本发明涉及一种制备二代测序接头的方法，属于分子生物学领域。
背景技术
在illumina测序平台中，接头是二代测序建库中必要的元素，目前官方的接头包含多种类型，序列中包含了p5与p7扩增引物结合序列、read1和read2测序引物结合序列、样本标签序列、分子标签序列等，并且带有用于a/t连接的3’-dt尾。
目前常于p7端设计单链分子标签用于给建库中的目标分子添加标签，使生信分析过程可以捕获到更精细的分子信息，降低变异分析的背景噪音。
另外，也可以通过双链分子标签，结合单链分子标签，通过生信将变异分析的背景噪音降得更低，使测序分析结果更加精准可靠。
但是，目前没有较好的双链标签添加方法方便于文库构建。
1、目前接头通常不含单链分子标签、或仅含有单链分子标签二不含双链标签，生物信息分析降噪效果有限；
2、如capp-seq技术中含有双链标签，但是标签数较低，对生物信息分析的改进有限。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种制备二代测序接头的方法，以解决上述问题。
本发明采用了如下技术方案：
一种制备二代测序接头的方法，其特征在于，包括：
步骤一：合成接头序列，接头序列包含第一序列和第二序列，
其中，所述第二序列包括：限制性内切酶的保护碱基和随机碱基的双链分子标签，
步骤二：接头序列退火，混匀第一序列和第二序列，在退火体系中按退火程序退火形成双链，
步骤三：补齐步骤二中所形成的双链的接头，
步骤四：酶切回收接头，
第一序列的序列如下：
5-a*a*tgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac-gctcttccgat*c*t-3，
第二序列的序列如下：
5-nnnnannnncccagtag*a*tcggaagagcacacgtctgaactccagtcacnnnn-nnnnnnnn-atctcgtatgccgtcttctgct*t*g-3，
第二序列中，第1至4位为限制性内切酶的保护碱基，
第6位至第9位是四个随机碱基的双链分子标签，
第50位至第53位是四个随机碱基的单链分子标签，
第54位至第61位是6-8个碱基的样本标签。
进一步，本发明的制备二代测序接头的方法，还具有这样的特征：其中，所述第二序列中还具有随机碱基的单链分子标签。
进一步，本发明的制备二代测序接头的方法，还具有这样的特征：其中，所述第二序列中还具有样本标签。
进一步，本发明的制备二代测序接头的方法，还具有这样的特征：其中，所述第二序列中还具有限制性内切酶bmri的酶切位点。
进一步，本发明的制备二代测序接头的方法，还具有这样的特征：步骤三中，采用t4dna聚合酶延伸补平步骤二中的退火产物。
进一步，本发明的制备二代测序接头的方法，还具有这样的特征：步骤四中，采用限制性内切酶bmri酶切步骤三中的延伸产物，并采用上海翊圣生物科技有限公司的hieffngs™smarterdnacleanbeads纯化回收接头，去除50bp以内的残余双链小片段，保留接头。
发明的有益效果
本发明的制备二代测序接头的方法，具有以下优势：
1.接头中含有更长的双链分子标签，为生信分析提供更好的信息基础；而现有的产品通常不带双链分子标签、罗氏的带2bp的双链分子标签。
2.可以有效、较经济实惠地合成获得；
3.适用于illuminahi-seq、mi-seq等测序平台。
具体实施方式
以下通过具体实例来说明本发明的具体实施方式。
步骤一：合成接头序列。合成以下两种序列：
序列1：
5-a*a*tgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac-gctcttccgat*c*t-3
序列2：
5-nnnn-annnncccagt-ag*a*tcggaagagc-acacgtctgaactccagtcac-nnnn-nnnnnnnn-atctcgtatgccgtcttctgct*t*g-3
序列中“*”为保护性修饰；
第1至第4位的碱基为限制性内切酶的保护碱基，在其它的实施方式中，5’端的保护性碱基，可选的碱基数为0-10个，具体碱基可变，具体根据实际案例设计而定；
第6位至第9位是四个随机碱基的双链分子标签，
第50位至第53位是四个随机碱基的单链分子标签，
第54位至第61位是6-8个碱基的样本标签。每次合成固定碱基的序列，次序列可变；
第10位至第15位的碱基为限制性内切酶bmri的酶切位点。
步骤二：接头序列退火。
步骤三：延伸补齐接头。采用t4dna聚合酶延伸补平步骤二中的退火产物。
步骤四：酶切回收3’-dt尾接头。采用限制性内切酶bmri酶切步骤三中的延伸产物，并采用上海翊圣生物科技有限公司的hieffngs™smarterdnacleanbeads纯化回收接头，去除50bp以内的残余双链小片段，保留接头。
双链分子标签接头制备示例：
1、合成接头序列：
序列1：
5-a*a*tgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac-gctcttccgat*c*t-3
序列2：
5-tttc-annnncccagt-ag*a*tcggaagagc-acacgtctgaactccagtcac-nnnn-nnnnnnnn-atctcgtatgccgtcttctgct*t*g-3
2、接头序列退火：
1:1混匀序列1和序列2，在退火体系中按退火程序退火形成双链，形成以下结构：
3、延伸补齐接头：
利用t4dna聚合酶延伸补齐接头序列，如下：
4、酶切回收3’-dt尾接头：
利用bmri限制性内切酶酶切上述接头，并利用上海翊圣生物科技有限公司的hieffngs™smarterdnacleanbeads纯化回收接头，接头如下：
本发明所提供的接头制备方法，回收效率在40%~80%。
序列表
<110>翌圣生物科技(上海)有限公司
<120>一种制备二代测序接头的方法
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