本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种高密度发酵维生素b2的方法。
背景技术
维生素b2又名核黄素，为体内黄酶类辅基的组成部分（黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用），当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。主要用于防治核黄素缺乏症，如口角炎、唇炎、舌炎和眼结膜炎等。近年来，也有研究表明，核黄素还具有利尿、降血脂和改善心脏功能等作用。核黄素的合成主要有化学合成法和微生物发酵法，由于化学合成法较为复杂而且生产成本较高，目前核黄素主要采用微生物发酵法进行生产。
但是目前的发酵法存在菌株生长状况较差，发酵周期较长，核黄素产量较低的情况，其主要原因包括：菌种没有筛选，菌种退化严重；发酵培养基效果不佳；发酵条件，如溶氧浓度、培养温度、发酵液的ph值、补料方式及发酵液流变学特性等未得到好的控制。
技术实现要素：
针对上述情况，本发明的目的是提供一种高密度发酵维生素b2的方法，通过对发酵菌株、种子培养基、发酵培养基和发酵过程及参数的限定，高密度发酵生产维生素b2，实现维生素b2产量的提高。
本发明提供一种高密度发酵维生素b2的方法，以枯草芽孢杆菌为发酵菌株，通过高密度发酵工艺，提高维生素b2的发酵水平，包括以下步骤：
1）取新鲜活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种，接种于已灭菌装有种子培养基的种子罐中，在37～42℃、120～140rpm下，好氧培养12～18h，得到种子培养液；种子培养基的组成为：蔗糖18-24g/l，硝酸钠8-12g/l，硝酸铵5-8g/l，七水硫酸镁1-2g/l，磷酸二氢钾0.8-1.2g/l，磷酸氢二钾1.5-2.5g/l，酵母抽提物3-5g/l，氯化亚铁1-3g/l，硫酸锌1-3g/l，氯化锰2.5-5g/l，ph为6.7～6.9；
2）将种子培养液移入装有发酵培养基、消泡剂和葡萄糖液的发酵罐中开始发酵，发酵培养基的组成为：蔗糖90-120g/l，酵母抽提物10-14g/l，硝酸钠8-12g/l，硝酸铵6-8g/l，磷酸二氢钾7-9g/l，磷酸氢二钾3-5g/l，硫酸镁2-4g/l，氯化亚铁1.5-3g/l，硫酸锌2-4g/l，氯化锰3-5g/l，甜菜碱0.2-1.5g/l，ph为6.8～7.2，初始葡萄糖的浓度为15-25g/l；
发酵分为两阶段进行，第一阶段中，保持发酵温度为37～40℃，以液氨调节ph为6.8～7.2，控制通气比为1︰0.6～0.9，使溶氧量达到15～30%，发酵使葡萄糖消耗完，继续发酵2-3小时；第二阶段中，保持发酵温度为37～39℃，调节ph为7.0～7.2，控制通气比为1：1.0～1.5，控制溶氧量在20～30%，补加灭菌葡萄糖液，控制葡萄糖浓度在5-15g/l之间，直至菌株衰老，补加的葡萄糖消耗完，终止发酵；
3）步骤2）得到的发酵液进入提取工序提取核黄素。
本发明中，采用的枯草芽孢杆菌斜面菌种由以下方法制得：将枯草芽孢杆菌原始菌株的菌液在无菌条件下进行紫外诱变，得到紫外诱变菌株，再用甲基磺酸乙酯进行化学诱变，得到复合诱变菌株；然后将复合诱变菌株依次接种到代谢底物类似物8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、6-巯基鸟嘌呤、dl-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素的基本培养基中进行培养驯化，制得抗性突变株；将处理过的菌株接种到营养培养基中进行培养，得到的营养培养物再接种到菌株发酵培养基中进行培养，筛选出生产维生素b2最高的菌株。通过该方法制得的菌种，通过特殊的诱导方式，并经过筛选，得到较高的维生素b2生产菌株。
优选地，种子培养基的组成为：蔗糖18-20g/l，硝酸钠9-11g/l，硝酸铵6-8g/l，七水硫酸镁1-1.5g/l，磷酸二氢钾0.9-1g/l，磷酸氢二钾1.5-2g/l，酵母抽提物4-5g/l，氯化亚铁1-2g/l，硫酸锌2-3g/l，氯化锰3-5g/l，ph为6.7～6.9。
进一步优选地，种子培养基的组成为：蔗糖20g/l，硝酸钠10g/l，硝酸铵7g/l，七水硫酸镁1.5g/l，磷酸二氢钾1g/l，磷酸氢二钾2g/l，酵母抽提物4g/l，氯化亚铁2g/l，硫酸锌2g/l，氯化锰4g/l。
优选地，发酵培养基的组成为：蔗糖110-120g/l，酵母抽提物12-14g/l，硝酸钠9-10g/l，硝酸铵7-8g/l，磷酸二氢钾8-9g/l，磷酸氢二钾3-4g/l，硫酸镁2-3g/l，氯化亚铁2-3g/l，硫酸锌2-3g/l，氯化锰3-4g/l，甜菜碱0.5-1.2g/l，ph为6.8～7.2。
进一步优选地，发酵培养基的组成为：蔗糖110g/l，酵母抽提物12g/l，硝酸钠10g/l，硝酸铵7g/l，磷酸二氢钾8g/l，磷酸氢二钾4g/l，硫酸镁3g/l，氯化亚铁2g/l，硫酸锌3g/l，氯化锰4g/l，甜菜碱1g/l。
优选地，消泡剂的用量为发酵罐中总物料的0.01～0.03wt%。
优选地，初始葡萄糖的浓度为18-22g/l。
优选地，第二阶段中，将葡萄糖的浓度分为两阶段控制，具体地，发酵的0-20小时，控制葡萄糖的浓度为8-10g/l，发酵的21-40小时，控制葡萄糖的浓度为3-6g/l。采用该种控制可更有效的实现高密度发酵，切合菌种的实际生长状况。
根据本发明，发酵过程中，以无菌水补充蒸发的水量，并保持发酵罐罐压为0.03～0.10mpa。
本发明中的高密度发酵是一个相对概念，一般指培养液中工程菌生长密度在50g/l（dwc）以上。
本发明中，发酵过程中未加限定的参数和工艺步骤均选用本领域的常规技术手段，例如，发酵罐中的物料添加量、菌种接种量等。
本发明中，从发酵液中分离提取核黄素可采用现有技术中常规使用的分离提纯方法。
与现有技术相比，本发明具有如下有益点：
本发明通过筛选菌种、限定种子培养基和发酵培养基，并对发酵的工艺步骤和参数进行了限定，实现高密度发酵维生素b2，提高维生素b2的产量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1-3用于说明本发明的高密度发酵维生素b2的方法。
实施例1
一种高密度发酵维生素b2的方法，以枯草芽孢杆菌为发酵菌株，通过高密度发酵工艺，提高维生素b2的发酵水平，包括以下步骤：
1）取新鲜活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种，接种于已灭菌装有种子培养基的种子罐中，在37～40℃、120～140rpm下，好氧培养15～18h，得到种子培养液；种子培养基的组成为：蔗糖18g/l，硝酸钠8g/l，硝酸铵5g/l，七水硫酸镁1g/l，磷酸二氢钾0.8g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，酵母抽提物3g/l，氯化亚铁1g/l，硫酸锌1g/l，氯化锰2.5g/l，ph为6.7～6.9；
2）将种子培养液移入装有发酵培养基、消泡剂和葡萄糖液的发酵罐中开始发酵，消泡剂的用量为发酵罐中总物料的0.01wt%，发酵培养基的组成为：蔗糖100g/l，酵母抽提物10g/l，硝酸钠8g/l，硝酸铵6g/l，磷酸二氢钾7g/l，磷酸氢二钾3g/l，硫酸镁2g/l，氯化亚铁1.5g/l，硫酸锌2g/l，氯化锰3g/l，甜菜碱0.5g/l，ph为6.8～7.0，初始葡萄糖的浓度为15g/l；
发酵分为两阶段进行，第一阶段中，保持发酵温度为38～40℃，以液氨调节ph为6.9～7.1，控制通气比为1︰0.8，使溶氧量达到20～30%，发酵6小时使葡萄糖消耗完，继续发酵2小时；第二阶段中，保持发酵温度为37～39℃，调节ph为7.0～7.2，控制通气比为1：1.2，控制溶氧量在25～30%，补加灭菌葡萄糖液，发酵的0-20小时，控制葡萄糖的浓度为8-10g/l，发酵的21-40小时，控制葡萄糖的浓度为3-6g/l，直至菌株衰老，补加的葡萄糖消耗完，终止发酵；发酵过程中，以无菌水补充蒸发的水量，并保持发酵罐罐压为0.05mpa；
3）步骤2）得到的发酵液进入提取工序提取核黄素。
其中，采用的枯草芽孢杆菌斜面菌种由以下方法制得：将枯草芽孢杆菌原始菌株的菌液在无菌条件下进行紫外诱变，得到紫外诱变菌株，再用甲基磺酸乙酯进行化学诱变，得到复合诱变菌株；然后将复合诱变菌株依次接种到代谢底物类似物8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、6-巯基鸟嘌呤、dl-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素的基本培养基中进行培养驯化，制得抗性突变株；将处理过的菌株接种到营养培养基中进行培养，得到的营养培养物再接种到菌株发酵培养基中进行培养，筛选出生产维生素b2最高的菌株。
采用上述方法得到的维生素b2的发酵效价为28.05g/l。
实施例2
一种高密度发酵维生素b2的方法，以枯草芽孢杆菌为发酵菌株，通过高密度发酵工艺，提高维生素b2的发酵水平，包括以下步骤：
1）取新鲜活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种，接种于已灭菌装有种子培养基的种子罐中，在37～40℃、120～140rpm下，好氧培养15～18h，得到种子培养液；种子培养基的组成为：蔗糖20g/l，硝酸钠10g/l，硝酸铵7g/l，七水硫酸镁1.5g/l，磷酸二氢钾1g/l，磷酸氢二钾2g/l，酵母抽提物4g/l，氯化亚铁2g/l，硫酸锌2g/l，氯化锰4g/l，ph为6.7～6.9；
2）将种子培养液移入装有发酵培养基、消泡剂和葡萄糖液的发酵罐中开始发酵，消泡剂的用量为发酵罐中总物料的0.03wt%，发酵培养基的组成为：蔗糖110g/l，酵母抽提物12g/l，硝酸钠10g/l，硝酸铵7g/l，磷酸二氢钾8g/l，磷酸氢二钾4g/l，硫酸镁3g/l，氯化亚铁2g/l，硫酸锌3g/l，氯化锰4g/l，甜菜碱1g/l，ph为6.8～7.0，初始葡萄糖的浓度为20g/l；
发酵分为两阶段进行，第一阶段中，保持发酵温度为38～40℃，以液氨调节ph为6.9～7.1，控制通气比为1︰0.8，使溶氧量达到20～30%，发酵8小时使葡萄糖消耗完，继续发酵2小时；第二阶段中，保持发酵温度为37～39℃，调节ph为7.0～7.2，控制通气比为1：1.5，控制溶氧量在25～30%，补加灭菌葡萄糖液，发酵的0-20小时，控制葡萄糖的浓度为8-10g/l，发酵的21-40小时，控制葡萄糖的浓度为3-6g/l，直至菌株衰老，补加的葡萄糖消耗完，终止发酵；发酵过程中，以无菌水补充蒸发的水量，并保持发酵罐罐压为0.06mpa；
3）步骤2）得到的发酵液进入提取工序提取核黄素。
其中，采用的枯草芽孢杆菌斜面菌种由以下方法制得：将枯草芽孢杆菌原始菌株的菌液在无菌条件下进行紫外诱变，得到紫外诱变菌株，再用甲基磺酸乙酯进行化学诱变，得到复合诱变菌株；然后将复合诱变菌株依次接种到代谢底物类似物8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、6-巯基鸟嘌呤、dl-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素的基本培养基中进行培养驯化，制得抗性突变株；将处理过的菌株接种到营养培养基中进行培养，得到的营养培养物再接种到菌株发酵培养基中进行培养，筛选出生产维生素b2最高的菌株。
采用上述方法得到的维生素b2的发酵效价为29.23g/l。
实施例3
一种高密度发酵维生素b2的方法，以枯草芽孢杆菌为发酵菌株，通过高密度发酵工艺，提高维生素b2的发酵水平，包括以下步骤：
1）取新鲜活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种，接种于已灭菌装有种子培养基的种子罐中，在37～40℃、120～140rpm下，好氧培养15～18h，得到种子培养液；种子培养基的组成为：蔗糖22g/l，硝酸钠10g/l，硝酸铵7g/l，七水硫酸镁1g/l，磷酸二氢钾1.2g/l，磷酸氢二钾2.5g/l，酵母抽提物5g/l，氯化亚铁3g/l，硫酸锌2g/l，氯化锰3g/l，ph为6.7～6.9；
2）将种子培养液移入装有发酵培养基、消泡剂和葡萄糖液的发酵罐中开始发酵，消泡剂的用量为发酵罐中总物料的0.02wt%，发酵培养基的组成为：蔗糖120g/l，酵母抽提物14g/l，硝酸钠10g/l，硝酸铵7g/l，磷酸二氢钾7g/l，磷酸氢二钾3g/l，硫酸镁4g/l，氯化亚铁2g/l，硫酸锌3g/l，氯化锰4g/l，甜菜碱1g/l，ph为6.8～7.0，初始葡萄糖的浓度为25g/l；
发酵分为两阶段进行，第一阶段中，保持发酵温度为38～40℃，以液氨调节ph为6.9～7.1，控制通气比为1︰0.8，使溶氧量达到20～30%，发酵10小时使葡萄糖消耗完，继续发酵2小时；第二阶段中，保持发酵温度为37～39℃，调节ph为7.0～7.2，控制通气比为1：1.2，控制溶氧量在25～30%，补加灭菌葡萄糖液，发酵的0-20小时，控制葡萄糖的浓度为8-10g/l，发酵的21-40小时，控制葡萄糖的浓度为3-6g/l，直至菌株衰老，补加的葡萄糖消耗完，终止发酵；发酵过程中，以无菌水补充蒸发的水量，并保持发酵罐罐压为0.03mpa；
3）步骤2）得到的发酵液进入提取工序提取核黄素。
其中，采用的枯草芽孢杆菌斜面菌种由以下方法制得：将枯草芽孢杆菌原始菌株的菌液在无菌条件下进行紫外诱变，得到紫外诱变菌株，再用甲基磺酸乙酯进行化学诱变，得到复合诱变菌株；然后将复合诱变菌株依次接种到代谢底物类似物8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、6-巯基鸟嘌呤、dl-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素的基本培养基中进行培养驯化，制得抗性突变株；将处理过的菌株接种到营养培养基中进行培养，得到的营养培养物再接种到菌株发酵培养基中进行培养，筛选出生产维生素b2最高的菌株。
采用上述方法得到的维生素b2的发酵效价为27.35g/l。
以上已经描述了本发明的实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的实施例。在不偏离所说明实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。