本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种性能优异的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒。
背景技术
亮氨酸氨基肽酶(leucineaminopeptidase，lap)是一类广泛存在于人体组织中的蛋白水解酶，广泛分布于人体的肝、胰、胆、肾、小肠及子宫等组织中，尤以肝脏中含量最为丰富。亮氨酸氨基肽酶能够特异性地水解n-末端为亮氨酸的肽链，在各种生命活动中起重要作用。
肝脏中含有丰富的lap，参与极其复杂的代谢功能，当肝细胞病变引起大量分裂增殖，大量合成分泌的lap等酶释放入血而使其活性升高，因此根据血清中酶活性的增高，可判断肝脏病变的性质和程度从而诊断疾病。各类肝病患者因肝细胞损伤，血清lap的活性均有不同程度的升高。一般慢性肝炎从轻度、中度到重度，血清lap水平随之升高，能一定程度上反映病情的轻重，而且原发性肝癌lap增高尤为显著。因此，血清lap活性的检测能从不同侧面反映各种肝病的发生、发展。除了临床上公认的甲型胎儿蛋白、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、谷酰转氨酶等指标外，近年来，血清lap的活性作为对各类肝病的诊断及病情估计的良好酶学指标受到重视。
目前，用于亮氨酸氨基肽酶的检测方法主要有连续监测法、二甲氨基苯甲醛显色法及荧光法等。lap对底物的特异性要求不高，能水解多种l-亮氨酸衍生物，目前血清lap活性测定多采用l-亮氨酰-2-萘胺、l-亮氨酰-p-硝基苯胺或l-亮氨酰羧基苯胺为底物。基于lap催化水解各底物产生有色的芳胺衍生物来定量酶，目前l-亮氨酰-p-硝基苯胺(leu-pna)作为底物最为常用，但是该底物在设计成为单试剂时，容易发生底物变色，会较大影响检测就结果，而l-亮氨酰-2-萘胺相对其他底物更加稳定有效。因此，本发明以l-亮氨酰-β-萘胺为底物，提供一种性能优异的用连续监测法检测亮氨酸氨基肽酶的试剂盒，优化其反应体系，使其重复性好、稳定性好、可进行批量样本全自动化检测。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种性能优异的稳定性好的用于检测亮氨酸氨基肽酶的试剂盒，该试剂盒采用连续监测法。该试剂盒与常规的试剂盒相比，稳定性和线性范围比常规的检测试剂盒要好有利于试剂在临床上的推广应用。
基本原理：
本试剂盒以l-亮氨酰-2-萘胺盐酸盐为底物，亮氨酸氨基肽酶将其分解释放出黄色的2-萘胺，在主波长450nm，副波长为660nm处检测吸光度变化率，测得亮氨酸氨基肽酶的活性值。
发明是通过以下步骤得到的：
一种性能优异的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒，其特征在于包含试剂r。其试剂组成为：40mmol/lph为8.6的b-r缓冲液、20g/l聚乙二醇2万、10mmol/ln-β-羟基乙基乙二胺三乙酸、50mmol/l氯化钠、4.8mmol/ll-亮氨酰-2-萘胺盐酸盐、10mmol/lbrom-nitro-dioxan(bnd)。
所述的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒，其特征在于试剂缓冲液为25℃，ph为8.6的b-r缓冲液。
所述的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒，其特征在于所述表面活性剂为聚乙二醇2万。
所述的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒，其特征在于所述稳定剂为n-β-羟基乙基乙二胺三乙酸。
所述的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒，其特征在于，使用全自动生化分析仪采用速率法进行测定，检测主波长为450nm，副波长为660nm。
本发明的试剂盒在具有双试剂功能的全自动生化分析仪上进行，其具体使用方法如下：
加入生理盐水、样本或校准品10μl，再加入300μl的试剂r，预孵育3min后读取吸光度a1，再反应2min后读取吸光度a2，并计算δa/min。
本发明的有益效果：
1)本发明优选了b-r缓冲液作为反应体系的缓冲液，有利于提高反应体系中底物的稳定性和酶反应的活性；
2)重金属离子和一般的重金属离子螯合剂都会对亮氨酸氨基肽酶的活性产生影响，因此本发明优先选择了比较温和的稳定剂n-β-羟基乙基乙二胺三乙酸，来降低重金属离子对酶的活性的抑制；
3)优选聚乙二醇4万作为酶反应体系的活化剂，增加适量的氯化钠作为离子平衡剂。
4)本发明优选了brom-nitro-dioxan(bnd)作为防腐剂，既可以降低防腐剂对酶活性的抑制，又能高效的防止试剂生菌。
附图说明
图1为两种试剂的相关性曲线图，
图2为两种试剂效期稳定性曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
一种性能优异的常规的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒，试剂组成为：
本实施例所述试剂r，配置时需先配制缓冲液，调到适当ph值后，再添加其它物质。本实施例所述试剂盒在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪，利用速率法进行测定，操作如下：
加入生理盐水、样本或校准品10μl，再加入300μl的试剂r，预孵育3min后读取吸光度a1，再反应2min后读取吸光度a2，并计算δa/min。
δa/min＝(a2-a1)/反应时间
亮氨酸氨基肽酶含量(u/l)＝δa/min×理论因子
实施例2
准确度验证试验：将实施例1的亮氨酸氨基肽酶检测试剂作为实验组，市场上获得认可的一种性能优异的准确度好、稳定性好的亮氨酸氨基肽酶检测试剂作为对照组进行检测，对20个临床血清样本进行检测，检测结果如表1所示。获得了两种试剂的相关性曲线(如图1所示)，结果表明，两组试剂盒的相关系数为0.9989，说明两者相关性比较好。证明本发明试剂盒添加及更改的组分对其准确性不会造成影响，试剂盒依然保持较好的准确度。
表1实施例1试剂与市场认可的亮氨酸氨基肽酶检测试剂对比检测结果
实施例3
线性相关性验证试验：选取亮氨酸氨基肽酶含量为240u/l的高值样本，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同浓度的样本，浓度依次为240u/l、192u/l、144u/l、96u/l、48u/l、0u/l。分别利用实施例1试剂及对照组试剂进行检测，每个浓度的样本分别测定三次，分别取平均值，检测结果如表2所示。
表2实施例1试剂线性相关验证实验检测结果
如上表所示，实施例1与对照组试剂检测结果相关系数均大于0.990，且实施例1试剂检测结果的相关系数略大于对照组试剂检测结果的相关系数，这表明本发明试剂具有更好的线性相关性。
实施例4
稳定性验证实验：在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂，检测实施例1及对照组试剂的稳定性。每月1号分别用两组试剂测定同一混合血清样本，测定三次取平均值，检测数据如表3所示。
表3实施例1试剂稳定性验证实验检测结果
实验结果显示，实施例1试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定，而对照组试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存12个月开始不稳定，说明本发明试剂稳定性优于对照实验组。
综上所述，因此，本发明提供的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒具有良好的性能有利于在市场中进一步的推广使用。