caspase-3激活剂的缩氨基脲类衍生物或其药学上可接受的盐，其结构通式如i所示，；其中，k为o、s；m为c6-c10芳基，或5-10元杂芳基，且所述杂芳基含有1-3个选自o、n和s的杂原子；r1和r2相同或不同，分别独立地选自氢、(c1-c10)烷基、(c3-c7)环烷基、(c2-c10)烯基或(c2-c10)炔基；或r1和r2与和它们所连接的氮原子一起形成4-10元杂环基，所述杂环基除了与r1和r2连接的氮原子外，任选含有1-4个选自n、o和s的杂原子；r3为氢、(c1-c10)烷基、(c3-c7)环烷基、(c2-c10)烯基、(c2-c10)炔基、芳基或杂芳基。进一步地，r1和r2相同或不同，分别独立地选自氢、(c1-c10)烷基、(c3-c7)环烷基；r3为氢、(c1-c10)烷基、(c3-c7)环烷基、芳基和杂芳基。进一步地，r3为氢、(c1-c10)烷基、芳基和杂芳基。进一步地，r1和r2相同或不同，分别独立地选自氢、(c1-c10)烷基；或r1和r2与和它们所连接的氮原子一起形成4-8元杂环基，所述杂环基除了与r1和r2连接的氮原子外，任选含有1-4个选自n、o和s的杂原子；r3为氢、(c1-c10)烷基、芳基和杂芳基。进一步地，其中，k为o；m为苯基或者苯并噻唑基；式i中的为或者r3为氢、甲基、吡啶基。进一步地，该用作caspase-3激活剂的缩氨基脲类衍生物选自：(e)-n-[6-(二甲胺基甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2-(吡啶-2-亚甲基)肼-1-甲酰胺；(e)-n-[6-(二甲胺基甲基)并[d]噻唑-2-基]-2-(1-(吡啶-2-基)亚乙基)肼-1-甲酰胺；n-[6-(二甲胺基甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2(二(吡啶-2-基)亚甲基)肼-1-甲酰胺；(e)-n-[6-(二乙胺基甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2-(1-(吡啶-2-基)亚乙基)肼-1-甲酰胺；n-[6-(二乙胺基甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2-(二(吡啶-2-基)亚甲基)肼-1-甲酰胺；(e)-n-[6-((4-甲基哌啶-1-基)甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2-(吡啶-2-亚甲基)肼-1-甲酰胺；(e)-n-[6-((4-甲基哌啶-1-基)甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2-(1-(吡啶-2-基)亚乙基)肼-1-甲酰胺；n-[6-((4-甲基哌啶-1-基)甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2-(二(吡啶-2-基)亚甲基)肼-1-甲酰胺。进一步地，本发明还涉及一种用作caspase-3激活剂的缩氨基脲类衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗和预防癌症及其它增生性疾病的药物中的应用。本发明具有如下优点：本发明对缩氨基脲类化合物进行了广泛研究，通过对多个结构位点进行修饰和改造，合成了一系列结构新颖的含苯并噻唑的缩氨基脲衍生物，通过测试其caspase-3激活活力，发现该类化合物具有显著的caspase-3激活作用，可应用于制备治疗或预防癌症疾病和其它增生性疾病的药物，从而实现治疗或预防癌症疾病和其它增生性疾病，因此在开发抗肿瘤药方面具有优良的应用前景。【具体实施方式】本发明涉及一种用作caspase-3激活剂的缩氨基脲类衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：其结构通式如i所示，；其中，k为o、s；m为c6-c10芳基，或5-10元杂芳基，且所述杂芳基含有1-3个选自o、n和s的杂原子；r1和r2相同或不同，分别独立地选自氢、(c1-c10)烷基、(c3-c7)环烷基、(c2-c10)烯基或(c2-c10)炔基；或r1和r2与和它们所连接的氮原子一起形成4-10元杂环基，所述杂环基除了与r1和r2连接的氮原子外，任选含有1-4个选自n、o和s的杂原子；r3为氢、(c1-c10)烷基、(c3-c7)环烷基、(c2-c10)烯基、(c2-c10)炔基、芳基或杂芳基。较优的，r1和r2相同或不同，分别独立地选自氢、(c1-c10)烷基、(c3-c7)环烷基；r3为氢、(c1-c10)烷基、(c3-c7)环烷基、芳基和杂芳基。更进一步地，r3为氢、(c1-c10)烷基、芳基和杂芳基。或者r1和r2相同或不同，分别独立地选自氢、(c1-c10)烷基；或r1和r2与和它们所连接的氮原子一起形成4-8元杂环基，所述杂环基除了与r1和r2连接的氮原子外，任选含有1-4个选自n、o和s的杂原子；r3为氢、(c1-c10)烷基、芳基和杂芳基。或者，其中，k为o；m为苯基或者苯并噻唑基；式i中的为或者r3为氢、甲基、吡啶基。具体地，该用作caspase-3激活剂的缩氨基脲类衍生物选自：(e)-n-[6-(二甲胺基甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2-(吡啶-2-亚甲基)肼-1-甲酰胺；(e)-n-[6-(二甲胺基甲基)并[d]噻唑-2-基]-2-(1-(吡啶-2-基)亚乙基)肼-1-甲酰胺；n-[6-(二甲胺基甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2(二(吡啶-2-基)亚甲基)肼-1-甲酰胺；(e)-n-[6-(二乙胺基甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2-(1-(吡啶-2-基)亚乙基)肼-1-甲酰胺；n-[6-(二乙胺基甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2-(二(吡啶-2-基)亚甲基)肼-1-甲酰胺；(e)-n-[6-((4-甲基哌啶-1-基)甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2-(吡啶-2-亚甲基)肼-1-甲酰胺；(e)-n-[6-((4-甲基哌啶-1-基)甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2-(1-(吡啶-2-基)亚乙基)肼-1-甲酰胺；n-[6-((4-甲基哌啶-1-基)甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2-(二(吡啶-2-基)亚甲基)肼-1-甲酰胺。本发明还涉及一种用作caspase-3激活剂的缩氨基脲类衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗和预防癌症及其它增生性疾病的药物中的应用。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。一、缩氨基脲类衍生物的合成方法：按照本发明的式ⅰ化合物，当m为苯并噻唑基，k为o，为不同取代的胺基，r3为氢、甲基或吡啶基，具体合成路线如下式所示：所合成的化合物的核磁共振氢谱用brukerarx-400测定，质谱用uhplc-qtof1290-6545和agilent1100四级杆液质联用仪测定；所用试剂均为分析纯或化学纯。二、合成以下缩氨基脲类衍生物具体结构式如下表1所示：表1实施例1～8的结构式1、实施例1结构式的缩氨基脲类衍生物的制备步骤如下：步骤a、中间体1a-c的制备将对硝基溴苄(10.8g,0.05mol)加入至乙腈(50ml)中，室温下搅拌。加入小分子二级胺(0.25mol)，室温反应3h，反应完毕后，加入水，二氯甲烷萃取(100ml×3)，无水na2so4干燥有机层，浓缩得淡黄色液体或黄色固体1a-c。4-(二甲胺基)甲基-硝基苯(1a)，收率：85.5％。ms(esi)m/z:180.5[m+h]+。4-(二乙胺基)甲基-硝基苯(1b)，收率：82.7％。ms(esi)m/z:208.4[m+h]+。4-(4-甲基哌啶基)甲基-硝基苯(1c)，收率为62.5％。ms(esi)m/z:235.5[m+h]+。步骤b、中间体2a-c的制备将1(0.05mol)加入至90％乙醇(100ml)中，搅拌升温至60℃，加入三氯化铁(0.001mol)和活性炭(0.015mol)，保持70℃下，滴加水合肼(0.5mol)，滴毕，回流反应5h。反应完毕，趁热抽滤，浓缩滤液，加入水(200ml)，二氯甲烷萃取(100ml×3)，无水na2so4干燥有机层，浓缩得无色液体或白色固体2a-c。4-(二甲胺基甲基)苯胺(2a)，收率：78.2％，ms(esi)m/z(％):150.6[m+h]+。4-(二乙胺基甲基)苯胺(2b)，收率：74.1％，ms(esi)m/z(％):178.6[m+h]+。4-(4-甲基哌啶基甲基)苯胺(2c)，收率：83.5％，ms(esi)m/z(％):204.5[m+h]+。步骤c、中间体3a-c的制备将2(0.05mol)和硫氰酸铵(0.25mol)加入至冰醋酸(50ml)中，室温搅拌0.5h，降温至10℃以下，保持温度低于10℃，缓慢滴加溴素的冰醋酸溶液(0.055mol)，滴毕，10℃反应5h。反应完毕，加入温水(500ml)，氨水调ph至9，析出固体，继续搅拌1h，抽滤得黄色固体3a-c。6-(二甲胺基甲基)-2-氨基苯并噻唑(3a)，收率：65.4％，ms(esi)m/z(％):208.4[m+h]+。6-(二乙胺基甲基)-2-氨基苯并噻唑(3b)，收率：88.6％，ms(esi)m/z(％):236.5[m+h]+。6-(4-甲基哌啶基甲基)-2-氨基苯并噻唑(3c)，收率：85.3％，ms(esi)m/z(％):262.5[m+h]+。步骤d、中间体4a-c的制备将3a-c(0.05mol)和吡啶(0.25mol)加入至二氯甲烷(80ml)中，降温至0℃以下，保持温度低于0℃，缓慢滴加氯甲酸苯酯的二氯化碳溶液(0.06mol)，滴毕，0℃以下反应2h。反应完毕，抽滤，用二氯甲烷洗滤饼，得黄色固体4a-c。n-[6-((二甲胺基)甲基)苯并噻唑-2-基]氨基甲酸苯酯(4a)，收率：94.6％，ms(esi)m/z(％):328.5[m+h]+。n-[6-((二乙胺基)甲基)苯并噻唑-2-基]氨基甲酸苯酯(4b)，收率：92.3％，ms(esi)m/z(％):356.4[m+h]+。n-[6-((4-甲基哌啶基)甲基)苯并噻唑-2-基]氨基甲酸苯酯(4c)，收率：97.6％，ms(esi)m/z(％):382.5[m+h]+。步骤e、中间体5a-c的制备将4a-c(0.01mol)加入至1,4-二氧六环(20ml)中，再向其中加入85％水合肼(0.025mol)，回流反应6h。反应完毕，待反应液冷却至室温后，浓缩反应液，无水乙醚洗涤固化，搅拌0.5h后抽滤得白色固体5a-c。n-[6-((二甲胺基)甲基)苯并噻唑-2-基]氨基甲酰肼(5a)，收率：82.6％，ms(esi)m/z(％):265.7[m+h]+；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.37(s,1h),7.77(s,1h),7.56(d,j＝8.2hz,1h),7.28(d,j＝8.2hz,1h),3.44(s,2h),2.15(s,6h)。n-[6-((二乙胺基)甲基)苯并噻唑-2-基]氨基甲酰肼(5b)，收率86.3％，ms(esi)m/z(％):607.9[2m+na]+；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.34(s,1h),8.49(s,1h),8.03(s,1h),7.70(d,j＝8.0hz,1h),7.50(d,j＝8.0hz,1h),4.31(s,2h),3.04(s,4h),1.22(s,6h)。n-[6-((4-甲基哌啶基)甲基)苯并噻唑-2-基]氨基甲酰肼(5c)，收率：76.8％，ms(esi)m/z(％):319.6[m+h]+；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.33(s,1h),7.79(s,1h),7.57(d,j＝8.0hz,1h),7.31(d,j＝7.2hz,1h),7.16(t,j＝7.6hz,1h),6.76(s,1h),6.74(s,1h),3.54(s,2h),2.81(s,2h),1.94(s,2h),1.58(d,j＝11.6hz,2h),1.35(s,1h),1.15(m,2h),0.88(d,j＝6.4hz,3h)。步骤f、(e)-n-[6-(二甲胺基甲基)苯并[d]噻唑-2-基]-2-(吡啶-2-亚甲基)肼-1-甲酰胺(实施例1)的制备将5a(0.26g,1mmol)和吡啶-2-甲醛(0.11g,1.1mmol)加入至1无水乙醇中(5ml)，加入1滴冰醋酸，回流反应8h，降温至室温，浓缩反应液，粗品使用二氯甲烷/甲醇体系进行柱层析分离得纯品实施例1。2、实施例2结构式的缩氨基脲类衍生物的制备步骤如下：参照实施例1的制备方法，步骤f中以5a和2-乙酰基吡啶为原料，即可制得实施例2结构式的缩氨基脲类衍生物。3、实施例3结构式的缩氨基脲类衍生物的制备步骤如下：参照实施例1的制备方法，步骤f中以5a和双(2-吡啶基)甲酮为原料，即可制得实施例3结构式的缩氨基脲类衍生物。4、实施例4结构式的缩氨基脲类衍生物的制备步骤如下：参照实施例1的制备方法，步骤f中以5b和2-乙酰基吡啶为原料，即可制得实施例4结构式的缩氨基脲类衍生物。5、实施例5结构式的缩氨基脲类衍生物的制备步骤如下：参照实施例1的制备方法，步骤f中以5b和双(2-吡啶基)甲酮为原料，即可制得实施例5结构式的缩氨基脲类衍生物。6、实施例6结构式的缩氨基脲类衍生物的制备步骤如下：参照实施例1的制备方法，步骤f中以5c和吡啶-2-甲醛为原料，即可制得实施例6结构式的缩氨基脲类衍生物。7、实施例7结构式的缩氨基脲类衍生物的制备步骤如下：参照实施例1的制备方法，步骤f中以5c和2-乙酰基吡啶为原料，即可制得实施例7结构式的缩氨基脲类衍生物。8、实施例8结构式的缩氨基脲类衍生物的制备步骤如下：参照实施例1的制备方法，步骤f中以5c和双(2-吡啶基)甲酮为原料，即可制得实施例8结构式的缩氨基脲类衍生物。三、实施例1-8结构式的缩氨基脲类衍生物的质谱，氢谱和碳谱数据如下表2所示：表2实施例1～8的质谱，氢谱和碳谱数据：四、对实施例1～8进行了体外caspase-3激活活力筛选测试以及procaspase-3高表达肿瘤细胞株(u937)的抗肿瘤活性测试，具体过程如下。1.抗肿瘤活性测试：待测化合物使用dmso助溶，使用培养基稀释至不同的浓度，待测。dmso终浓度应小于0.01％。在96孔板中接种5×104个细胞/孔的细胞，孵育12小时后,先96孔板中加入不同浓度的待测化合物，使药物终浓度为2、4、8、16、32和40μm。控制培养基内dmso浓度小于0.01％，空白对照组不加药物只含培养液，每一浓度的药物组和对照组均设有3个复孔，24小时后，采用细胞计数试剂盒(cck-8)测定u937的细胞活力，向每一孔板中加入10μl的cck-8溶液，37℃孵育2小时，采用全自动酶标仪检测每孔测定450nm处的吸光度。根据吸光度值计算抑制率，根据抑制率计算化合物的ic50值。2.caspase-3激活活性测试：u-937悬浮细胞培养在无酚红的rpmi-1640完全培养基(50000细胞/孔)中，将100μlu937细胞悬浮液分别接种到两块96孔板中，然后在37℃下，5％co2培养箱中培养15小时。各化合物(包括实施例1～8中化合物，pac-1)分别使用完全培养基配置成3x终浓度(以3％dmso为空白对照)，同时向两块96孔板中对应的孔中加入50μl化合物，每个化合物设置六次重复。向第一块96孔板中，加入50μl双功能细胞裂解/半胱天冬酶活性缓冲液，采用酶标仪，每隔2分钟读取荧光强度(ex.400nm,em.505nm)，持续读取1小时，斜率表示caspase-3活力，该值为化合物处理之前的u937细胞的caspase活力。第二块96孔板在37℃下，5％co2环境下，继续孵育15小时，之后加入50μl双功能细胞裂解/半胱天冬酶活性缓冲液，同样每隔2分钟读取荧光强度(ex.400nm,em.505nm)，持续读取1小时，减去化合物处理之前的u937细胞的caspase活力，最终计算出化合物处理16h时后细胞的caspase活力，以阳性对照pac-1的caspase活力为100％，最终求出各个化合物相对于pac-1的激活率百分比，结果见表3，其中，+表示caspase-3激活程度在10％～50％之间，++表示caspase-3激活程度在50％～70％之间，+++表示caspase-3激活程度在70％～100％之间。表3化合物的体外抗肿瘤活性和caspase-3激活活力测试结果实施例caspase-3activationu937(ic50μm)1+>402++25.63104％7.84+25.15119％9.16+>407+++5.28114％6.6dmso<10％pac-1100％6.0从上述试验结果可以清楚地看出，本发明所要保护的式ⅰ的实施例1-8具有显著的caspase-3激活活性，同时对procaspase-3高表达肿瘤细胞株(u937)表现出较好的抗肿瘤活性，尤其是实施例3，5，7和8结构的化合物相当或优于对照药pac-1。虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本
技术领域：
的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。当前第1页12