一株疫苗株rSN-R92G-E93K及其构建方法和应用与流程

本发明属于流感疫苗制备
技术领域：
，具体涉及一株疫苗株rsn-r92g-e93k及其构建方法和应用。
背景技术：
：h9亚型低致病性禽流感病毒(lowpathogenicavianinfluenzavirus，lpaiv)，虽然对家禽的致死率低，但可导致产蛋量急剧下降，同时引起免疫抑制，如混合感染可造成较高的死亡率，对我国养禽业造成的经济损失巨大。h9亚型aiv还会作为其他亚型流感病毒内部基因的供体，为新型流感病毒株的产生提供条件，引发新流感疫情的爆发，对公共卫生安全造成潜在威胁，如h9n2亚型aiv为2013年以来在我国流行的新型h7n9病毒提供了6个内部基因片段。疫苗免疫是预防h9n2亚型禽流感发生与传播的有效手段之一，早期主要采用ck/sd/6/9和ck/sh/f/98等毒株制备的灭活疫苗对鸡群进行免疫以防控h9n2亚型禽流感。由于h9n2毒株抗原变异速度快，流行株常表现出与疫苗株不同的抗原特性，因此需要不断升级疫苗株以应对h9n2亚型禽流感的抗原变异。尽管如此，h9亚型的禽流感疫苗免疫失败在免疫鸡群中时有发生，甚至在免疫鸡群中爆发疫情。禽流感病毒ha蛋白是病毒的主要抗原成分，ha蛋白抗原表位丰富，能够刺激机体产生针对这些表位的特异性抗体，抗体通过识别并结合相应抗原表位，使病毒无法吸附并感染靶细胞从而起到免疫保护的作用。所以对流感病毒ha蛋白上抗原表位变异进行监测，及时升级疫苗生产的种毒毒株，生产出针对流行株的有效疫苗对禽流感防控是至关重要的。目前已经鉴定出h9亚型ha基因与抗原性相关的多个氨基酸位置，但这些抗原表位对h9抗原性的影响及如何进行疫苗设计的研究还没有。技术实现要素：本发明的目的在于提供一株疫苗株rsn-r92g-e93k，所述疫苗株的hi效价为11.1～12.1log2，血清中和效价为296.50±103.95log2，是一株理想的防制h9n2亚型禽流感疫苗。本发明提供了一株疫苗株rsn-r92g-e93k，所述疫苗株rsn-r92g-e93k由包括以下构建方法构建得到：1)以供体病毒的cdna为模板，用供体病毒引物对进行pcr扩增，得到ha基因片段；所述供体病毒为a/chicken/fujian/sn/2014病毒株；所述供体病毒引物对包括供体病毒上游引物和供体病毒下游引物，所述供体病毒上游引物具有seqidno.1所示的核苷酸序列，所述供体病毒下游引物具有seqidno.2所示的核苷酸序列；2)将所述步骤1)得到的ha片段与t载体进行连接，将得到的连接载体经bsmbⅰ、bsaⅰ酶切，得到连接载体酶切产物；将载体phw2000经bsmbⅰ酶切，得到载体phw2000酶切产物；将所述连接载体酶切产物与载体phw2000酶切产物连接，得到表达载体phw-sn-ha；3)以所述步骤2)得到的表达载体phw-sn-ha为模板，用点突变引物对进行pcr扩增，将得到的扩增产物转化感受态细胞后提取质粒，得到表达质粒snha-r92g-e93k；所述点突变引物包括点突变上游引物和点突变下游引物，所述点突变上游引物具有seqidno.3所示的核苷酸序列，所述点突变下游引物具有seqidno.4所示的核苷酸序列；4)将所述步骤3)得到的表达质粒snha-r92g-e93k与分别含有pb2、pb1、pa、np、na、m和ns基因片段的质粒共转染细胞、重组，得到疫苗株rsn-r92g-e93k。优选的，所述步骤1)用供体病毒引物对进行pcr扩增使用的体系每25μl包括：10×pcrbuffer12.5μl，dntp0.5μl，浓度为25μmol/μl的供体病毒上游引物0.5μl，浓度为25μmol/μl的供体病毒下游引物0.5μl，高保真酶2μl，浓度为880ng/μl的cdna模板2μl，ddh2o8.5μl。优选的，所述步骤1)用供体病毒引物对进行pcr扩增的程序包括：95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃1.5min，共35个循环；72℃延伸10min。优选的，所述步骤3)用点突变引物对进行pcr扩增使用的体系每25μl包括：10×pcrbuffer12.5μl，dntp0.5μl，浓度为25μmol/μl的点突变上游引物0.5μl，浓度为25μmol/μl的点突变下游引物0.5μl，高保真酶2μl，模板0.5μl，ddh2o10μl。优选的，所述模板的浓度在300ng/μl以上。优选的，所述步骤3)用点突变引物对进行pcr扩增的程序包括：94℃5min；94℃30s，54℃40s，72℃1min30s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。优选的，所述步骤4)细胞包括293t细胞和mdck细胞。优选的，所述293t细胞和mdck细胞的数量比为(2.5～3.5):(0.5～1.5)。本发明还提供了上述技术方案所述的疫苗株rsn-r92g-e93k的构建方法，包括以下步骤：1)以供体病毒的cdna为模板，用供体病毒引物对进行pcr扩增，得到ha基因片段；所述供体病毒为a/chicken/fujian/sn/2014病毒株；所述供体病毒引物对包括供体病毒上游引物和供体病毒下游引物，所述供体病毒上游引物具有seqidno.1所示的核苷酸序列，所述供体病毒下游引物具有seqidno.2所示的核苷酸序列；2)将所述步骤1)得到的ha片段与t载体进行连接，将得到的连接载体经bsmbⅰ、bsaⅰ酶切，得到连接载体酶切产物；将载体phw2000经bsmbⅰ酶切，得到载体phw2000酶切产物；将所述连接载体酶切产物与载体phw2000酶切产物连接，得到表达载体phw-sn-ha；3)以所述步骤2)得到的表达载体phw-sn-ha为模板，用点突变引物对进行pcr扩增，将得到的扩增产物转化感受态细胞后提取质粒，得到表达质粒snha-r92g-e93k；所述点突变引物包括点突变上游引物和点突变下游引物，所述点突变上游引物具有seqidno.3所示的核苷酸序列，所述点突变下游引物具有seqidno.4所示的核苷酸序列；4)将所述步骤3)得到的表达质粒snha-r92g-e93k与分别含有pb2、pb1、pa、np、na、m、ns基因片段的质粒共转染细胞、重组，得到疫苗株rsn-r92g-e93k。本发明还提供了上述技术方案所述的疫苗株rsn-r92g-e93k在制备防制h9n2亚型禽流感灭活疫苗中的应用。本发明提供了一株疫苗株rsn-r92g-e93k，以a/chicken/fujian/sn/2014病毒株的cdna为模版，扩增得到ha片段，将ha片段导入载体中得到表达载体phw-sn-ha，再以表达载体为模版，用点突变引物扩增，将扩增产物转化感受态细胞再提取质粒，得到表达质粒snha-r92g-e93k，将表达质粒在于其它基因的7种质粒共转染细胞、重组后，得到疫苗株rsn-r92g-e93k。所述点突变引物将ha基因表达的ha蛋白抗原位点的第92位精氨酸突变为谷氨酸，将第93位谷氨酸突变为赖氨酸，再与其它基因片段进行重组，使制备得到的疫苗株的效价高于野生型，最终得到理想的防制h9n2亚型禽流感疫苗株。本发明实施例的结果显示：本发明提供的疫苗株rsn-r92g-e93k的hi效价为11.6±0.5log2，野生型的效价为9.3±0.6log2；疫苗株的血清中和效价为296.50±103.95log2，野生型的效价为113.00±18.39log2；由此能够得出疫苗株rsn-r92g-e93k是一株比较理想的疫苗株。附图说明图1为ha基因pcr扩增结果。具体实施方式本发明提供了提供了一株疫苗株rsn-r92g-e93k，所述疫苗株rsn-r92g-e93k由包括以下构建方法构建得到：1)以供体病毒的cdna为模板，用供体病毒引物对进行pcr扩增，得到ha基因片段；所述供体病毒为a/chicken/fujian/sn/2014病毒株；所述供体病毒引物对包括供体病毒上游引物和供体病毒下游引物，所述供体病毒上游引物具有seqidno.1所示的核苷酸序列，所述供体病毒下游引物具有seqidno.2所示的核苷酸序列；2)将所述步骤1)得到的ha片段与t载体进行连接，将得到的连接载体经bsmbⅰ、bsaⅰ酶切，得到连接载体酶切产物；将载体phw2000经bsmbⅰ酶切，得到载体phw2000酶切产物；将所述连接载体酶切产物与载体phw2000酶切产物连接，得到表达载体phw-sn-ha；3)以所述步骤2)得到的表达载体phw-sn-ha为模板，用点突变引物对进行pcr扩增，将得到的扩增产物转化感受态细胞后提取质粒，得到表达质粒snha-r92g-e93k；所述点突变引物包括点突变上游引物和点突变下游引物，所述点突变上游引物具有seqidno.3所示的核苷酸序列，所述点突变下游引物具有seqidno.4所示的核苷酸序列；4)将所述步骤3)得到的表达质粒snha-r92g-e93k与分别含有pb2、pb1、pa、np、na、m和ns基因片段的质粒共转染细胞、重组，得到疫苗株rsn-r92g-e93k。本发明以供体病毒的cdna为模板，用供体病毒引物对进行pcr扩增，得到ha基因片段；所述供体病毒为a/chicken/fujian/sn/2014病毒株；所述供体病毒引物对包括供体病毒上游引物和供体病毒下游引物，所述供体病毒上游引物具有seqidno.1所示的核苷酸序列，所述供体病毒下游引物具有seqidno.2所示的核苷酸序列。在本发明中，所述供体病毒为a/chicken/fujian/sn/2014病毒株。本发明优选提取a/chicken/fujian/sn/2014病毒株的rna后再转录成cdna。本发明对所述提取a/chicken/fujian/sn/2014病毒株的rna的方法没有特殊限定，采用常规提取病毒的rna的方法即可。本发明对所述将rna转录成cdna的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。在本发明中，所述供体病毒引物对包括供体病毒上游引物和供体病毒下游引物，所述供体病毒上游引物具有seqidno.1所示的核苷酸序列，具体序列如下：tattcgtctcagggagcaaaagcagggg；所述供体病毒下游引物具有seqidno.2所示的核苷酸序列，具体序列如下：atatcgtctcgtattagtagaaacaagggtgtttt。在本发明中，所述供体病毒引物对是参照hoffmann对流感病毒的8个片段设计得到。在本发明中，所述用供体病毒引物对进行pcr扩增使用的体系每25μl优选包括：10×pcrbuffer12.5μl，dntp0.5μl，浓度为25μmol/μl的供体病毒上游引物0.5μl，浓度为25μmol/μl的供体病毒下游引物0.5μl，高保真酶2μl，浓度为880ng/μl的cdna模板2μl，ddh2o8.5μl。在本发明中，所述用供体病毒引物对进行pcr扩增的程序优选包括：95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃1.5min，共35个循环；72℃延伸10min。本发明将得到的ha片段与t载体进行连接，将得到的连接载体经bsmbⅰ、bsaⅰ酶切，得到连接载体酶切产物；将载体phw2000经bsmbⅰ酶切，得到载体phw2000酶切产物；将所述连接载体酶切产物与载体phw2000酶切产物连接，得到表达载体phw-sn-ha。本发明对所述ha片段与t载体的连接方法没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明对得到的连接载体进行bsmbⅰ、bsaⅰ酶切的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明对所述载体phw2000经bsmbⅰ酶切的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明对得到的连接载体酶切产物与载体phw2000酶切产物连接的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明优选将连接载体酶切产物与载体phw2000酶切产物连接的连接物转化感受态细胞trans1-t1，培养得到菌落后再提取质粒，得到表达载体phw-sn-ha。本发明以表达载体phw-sn-ha为模板，用点突变引物对进行pcr扩增，将得到的扩增产物转化感受态细胞后提取质粒，得到表达质粒snha-r92g-e93k；所述点突变引物包括点突变上游引物和点突变下游引物，所述点突变上游引物具有seqidno.3所示的核苷酸序列，所述点突变下游引物具有seqidno.4所示的核苷酸序列。在本发明中，所述所述点突变上游引物具有seqidno.3所示的核苷酸序列，具体序列如下：atctactgttgggaggaggaaaatggtcctacatcgt；所述所述所述点突变下游引物具有seqidno.4所示的核苷酸序列，具体序列如下：gatggtctctcgacgatgtaggaccattttcctcct。在本发明中，所述点突变引物对的设计思路为：通过查阅文献资料，获得目前已被鉴定出的h9亚型禽流感病毒ha蛋白上的相关抗原点的氨基酸序列。通过使用megalign软件，对两株不同亚系的h9亚型病毒sn株(a/chicken/fujian/sn/2014)及yz4株(a/chicken/jiangsu/yz4/2012)的ha基因序列进行对比分析，筛选出两株病毒在已知抗原位点及附近抗原区域内氨基酸序列存在的差异，发现ha蛋白抗原位点的第92位和93位存在差异，以将yz4株差异抗原位点氨基酸替换至sn株病毒相应位点为原则，利用primerpremier5.0软件，参照定点突变试剂盒说明书设计点突变引物对。在本发明中，所述用点突变引物对进行pcr扩增使用的体系每25μl优选包括：10×pcrbuffer12.5μl，dntp0.5μl，浓度为25μmol/μl的点突变上游引物0.5μl，浓度为25μmol/μl的点突变下游引物0.5μl，高保真酶2μl，模板0.5μl，ddh2o10μl。在本发明中，所述模板的浓度优选在300ng/μl以上。在本发明中，所述用点突变引物对进行pcr扩增的程序优选包括：94℃5min；94℃30s，54℃40s，72℃1min30s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。本发明将表达质粒snha-r92g-e93k与分别含有pb2、pb1、pa、np、na、m和ns基因片段的质粒共转染细胞、重组，得到疫苗株rsn-r92g-e93k。本发明对所述质粒共转染细胞、重组方法没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明对所述含有pb2、pb1、pa、np、na、m或ns基因片段的质粒的制备方法没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述细胞包括293t细胞和mdck细胞，所述293t细胞和mdck细胞的数量比优选为(2.5～3.5):(0.5～1.5)，更优选为3:1。本发明还提供了上述技术方案所述的疫苗株rsn-r92g-e93k的构建方法，所述构建方法与上述技术方案所述的疫苗株rsn-r92g-e93k的构建方法相同，在此不再赘述。本发明还提供了上述技术方案所述的疫苗株rsn-r92g-e93k在制备防制h9n2亚型禽流感灭活疫苗中的应用。下面结合具体实施例对本发明所述的一株疫苗株rsn-r92g-e93k及其构建方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例11.血凝试验筛选候选疫苗毒株选取不同亚系不同年份的h9n2禽流感病毒分离株a/chicken/jiangsu/cz02/2012(h9n2，简称cz0)、a/chicken/fujian/sn/2014(h9n2，简称sn)、a/chicken/shandong/qd5/2012(h9n2，简称qd5)、a/chicken/anhui/fy040/2014(h9n2，简称fy040)、a/chicken/jiangsu/wj100/2015(h9n2，简称wj100)和a/chicken/jiangsu/yz4/2012(h9n2，简称yz4)作为候选株。对候选毒株进行血凝试验，测定各候选h9n2亚型aiv的ha效价，选取其中血凝效价最高的病毒，构建其ha基因表达质粒，结果见表1。表1h9n2亚型aiv毒株血凝效价毒株ha效价(log2)sn9qd57cz207fy0406wj1008yz48结果显示，sn株的ha效价为9log2，大于其他5株候选病毒。根据血凝试验结果选择sn株构建ha基因表达质粒。2.ha片段表达质粒的构建2.1引物设计参照hoffmann的扩增流感病毒ha的通用引物，合成ha片段全长扩增引物(见表2)，带下划线处为相应限制性酶的识别位点。表2ha扩增引物引物引物序列(5‘-3’)扩增片段bma-ha-ftattcgtctcagggagcaaaagcagggghabm-ha-ratatcgtctcgtattagtagaaacaagggtgttttha注：abm是限制性内切酶bsmbⅰ的缩写；bba是限制性内切酶bsaⅰ的缩写；c下划线处是添加的限制性内切酶位点2.2病毒rna的提取及cdna反转录根据trizolreagent试剂说明提取病毒rna，将a/chicken/fujian/sn/2014病毒尿囊液8000rpm离心10min取250μl加入rnase-free的离心管中。加入500μltrizolreagent，充分混匀后，放置5min。加入200μl三氯甲烷，剧烈混匀后，13000rpm离心10min。将上步中离心上清液450μl加入新的离心管中，再加入900μl异丙醇，混匀后放入-20℃作用5min后13000rpm离心10min。弃上清，加入1ml75％depc水处理的乙醇，轻轻混匀，放入-20℃作用5min后13000rpm离心10min，弃上清。根据hiscript1ststrandcdnasynthesiskit反转录试剂盒说明书进行病毒cdna的反转录。反转录好的cdna，于-20℃保存备用。2.3目的片段的扩增及纯化使用phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase，以病毒cdna为模板，扩增ha基因片段。25μlpcr体系如下：表325μlpcr体系10×pcrbuffer12.5μldntp(10mm)0.5μl供体病毒上游引物(25μmol/μl)0.5μl供体病毒下游引物(25μmol/μl)0.5μl高保真酶0.5μldna模板2μlddh2o8.5μl反应程序：预变性温度为95℃3min；然后以95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1.5min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。将pcr产物通过1％琼脂糖凝胶水平电泳进行鉴定，以核酸markergeneruler1kbdnaladder为标准参照，染色后观察结果，成功扩增出了sn株ha基因片段(片段大小约为1700bp)，命名为sn-ha(如图1)，核苷酸序列如seqidno.11所示，具体序列如下所示：atggaaacagtactgttgataactacactattagcagtaacaacaagcaatgcagataaaatctgcatcggctaccaatcaacaaactccacagaaactgtagacacactaacagaaaacaatgtccctgtgacacatgccaaagaactgctccatacagaacacaatgggatgttgtgtgcaacaaacttgggacatcctcttattctagacacctgttccattgaagggctaatctacggcaatccttcttgtgatctactgttgggaggaagagaatggtcctacatcgtcgagagaccatcggctgttaatggattgtgttaccctgggaatgtagaaaatctagaagagctaaggtcactttttagttctgctagttcttatcaaaggatccagattttcccagacacaatctggaatgtgtcttacaatggaacaagcaaagcatgttcagattcattctacagaagcatgagatggttgactcaaaagaacaacgcttatcctattcaagacgcccaatacacaaataatcaagagaagaacattcttttcatgtggggcataaatcacccacccaccgagactgtgcagacaaatctgtacacaagaaccgacacaaccacaagtgttgcaacagaagaaataaataggaccttcaaaccgttgataggaccaagacctcttgtcaatggtttgcagggaagaattgattattattggtcagtattgaaaccaggtcaaacactgcgaataagatcaaatgggaatctaatagctccatggtatggacacattctttctggagagagccacggaagaatcctgaagactgatttaaaaagaggtagctgtacagtgcaatgtcagacagaaaaaggtggtttaaacacaacattgccattccaaaatgtaagtaagtatgcatttggaaactgctcgaaatatgttggaataaagagtctcaaacttgcagtgggtctgaggaatgtgccttctagatctagtagaggattatttggggccatagctggatttatagagggaggttggtcaggactagttgcaggttggtatggattccagcattcaaatgaccaaggggttggtatggcagcagatagagactcaacccaaaaggcaattgacaaaataacatccaaagtgaataacatagtagataaaatgaacaaacagtatgaaattattgatcatgaattcagtgaggttgaaaatagacttaacatgatcaataataagattgatgatcaaattcaagacatatgggcatataacgcagaactactagtgctgcttgaaaatcagaaaacactcgatgaacatgatgcaaatgtaaacaatctatataataaagtgaagagggcattgggttccaatgcagtggaagatgggaaaggatgtttcgagctatatcacaaatgtgatgaccagtgcatggagacaattcggaacgggacctacaacaggaggaagtatcaagaggaatcaaaattagaaagacagaaaatagagggggtcaagctggaatctgaaggaacttacaaaatcctcaccatttattcgactgtcgcctcatctcttgtgattgcaatggggtttgctgcctttttgttctgggccatgtccaatgggtcttgcagatgcaacatttgtatataa。产物条带切下后，按照使用用凝胶纯化回收试剂盒说明进行目的片段的纯化，测定纯化产物的浓度和纯度。2.5目的片段与t载体的连接参照peasy-blunt3cloningkit和trans1-t1感受态细胞使用说明，将其克隆至t载体，连接产物转化trans1-t1感受态细胞，挑斑小提质粒，经ecori酶切鉴定阳性的质粒送金斯瑞生物工程有限公司测序验证，测序正确的质粒-20℃保存备用。2.6ha片段及真核表达载体的酶切与连接将鉴定为阳性克隆的ha质粒测定浓度后，分别用bsmbⅰ、bsai限制性内切酶进行酶切，将phw2000载体用bsmbⅰ酶切。酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，把相应大小条带的胶块切下并胶回收，用t4连接酶将酶切后的phw2000载体和目的产物连接。连接产物转化感受态细胞trans1-t，于37℃培养箱培养12-14h。挑取单个菌落于15ml氨苄lb液体培养基中培养过夜，菌落pcr鉴定，将大小正确的菌液进行测序，测序结果正确后，用qiagen试剂盒提取质粒，得到phw-sn-ha，测定其浓度和纯度，选取浓度在300ng/μl以上，od260/od280在1.8-2.0之间的质粒保存备用。3.抗原位点的查找与筛选通过查阅文献资料，获得目前已被鉴定出的h9亚型禽流感病毒ha蛋白上的相关抗原点的氨基酸序列。通过使用megalign软件，对两株不同亚系的h9亚型病毒sn株及yz4株的ha基因序列进行对比分析，筛选出两株病毒在已知抗原位点及附近抗原区域内氨基酸序列存在的差异，见表4。表4抗原位点氨基酸差异ah9序号4.突变引物的设计通过查找出的不同抗原位点，以将yz4株差异抗原位点氨基酸替换至sn株病毒相应位点为原则，利用primerpremier5.0软件，参照定点突变试剂盒说明书设计点突变引物，见表5。表5点突变扩增引物5.点突变表达质粒的构建及鉴定使用定点突变试剂盒mutexpressmultisfastmutagenesiskitv2以“2.6”中构建好的phw-sn-ha表达质粒为模板，分别用设计的点突变引物进行pcr扩增。扩增体系为：10×pcrbuffer12.5μl，dntp(10mm)0.5μl，上游引物(25μmol/μl)0.5μl，下游引物(25μmol/μl)0.5μl，高保真酶0.5μl，质粒0.5μl(质粒浓度在300ng/μl以上)，ddh2o补足25μl；扩增程序：94℃5min；94℃30s，54℃40s，72℃1min30s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。反应后取5μl产物进行电泳检测，确认目标质粒正确后，将扩增产物消化，去除甲基化模板质粒。dpnⅰ0.5μl上一步扩增产物20μl轻轻混匀后，37℃水浴1h。扩增产物消化后进行重组反应。在冰水浴中加入如下体系：5×ceⅱbuffer4μlexnaseⅱ2μldpnⅰ消化产物50-400ngddh2o补足20μl轻轻混匀后，37℃水浴30min。反应结束后，将产物转化感受态细胞trans1-t1，涂板，待长出菌落后挑菌进行pcr和测序验证鉴定。引物：bma-ha-f(seqidno.1)：tattcgtctcagggagcaaaagcagggg；bm-ha-r(seqidno.2)：atatcgtctcgtattagtagaaacaagggtgtttt。扩增体系为：10×pcrbuffer12.5μl，dntp(10mm)0.5μl，上游引物(25μmol/μl)0.5μl，下游引物(25μmol/μl)0.5μl，高保真酶0.5μl，菌液2μl，ddh2o补足25μl。扩增程序：94℃5min；94℃30s，54℃40s，72℃1min30s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。测序正确后，用qiagen试剂盒提取质粒，测定其浓度和纯度，选取浓度在300ng/μl以上，od260/od280在1.8-2.0之间的质粒保存备用。6.抗原位点替换的重组病毒拯救将构建好的抗原位点突变表达质粒snha-r92g-e93k、snha-n145s、snha-e196d-v198a和snha-l234q分别与pr8的pb2、pb1、pa、np、na、m、ns基因片段的表达质粒共转染293t和mdck混合细胞，拯救替换抗原位点的重组病毒。细胞用含10％胎牛血清的dmem细胞培养基提前复苏并扩大培养，在转染前一天，将293t细胞及mdck细胞以3:1的比例混匀铺于35mm的细胞培养皿，培养至细胞汇合度70％-80％时，可以进行转染，转染之前1h将细胞培养液换成1ml的无抗无血dmem培养基。转染用每片段质粒量应为300ng，转染质粒总用量为2.4μg。取4只无菌1.5ml指形管，分别加入50μl无抗无血dmem，再将质粒按照重组方案分别加入4个离心管中，用微量移液器轻轻吹匀。另取4只无菌指形管，分别加入50μl无抗无血dmem和3μlpolyjettm转染试剂，轻轻混匀。混匀后立即分别加入上述质粒溶液中(需要注意的是顺序不能颠倒)，轻轻吹吸混匀，室温孵育10-15min以形成polyjettm–dna复合物，孵育结束后将混合液逐滴加入培养皿中，边加边轻微晃动以混匀。然后移入co2细胞培养箱中静置培养。转染8-12h后，加入终浓度为2μg/ml的tpck胰酶。转染后72h将培养皿置于-70℃反复冻融三次，收取细胞上清，接种10日龄的spf鸡胚，0.2ml/胚，检测重组病毒拯救是否成功。每12h照胚一次，弃去24h内死亡的鸡胚。培养72h后收取鸡胚的尿囊液，并用血凝试验测定ha效价，收取有ha效价的澄清尿囊液。最终成功拯救出3株抗原位点突变病毒rsn-r92g-e93k、rsn-n145s和rsn-l234q。同时构建野生型重组病毒作为对照，命名为rsn。将收获的尿囊液提取rna进行反转录并pcr，测序鉴定各序列是否正确。将血凝阳性且鉴定正确的病毒尿囊液用四抗pbs稀释10000倍，用10日龄spf鸡胚传至第5代，测定各代次尿囊液的血凝效价，检测重组转染病毒是否能在鸡胚中稳定传代。将第5代病毒尿囊液提取rna并反转录进行序列测定，鉴定是否发生突变，序列完全正确后进行后续试验。7.抗原位点替换病毒与野生病毒抗血清交叉反应性将拯救成功并稳定传代的抗原位点替换病毒与sn株及yz4株抗血清进行交叉血凝抑制试验，分析抗原位点替换后，病毒交叉反应的变化。测定各病毒尿囊液ha效价，将病毒ha价调至2log2(4单位病毒)，在96孔血凝板中加入25μlpbs，每行第1孔加入各个重组病毒的抗血清，并将各血清倍比稀释后，再加入配好的4单位病毒，37℃条件下作用15min，作用后加入1％鸡红细胞，并转移到37℃条件下作用10min后观察结果。试验结果显示，突变病毒rsn-r92g-e93k与母本毒株sn株以及yz4株抗血清的反应性均高于rsn。rsn-n145s株的交叉血凝抑制情况与rsn相似。而改变234位氨基酸的病毒rsn-l234与sn株及yz4株抗血清反应性低于rsn，见表6.表6突变病毒与野生型病毒抗血清间的血凝抑制8.抗原位点替换病毒免疫血清与野生型病毒交叉反应性将与两株病毒抗血清交叉反应均较好的病毒制备抗血清，测定该病毒抗血清中抗体与两株病毒的交叉反应性。8.1病毒灭活及血清制备取病毒rsn-r92g-e93k和rsn尿囊液，以8000r/min离心10min后取上清测定病毒灭活前ha效价，病毒尿囊液与稀释好的1:50甲醛溶液以43:7的比例混合均匀至4℃摇床放置，震摇灭活24h。取出灭活的病毒尿囊液，测定灭活后血凝效价(血凝效价>4log2时满足要求)。在灭活好的病毒尿囊液中以24:1比例加入吐温80，混匀后，以3:1比例将白油加入灭活病毒后乳化制备疫苗。用制成的疫苗颈部皮下注射3周龄spf鸡，0.2ml/只，每组注射5只spf鸡。免疫后，测定血清hi效价≥7log2时可采集鸡血，若未达到则在一免后21d加强免疫一次，二免后测定血清hi效价≥7log2时采集鸡血，分离血清，冻存于-70℃冰箱中备用。8.2交叉血凝抑制试验测定rsn-r92g-e93k和rsn免疫血清与病毒sn及yz4的交叉血凝抑制性。结果显示，病毒rsn-r92g-e93k的免疫血清与对于sn及yz4病毒的血凝抑制价高于rsn免疫血清，见表7。表7突变病毒抗血清与野生型病毒间的交叉血凝抑制8.3血清中和试验选取sn及yz4毒株，测定eid50。进行中和试验时，将病毒稀释成200个eid50，使其与稀释好的血清等量混合后，每个接种剂量中含有100个eid50。选取重组病毒及野生型sn抗血清，先将血清灭活处理(56℃处理30min)，随后将血清用四抗pbs从1:10开始进行2倍连续稀释。将定量好的两种病毒分别与等体积稀释好的各组血清混合均匀，并在37℃作用1h，作用后迅速将混合物接种10日龄spf鸡胚，每个混合物接种4个鸡胚。同时，将稀释为100个eid50的病毒接种spf鸡胚，作为阳性对照。接种后每日观察，4天后检测鸡胚感染情况，根据reed-muench法计算血清中和效价。中和试验结果显示，rsn-r92g-e93k免疫血清对病毒sn和yz4的中和效价均高于病毒rsn免疫血清的中和效价，为后者的2-3倍，因此，rsn-r92g-e93k是一株比较理想的疫苗候选株，见表8。表8候选株血清中和效价由以上实施例可以得出，本发明提供的疫苗株rsn-r92g-e93k的hi效价为11.6±0.5log2，野生型的效价为9.3±0.6log2；疫苗株的血清中和效价为296.50±103.95log2，野生型的效价为113.00±18.39log2；由此能够得出疫苗株rsn-r92g-e93k是一株比较理想的疫苗株。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>扬州大学国药集团扬州威克生物工程有限公司<120>一株疫苗株rsn-r92g-e93k及其构建方法和应用<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tattcgtctcagggagcaaaagcagggg28<210>2<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atatcgtctcgtattagtagaaacaagggtgtttt35<210>3<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3atctactgttgggaggaggaaaatggtcctacatcgt37<210>4<211>36<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gatggtctctcgacgatgtaggaccattttcctcct36<210>5<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5acacaatctggaatgtgtcttacagtggaacaagc35<210>6<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ctgaacatgctttgcttgttccactgtaagacacatt37<210>7<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7taaatcacccacccaccgatactgcacagacaaatct37<210>8<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ttcttgtgtacagatttgtctgtgcagtatcggtgggt38<210>9<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9aagacctcttgtcaatggtcagcagggaagaattgat37<210>10<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ctgaccaataataatcaattcttccctgctgaccattg38<210>11<211>1683<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11atggaaacagtactgttgataactacactattagcagtaacaacaagcaatgcagataaa60atctgcatcggctaccaatcaacaaactccacagaaactgtagacacactaacagaaaac120aatgtccctgtgacacatgccaaagaactgctccatacagaacacaatgggatgttgtgt180gcaacaaacttgggacatcctcttattctagacacctgttccattgaagggctaatctac240ggcaatccttcttgtgatctactgttgggaggaagagaatggtcctacatcgtcgagaga300ccatcggctgttaatggattgtgttaccctgggaatgtagaaaatctagaagagctaagg360tcactttttagttctgctagttcttatcaaaggatccagattttcccagacacaatctgg420aatgtgtcttacaatggaacaagcaaagcatgttcagattcattctacagaagcatgaga480tggttgactcaaaagaacaacgcttatcctattcaagacgcccaatacacaaataatcaa540gagaagaacattcttttcatgtggggcataaatcacccacccaccgagactgtgcagaca600aatctgtacacaagaaccgacacaaccacaagtgttgcaacagaagaaataaataggacc660ttcaaaccgttgataggaccaagacctcttgtcaatggtttgcagggaagaattgattat720tattggtcagtattgaaaccaggtcaaacactgcgaataagatcaaatgggaatctaata780gctccatggtatggacacattctttctggagagagccacggaagaatcctgaagactgat840ttaaaaagaggtagctgtacagtgcaatgtcagacagaaaaaggtggtttaaacacaaca900ttgccattccaaaatgtaagtaagtatgcatttggaaactgctcgaaatatgttggaata960aagagtctcaaacttgcagtgggtctgaggaatgtgccttctagatctagtagaggatta1020tttggggccatagctggatttatagagggaggttggtcaggactagttgcaggttggtat1080ggattccagcattcaaatgaccaaggggttggtatggcagcagatagagactcaacccaa1140aaggcaattgacaaaataacatccaaagtgaataacatagtagataaaatgaacaaacag1200tatgaaattattgatcatgaattcagtgaggttgaaaatagacttaacatgatcaataat1260aagattgatgatcaaattcaagacatatgggcatataacgcagaactactagtgctgctt1320gaaaatcagaaaacactcgatgaacatgatgcaaatgtaaacaatctatataataaagtg1380aagagggcattgggttccaatgcagtggaagatgggaaaggatgtttcgagctatatcac1440aaatgtgatgaccagtgcatggagacaattcggaacgggacctacaacaggaggaagtat1500caagaggaatcaaaattagaaagacagaaaatagagggggtcaagctggaatctgaagga1560acttacaaaatcctcaccatttattcgactgtcgcctcatctcttgtgattgcaatgggg1620tttgctgcctttttgttctgggccatgtccaatgggtcttgcagatgcaacatttgtata1680taa1683当前第1页12