一类取代苯基呋喃-2-巯基噻唑啉甲酮类化合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于杂环化合物合成领域，特别涉及含苯基呋喃环巯基噻唑啉酮类化合物，更具体地，涉及一类取代苯基呋喃-2-巯基噻唑啉甲酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
：近年来，随着越来越多具有生物活性、结构新颖的杂环类化合物的报道，各种杂环化合物的设计与合成成为了一个研究热点，其中对噻唑类杂环化合物的研究日趋活跃，已取得了一系列的应用成果和商品化产品。由于噻唑环的2、3、4、5四个位置都可引入不同的官能团，使得噻唑类杂环化合物的种类繁多，其中许多噻唑类化合物均具有较好的生物活性。(1)农用杀菌剂uniroyaiinc.开发的内吸性杀菌剂噻菌胺(1)对禾谷类作物、棉花、马铃薯上的担子菌纲病原菌药效优异。1992年，o’reilly等报道了杀菌剂噻氟酰胺(2)，该杀菌剂通过抑制琥珀酸酯脱氢酶而起作用，可叶面施用或作为种衣剂使用。韩国lg生命科学公司所开发的噻唑菌胺(3)对卵菌纲类病害如葡萄霜霉菌、马铃薯晚疫病等具有良好的预防与抑制活性。日本住友化学公司所开发的灭瘟唑(4)，作为内吸性杀菌剂可以抑制附着孢上侵染菌丝的形成，对防治稻瘟病有较好效果。除此之外，已上市的噻菌灵(5)、稻可丰(6)、苯噻菌清(7)等也在杀菌剂中扮演着十分重要的角色。除上述已经商品化的化合物外，除此之外还存在许多具有较好生物活性的待开发的化合物。pathak等合成的系列化合物8普遍对黑曲霉具有较好的抑制率，其中效果最为优异的在100mg/l的浓度下，对黑曲霉的抑制率可达96.8％。gupta等合成的系列化合物9表现出良好的杀菌活性，除此之外还具有较好的抗惊厥作用与杀阿米巴虫作用。(2)除草剂拜尔公司在1966年所开发的苯噻隆(10)是一种很好的甜菜芽前除草剂。1969年hack等发现化合物11(后开发为除草剂，商品名为：甲基苯草隆)对阔叶杂草具有很好的除草活性。三井东亚公司在1971年开发了除草效果优异的触杀型选择性芽后除草剂噻草胺(12)。除此之外，已经商品化的噻唑类除草剂还有苯噻草胺(13)、噻唑禾草灵(14)等。(3)杀虫剂1980年，zoebelein等设计合成的化合物15表现出优异的杀螨活性，后又德国拜耳公司开发上市，商品名为：氟螨噻。1984年，日本曹达公司开发了一种高效低毒的杀螨剂噻螨酮(16)，该化合物可有效防止多种食植性螨类，对螨的卵、若虫、幼虫均有较好效果。1989年，kozo等设计合成了化合物17(后开发上市，商品名为：噻虫啉)，该化合物作用于烟碱乙酰胆碱受体，降解迅速，可广泛防治各种鳞翅目害虫，且与拟除虫菊酯类、有机膦酸酯类、氨基甲酸酯类农药无交互抗性。除此之外，已开发上市的噻唑类杀虫剂还有噻螨胺(18)、噻螨威(19)、噻唑磷(20)等。除上述已开发上市的噻唑类杀虫剂外，miyazawa等设计合成的甲氧基丙烯酸甲酯类化合物21、22均具有较好的杀虫活性，在1.25×10-4mg/kg浓度下，对某些鳞翅目和同翅目害虫防治效果在80％以上。schnatterer等设计合成的噻唑啉类化合物23，当r＝oc2h5时，在3×10-4mg/kg浓度下，化合物对二斑叶螨的防治效果为100％。虽然目前已有多种噻唑类杂环化合物，但此类化合物仍具有无限的研究与开发空间，可进行进一步的研究以开发其更多的应用价值和前景。技术实现要素：本发明的目的在于提供一类取代苯基呋喃-2-巯基噻唑啉甲酮类化合物。所述化合物的结构新颖，对水稻白叶枯病菌iii型分泌系统(t3ss)表现出明显的抑制作用；进一步地，在不影响水稻白叶枯病菌的生长的同时，可显著性降低水稻白叶枯病菌的致病性，具有很好的预防和/或治疗水稻白叶枯病的作用。本发明的另一目的在于提供所述一类取代苯基呋喃-2-巯基噻唑啉甲酮类化合物的制备方法。本发明的再一目的在于提供所述一类取代苯基呋喃-2-巯基噻唑啉甲酮类化合物的应用。本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：一类取代苯基呋喃-2-巯基噻唑啉甲酮类化合物，所述化合物的结构如式(ⅲ)所示：其中，r基为一个或多个，所述r基为氢、卤素、硝基、羟基、碳原子数为1～4的烷基或烷氧基。作为一种优选方案，所述r为氢、氟、氯、溴、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基或硝基中的任意一种。作为一种更优选方案，所述r为氢、2-cl、3-cl、4-cl、2-f、3-f、4-f、2,4-二氟、2,6-二氟、4-br、3-甲基、4-甲基、4-甲氧基、2-no2、3-no2或4-no2中的任意一种。作为一种更优选方案，所述r为氢、2-cl、2-f、2,4-二氟、2,6-二氟、2-no2或4-no2中的任意一种。作为一种更优选方案，所述r为2,4-二氟。本发明同时还保护所述取代苯基呋喃-2-巯基噻唑啉甲酮类化合物的制备方法，具体包括如下步骤：s1.在稀释剂存在下，式(i)所示化合物与socl2反应，制备式(ⅱ)化合物；s2.在稀释剂和缚酸剂存在下，式(ⅱ)化合物与2-巯基噻唑啉进行反应，分离得到式(ⅲ)所示化合物；所述r基为一个或多个，所述r基为氢、卤素、硝基、羟基、碳原子数为1～4的烷基或烷氧基。具体过程如下：同时，所述化合物也可以参考文献chinesejournaloforganicchemistry.,2010,30(10),1482-1491；(b)chinesejournaloforganicchemistry.,2007,27(10),1300-1304)中的制备方法进行，例如，当r为氢时，可以以呋喃甲酸为起始原料，经meerwein芳基化反应制得；当r为其他基团时，也可以参考上述方法制备得到。具体过程如下：作为一种优选方案，步骤s2中，先将稀释剂与2-巯基噻唑啉混合，加入部分缚酸剂，再缓慢加入式(ii)所示化合物及余下的缚酸剂，升温反应。作为一种优选方案，步骤s1中，所述稀释剂、式(i)所示化合物与socl2的摩尔比为40～80:1～1.5:1～5；步骤s2中所述式(ⅱ)化合物、2-巯基噻唑啉、稀释剂与缚酸剂的用量摩尔比为1～1.5:1～1.5:40～80:1～3；反应温度为0℃～125℃，反应时间为2～15h。更优选地，步骤s1中，所述稀释剂、式(i)所示化合物与socl2的摩尔比为60:1:2。更优选地，步骤s2中，所述式(ⅱ)化合物、2-巯基噻唑啉、稀释剂与缚酸剂的用量摩尔比为1～1.2:1.2～1.5:40～60:1～2；反应温度为40～60℃。更优选地，步骤s2中，所述式(ⅱ)化合物、2-巯基噻唑啉、稀释剂与敷酸剂的摩尔比为1:1.5:60:1.5。步骤s1和s2中所述稀释剂为惰性有机溶剂，作为一种优选方案，所述稀释剂为脂肪族、卤代脂肪族、芳烃或卤代芳烃中的一种或多种；更优选地，所述稀释剂选自苯、甲苯、二甲苯、氯苯、二氯苯、石油醚、己烷、环己烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、乙醚、二异丙醚、二恶烷、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、丙酮、丁酮、甲基异丁酮、乙腈、丙腈、丁腈、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、n-甲基-甲酰苯胺、n-甲基吡咯烷酮、六甲基磷酰三胺、乙酸甲酯、乙酸乙酯、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、二乙二醇单甲醚或二乙二醇单乙醚。更优选方案，所述稀释剂选自苯、甲苯、四氢呋喃或二氯甲烷。缚酸剂存在时，更有利于反应的进行。作为一种优选方案，步骤s2中所述缚酸剂为氢氧化钠、碳酸钾、乙醇钠、三乙胺、三甲胺、三丁胺、吡啶、n,n-二甲基苯胺、n,n-二甲基苄胺、n-甲基哌啶、n-甲基吗啉、n,n-二甲基氨基吡啶、二氮杂二环辛烷、二氮杂二环壬烯或二氮杂二环十一碳烯中的一种或多种。作为一种最优选方案，所述缚酸剂最优选为氢氧化钠。所述取代苯基呋喃-2-巯基噻唑啉甲酮类化合物在制备预防或治疗植物病害药物中的应用也在本发明的保护范围之内。优选地，所述植物病害为水稻白叶枯病。更优选地，所述化合物作为水稻白叶枯病菌中毒力因子t3ss抑制剂，且不影响水稻白叶枯病菌的生长。所述取代苯基呋喃-2-巯基噻唑啉甲酮类化合物作为水稻白叶枯病菌中毒力因子t3ss抑制剂的应用也在本发明的保护范围之内。本发明的优点及有益效果：(1)本发明提供的取代苯基呋喃-2-巯基噻唑啉甲酮类化合物，结构新颖、制备方法简单、产率高。(2)本发明所述化合物对水稻白叶枯病菌iii型分泌系统(t3ss)表现出明显的抑制作用，可以作为水稻白叶枯病t3ss活性抑制剂使用，尤其是化合物ⅲ-7，在显著性降低水稻白叶枯病菌致病性的同时又不影响水稻白叶枯病菌的生长，如此，既可以预防病原菌产生抗药性，又能同时达到预防和/或防治水稻白叶枯病的效果，本发明拓展了噻唑类杂环化合物在作为t3ss抑制剂方面的应用前景。附图说明图1为化合物iii-7存在条件下pxo99a在丰富培养基m210(a)及贫瘠培养基xom2(b)中生长曲线。图2为化合物iii-1、iii-4、iii-8、iii-9、iii-11或iii-15存在条件下pxo99a在丰富培养基m210(a)及贫瘠培养基xom2(b)中生长曲线。图3为经化合物iii-7处理后菌落计数及统计计数。图4为化合物iii-7对t3ss相关基因表达的影响。图5为化合物iii-7对hrpg和hrpx启动子活性的影响。图6为化合物iii-7对hct启动子活性的影响。图7为化合物iii-7处理后在ir24幼苗上watersoaking症状。图8为化合物iii-7处理后ir24成株上病斑长度。图9为化合物iii-7处理后ir24成株上病斑长度统计及显著性分析。图10为化合物iii-7处理后ir24成株上离体发病状况。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。实施例1：化合物ⅲ-1的合成在装有温度计的50ml三口烧瓶中加入15mmol2-巯基噻唑啉与10ml二氯甲烷，室温下加入含15mmol氢氧化钠的10％(wt.)氢氧化钠水溶液，控制滴加速度，使温度保持在室温。待其完毕后，滴加含有7.5mmol5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯的二氯甲烷溶液。控制滴加速度，使两者同时加完。滴加完毕，慢慢升温至50℃，在50℃条件下反应3～10h。反应完毕后，过滤，去除沉淀，旋蒸滤液以去除溶剂，得到淡黄色固体。用硅胶柱(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯体积比为3/1)分离得到ⅲ-1化合物，收率：58％(ⅲ-1)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.50(2h,t,j＝6.0hz),4.51(2h,t,j＝8.0hz),7.22-7.25(1h,m),7.28-7.42(3h,m),7.46(1h,d,j＝8.0hz),7.90(1h,d,j＝8.0hz).实施例2：化合物ⅲ-2的合成方法同实施例1，所不同的是采用5-(3-氟苯基)-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-2。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.51(2h,t,j＝8.0hz),4.51(2h,t,j＝8.0hz),6.85(1h,d,j＝4.0hz),7.21-7.92(5h,m).实施例3：化合物ⅲ-3的合成方法同实施例1，所不同的是采用5-(4-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-3。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.51(2h,t,j＝6.0hz),4.51(2h,t,j＝6.0hz),6.77(1h,s),7.35(1h,s),7.39(2h,d,j＝8.0hz),7.67(2h,d,j＝8.0hz).实施例4：化合物ⅲ-4的合成方法同实施例1，所不同的是采用5-(2-氟苯基)-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-4。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.50(2h,t,j＝6.0hz),4.51(2h,t,j＝6.0hz),6.96(1h,t,j＝4.0hz),7.14(1h,dd,j＝12.0,8.0hz),7.22(1h,d,j＝8.0hz),7.30-7.40(2h,m),7.87(1h,td,j＝8.0,1.6hz).实施例5：化合物ⅲ-5的合成方法同实施例1，所不同的是采用5-(3-氟苯基)-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-5。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.51(2h,t,j＝8.0hz),4.51(2h,t,j＝8.0hz),6.81(1h,d,j＝4.0hz),7.02-7.11(1h,m),7.32-7.45(3h,m),7.49-7.55(1h,m).实施例6：化合物ⅲ-6的合成方法同实施例1，所不同的是采用5-(4-氟苯基)-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-6。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.50(2h,t,j＝8.0hz),4.50(2h,t,j＝8.0hz),6.73(1h,d,j＝4.0hz),7.11(2h,t,j＝8.0hz),7.36(1h,d,j＝4.0hz),7.67-7.78(2h,m).实施例7：化合物ⅲ-7的合成方法同实施例1，所不同的是采用5-(2,4-二氟苯基)-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-7。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.10(2h,t,j＝8.0hz),4.51(2h,t,j＝8.0hz),6.85-7.05(3h,m),7.37(1h,s),7.80-7.92(1h,q,j＝8.0hz).实施例8：化合物ⅲ-8的合成方法同实施例1，所不同的是采用5-(2,6-二氟苯基)-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-8。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.49(2h,t,j＝8.0hz),4.54(2h,t,j＝6.0hz),6.92-7.07(3h,m),7.25-7.37(1h,m),7.37-7.44(1h,m).实施例9：化合物ⅲ-9的合成方法同实施例1，所不同的是采用5-(2-硝基苯基)-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-9。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.49(2h,t,j＝8.0hz),4.49(2h,t,j＝8.0hz),6.76(1h,d,j＝4.0hz),7.34(1h,d,j＝4.0hz),7.53(1h,t,j＝4.0hz),7.65(1h,d,j＝6.0hz),7.77(1h,d,j＝8.0hz),7.80(1h,d,j＝4.0hz).实施例10：化合物ⅲ-10的合成方法同实施例1，所不同的是采用5-(3-硝基基苯基)-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-10。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.54(2h,t,j＝8.0hz),4.53(2h,t,j＝8.0hz),6.95(1h,s),7.36(1h,s),7.62(1h,t,j＝8.0hz),8.06(1h,d,j＝8.0hz),8.21(1h,d,j＝8.0hz),8.54(1h,s).实施例11：化合物ⅲ-11的合成方法同实施例1，所不同的是采用5-(4-硝基苯基)-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-11。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.55(2h,t,j＝6.0hz),4.53(2h,t,j＝6.0hz),6.98(1h,s),7.36(1h,s),7.87(2h,d,j＝8.0hz),8.27(2h,d,j＝8.0hz).实施例12：化合物ⅲ-12的合成方法同实施例1，所不同的是采用5-(4-溴苯基)-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-12。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.51(2h,t,j＝6.0hz),4.51(2h,t,j＝6.0hz),6.79(1h,d,j＝4.0hz),7.35(1h,d,j＝4.0hz),7.55(2h,d,j＝8.0hz),7.60(2h,d,j＝8.0hz).实施例13：化合物ⅲ-13的合成方法同实施例1，所不同的是采用5-(4-甲基苯基)-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-13。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ2.38(3h,s),3.50(2h,t,j＝6.0hz),4.50(2h,t,j＝8.0hz),6.74(1h,s),7.22(2h,d,j＝8.0hz),7.37(1h,s),7.64(2h,d,j＝8.0hz).实施例14：化合物ⅲ-14的合成方法同实施例1，所不同的是采用5-(4-甲氧基苯基)-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-14。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.49(2h,t,j＝8.0hz),3.84(3h,s),4.50(2h,t,j＝6.0hz),6.66(1h,s),6.94(2h,d,j＝8.0hz),7.37(1h,s),7.69(2h,d,j＝8.0hz).实施例15：化合物ⅲ-15的合成方法同实施例1，所不同的是采用5-苯基-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-15。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.50(2h,t,j＝8.0hz),4.51(2h,t,j＝8.0hz),6.80(1h,d,j＝4.0hz),7.32-7.49(4h,m),7.71-7.77(2h,m).实施例16：化合物ⅲ-16的合成方法同实施例1，所不同的是5-(2-氟苯基)-2-呋喃甲酰氯替代5-(2-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯，得到黄色固体ⅲ-16。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ2.40(3h,s),3.49(2h,t,j＝6.0hz),4.50(2h,t,j＝8.0hz),6.77(1h,d,j＝4.0hz),7.18(1h,d,j＝8.0hz),7.30(1h,t,j＝8.0hz),7.36(1h,d,j＝4.0hz),7.55(2h,s).化合物ⅲ-1～ⅲ-16的结构、外观、质谱及元素分析结果见表1中。表1化合物ⅲ-1～ⅲ-16的结构、外观、质谱及元素分析结果传统抗生素通常以细菌生存的关键因素为作用靶标，导致细菌抗药性的产生越来越普遍和严重。为减少或降低细菌抗药性的产生，以细菌毒性因子为靶标，降低细菌的致病性，但不影响细菌的生长，已成为抗菌药物研发的新思路和新途径。细菌iii型分泌系统(t3ss)是革兰氏阴性病原细菌中的关键毒性因子，已经成为了研发新型药物的理想靶标之一。水稻白叶枯病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzae，xoo)引起水稻的白叶枯病，是水稻上重要的细菌性病害，研发新型有效的病害防治新药物是迫切需要解决的关键问题之一。t3ss是xoo的关键毒性因子，在两个致病变种中高度同源和保守，可以用作新型药物分子设计的靶标。因此，本发明测试了上述所述化合物ⅲ-1～ⅲ-16对水稻白叶枯病菌t3ss的抑制作用，并探讨了化合物抑制作用的分子机制，为在实际生产中水稻白叶枯病病害的防控提供理论依据。具体的测试过程如下：1.水稻白叶枯病菌t3ss抑制剂的筛选和鉴定选用一个编码harpin蛋白(t3ss分泌蛋白)的hpa1基因的启动子，构建的绿色荧光蛋白(gfp)报告系统；利用流式细胞术，检测了化合物对xoo菌株pxo99at3ss的影响，以筛选出相应的抑制剂。在hrp基因诱导培养基xom2中添加不同化合物，检测细菌hpa1基因启动子活性。结果显示，在检测的16种化合物中，以对hpa1基因的启动子活性抑制率高于60％为标准，筛选到7种潜在的t3ss抑制剂。随后，检测得到ⅲ-7对xoo各生长阶段都未发现有抑制作用。2.水稻白叶枯病菌t3ss抑制剂的作用机制为了进一步揭示这种抑制剂抑制t3ss功能的分子机制，选取了hrp基因簇中hrct基因启动子，检测化合物对它们活性的影响。hrct基因启动子中含有一个完整的受hrpx调控的pip-box，结果显示，经过化合物ⅲ-7处理后，hrct启动子活性被抑制剂显著抑制。通过qrt-pcr检测了不同类型hrp基因的mrna水平，结果发现hpa1、hrpe、hrpf、hrcc以及调控基因hrpg和hrpx的转录水平都有不同程度的降低，表明化合物ⅲ-7影响了xoo中t3ss的表达水平，而且可能是通过hrpg/hrpx的调控途径来实现的。3.t3ss抑制剂对水稻白叶枯病菌致病性的影响检测化合物ⅲ-7是否抑制xoo对水稻的致病性。结果表明，在水稻感病品种ir24幼苗叶片上，xoo引起的水渍状病斑可被化合物ⅲ-7显著地抑制。而在ir24成株叶片上，xoo引起的白叶枯病害症状也被抑制。综上，本发明提供的化合物ⅲ-7为t3ss抑制剂，其可能通过hrpg/hrpx调控途径影响了hrp基因转录，从而不同程度地影响了xoo在水稻上的致病性。这一结果为t3ss抑制剂在农业生产上作为细菌病害的新型防治药剂应用提供了理论依据。以下实施例为测试合物ⅲ-1～ⅲ-16对水稻白叶枯t3ss的抑制作用，供试病原菌种：xoo野生型菌株pxo99a，及相应的突变体菌株(hpa1inpxo99a，hrpginpxo99a和hrpxinpxo99a)，主要引发水稻白叶枯病。待测化合物用dmso溶解，配制成浓度为10mg/ml的待测液。实施例17：测试化合物ⅲ-1～ⅲ-16对hpa1基因启动子的抑制作用将含有hpa1的pxo99a菌株在psa平板上划线活化，2～3天后挑取单菌落置于m210液体培养基，加入头孢和氨苄，生长至od600约为2.0，按照1:100转接至新鲜的m210培养基中，生长至od600约为0.6，离心收集菌体，xom2培养基洗菌体一次，之后重悬于xom2培养基中，加入头孢和氨苄，调节od600至0.3，加入待测化合物至其终浓度为10μg/ml，等体积dmso作为溶剂对照，于28℃、200r/min条件下处理15h，每个处理重复3次，离心收集菌体并用0.01mol/lpbs(ph＝7.4)缓冲液重悬菌体，调节od600约为0.1，流式细胞仪检测gfp平均荧光强度(mfi)。实验结果显示化合物对hpa1启动子活性都具有强烈的抑制作用，其中有7个化合物的抑制率均超过60％，具体化合物和抑制率见表2所示。表2xoo中iii型分泌系统抑制剂的启动子抑制活性筛选结果化合物mfi抑制率％dmso12754.03±534.05-iii-12774.60±799.2178.25iii-4195.93±5.0898.46iii-74435.97±168.5265.22iii-8177.40±21.9298.61iii-9178.23±16.8898.60iii-11172.17±33.5298.65iii-154029.87±83.9768.40实施例18：表2中7种化合物对pxo99a生长的影响分别测定丰富培养基m210和t3ss诱导培养基xom2中待测化合物存在条件下pxo99a的生长曲线。由于xom2是贫瘠培养基，pxo99a在其中几乎不生长，因此补充了0.5％蔗糖作为碳源(tianetal.,2014)。将xoo野生型菌株pxo99a在psa平板上划线活化，2～3天后挑取单菌落置于m210液体培养基，加入头孢，生长至od600约为2.0，离心收集菌体，无菌水洗菌体一次，之后重悬于m210或者xom2中，调节od600为0.1。分别加入10μg/ml待测化合物，置于96孔板上，等体积dmso作为溶剂对照，每处理设置3个重复。设置温度为28℃，全自动生长曲线仪测定。每1h读取一次数据，共测定72h。该试验独立重复3次。化合物ⅲ-7对pxo99a在培养基m210和t3ss中的生长影响结果见图1，其中a和b分别为iii-7存在条件下pxo99a在丰富培养基m210和贫瘠培养基xom2中的生长曲线。结果表明，与dmso对照相比较，在pxo99a生长的迟缓期、对数期和稳定期，化合物ⅲ-7没有表现出明显抑制pxo99a生长的作用。化合物ⅲ-1、ⅲ-4、ⅲ-8、ⅲ-9、ⅲ-11和ⅲ-15对pxo99a在培养基m210和t3ss中的生长影响结果见图2，其中a和b分别为化合物存在条件下pxo99a在丰富培养基m210和贫瘠培养基xom2中的生长曲线。结果表明，与dmso对照相比较，化合物ⅲ-1、ⅲ-4、ⅲ-8、ⅲ-9、ⅲ-11和ⅲ-15均表现出明显抑制pxo99a生长的作用。而化合物ⅲ-7对pxo99a的生长无影响。实施例19：化合物ⅲ-7的菌落计数pxo99a菌株于m210培养基中培养至od600约为2.0，按照1:100转接至新鲜的m210培养基中，生长至od600约为0.6，离心收集菌体，双蒸水重悬，分别加入10μg/ml的待测化合物，混合液稀释106倍，对照组为等体积的dmso，28℃条件下处理2h。各取100μl混合液涂到psa平板上，3～4天后菌落计数。化合物ⅲ-7的菌落计数如图3所示。结果表明化合物ⅲ-7没有明显的杀菌作用。实施例20：化合物ⅲ-7对pxo99a的相关基因表达的影响由于之前的研究表明ⅲ-7抑制t3ss但不影响xoo的生长，推测它们有可能是特定针对t3ss，因此检测三个t3ss抑制剂存在时xoo中t3ss相关基因的表达水平。pxo99a菌株于m210液体培养基中28℃振荡培养至od600为1.0。离心收集菌体，xom2培养基洗菌体一次，重悬于xom2培养基中，调节od600至0.6，分别加入10μg/ml的待测化合物。等体积dmso作为溶剂对照。在28℃，200r/min条件下振荡培养15h，收集菌体用于rna的提取。1％琼脂糖凝胶电泳检测所提取的rna完整度，微量紫外分光光度计测定od260/280比值，确认rna纯度。用随机引物进行反转录合成第一链cdna。实时定量pcr采用sybrgreen方法进行，反应体系和程序均参照试剂盒说明书。本试验采用gyrb作为内参基因(tsugeetal.,2006)，每对基因六个重复，该试验独立重复3次。采用运算公式2-△△ct对相对基因的表达进行分析。测试基因包括：t3ss的主要调控基因hrpg、hrpx和具有代表性的基因、hrpe(编码hrpplius蛋白)、hrpf(可能编码转位子蛋白)、hrcc(编码膜外分泌装置的组份蛋白)以及编码输出装置蛋白的hrcu(gurlebecketal.，2006)，具体测试基因为：hpa1、hrpg、hrpx、hrpe、hrpf、hrcc。测试菌株：xoo野生型菌株pxo99a，及相应的突变体菌株(hpa1inpxo99a、hrpginpxo99a、hrpxinpxo99a和hrctinpxo99a)化合物ⅲ-7对基因hpa1、hrpg、hrpx、hrpe、hrpf和hrcc表达的影响见图4。结果显示对hpa1的mrna的水平，化合物ⅲ-7表现为下调约70％；对hrpx的mrna的水平，化合物ⅲ-7也表现为下调作用，下调约50％；对hrpg的mrna水平，化合物下调约50％，对于基因hrpe、hrpf和hrcc，化合物均表现为显著下调作用。实施例21：化合物ⅲ-7对hrpg和hrpx基因启动子活性测试基因hrpg和hrpx为t3ss的主要调控基因，具体的检测方法同实施例17。结果见图5。结果表明，与dmso对照相比，hrpg的启动子活性受到明显的抑制。实施例22：化合物ⅲ-7对hrct基因启动子活性测试基因hrct是通过与基因启动子区域的pip-box序列结合而调控基因表达，所以本实验中选择的是启动子序列中带有pip-box的基因，测定化合物ⅲ-7对此启动子活性的影响。检测方法同实施例17。结果见图6。化合物ⅲ-7对hrct基因启动子表现出极为强烈的抑制作用。实施例23、化合物ⅲ-7对xoo菌株在水稻上的致病性的影响水稻品种：感病品种ir24。xoo菌株在感病水稻叶片上可以产生水渍状的病斑(water-soaking)。pxo99a菌株于m210培养基中培养至od600约为2.0，离心收集菌体，无菌水重悬菌体，并调节od600至为0.8，分别加入10μg/ml的待测化合物，等体积dmso作为溶剂对照组，28℃条件下处理2h。幼苗接种：用无针头注射器将处理后的pxo99a菌株接种于培养两周的感病水稻品种ir24上，每片剑叶的中部接种一个样品，每个样品接种10片叶片，对照组1为接种等量的dmso(为图7中wt下方的dmso组)，对照组2为接种等量的未处理的pxo99a菌株(为图7中wt下方的none组)；同时，分别以单独的dmso或者化合物ⅲ-7为对照组接种幼苗(为图7中左边两组)；以ts006处理后的pxo99a菌株为阳性对照接种幼苗。接种后继续置于温室培养，72h后拍照观察叶片上water-soaking症状的发生状况。结果见图7。结果表明，与对照组1、对照组2和阳性对照比相比，经化合物ⅲ-7处理后的pxo99a菌株在水稻幼苗上所产生的water-soaking症状具有明显的减轻。成株接种：在成株水稻上采用剪叶接种法，接种14天后统计病斑的长度。空白对照组(none组)为未处理的pxo99a菌株，溶剂对照组(dmso组)为加有溶剂dmso的未处理的pxo99a菌株。测试结果如图8和图9所示。其中图8为经过处理后，成株叶片上病斑的长度实体结果；图9为病斑长度的统计结果及显著性分析。从图8和图9中可知，与空白对照组和溶剂对照组相比，经过化合物ⅲ-7处理后，成株叶片上的病斑长度降低了至少50％，与阳性对照组ts006的病斑长度无明显差异。离体接种：在成株水稻上采用剪叶接种法，剪下的离体叶片置于含0.8％的琼脂培养基上，适时补水。空白对照组为未处理的pxo99a菌株(图10中的none组)。放于28℃培养箱培养。测试结果如图10所示，从图中可知，经化合物ⅲ-7处理后，离体叶片上仅在叶片边缘有不明显的黄色病斑，叶片上无明显大面积病斑；且从病斑大小可知，化合物ⅲ-7对pxo99a菌株在离体叶片上的致病性的抑制率明显优于阳性对照组ts006。从图7～图10中可知，不管是在幼苗植株、成株植株还是在离体叶片上，与空白对照、溶剂对照组相比，化合物ⅲ-7均能够显著的降低pxo99a菌株的病斑，经化合物ⅲ-7处理后，叶片上的病斑明显的减轻，甚至在离体叶片上几乎无明显的病斑，对pxo99a菌株致病性的抑制率优于阳性对照组ts006。即使与本申请人前期的研究成果(201710846135.3)中的化合物ⅲ-2、ⅲ-3和ⅲ-4(分别经三种化合物处理后，成株叶片上的病斑长度的降低率不超过30％)相比，在同样不影响pxo99a菌株生长的情况下，本发明所述化合物ⅲ-7对于pxo99a菌株在成株植物上致病性的抑制效果也明显优于前期专利中的化合物ⅲ-2、ⅲ-3和ⅲ-4。当前第1页12