用于鉴别三种孢子丝菌的荧光PCR引物、探针及检测试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于鉴别球形孢子丝菌、申克孢子丝菌和巴西孢子丝菌的多重荧光定量pcr引物和探针，本发明还涉及利用该引物和探针进行球形孢子丝菌、申克孢子丝菌和巴西孢子丝菌检测的方法和试剂盒。

背景技术：

孢子丝菌病(sporotrichosis)是由双相真菌申克孢子丝菌复合体(sporothrixschenckiicomplex)侵犯皮肤及皮下组织引起的慢性感染性疾病。病程长，皮损可固定于局部，或延淋巴管走行，严重者可通过血行系统播散，引起内脏器官的感染，也有报道称吸入的孢子可直接引起肺部感染。早期人们对申克孢子丝菌认识有限，认为其为单一物种。随着基因组学以及分子检测手段的不断发展，发现申克孢子丝菌是由多个亲缘种构成的复合体，其中球形孢子丝菌(sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(sporothrixbransiliensis)是临床感染中最常见的致病菌，其余孢子丝菌多为环境菌株，对人基本不致病。球形孢子丝菌在我国主要分布在东北地区，尤其是吉林省，是孢子丝菌病的高发地区。申克孢子丝菌遍布全球，巴西孢子丝菌主要分布于巴西，国内少见报道。研究表明，孢子丝菌不同亲缘种之间在致病力及药物敏感性方面存在明显差异，因此在孢子丝菌病的诊断及治疗过程中，对病原菌鉴定到种是十分必要的。

由于局部皮损真菌含量少，直接镜检阳性率较低，早期孢子丝菌的诊断主要依赖于组织病理及真菌培养。病理组织切片特殊染色，如过碘酸雪夫染色，六胺银染色可检测到真菌孢子。组织真菌培养是检测的金标准，但耗时较长，至少需要1周时间，因此无法作为临床快速诊断的依据。随着分子生物学技术发展，核酸检测技术逐渐应用到孢子丝菌的分型和检测中，目前常用的孢子丝菌检测及分型的靶基因主要有内转录间隔区(internaltranscribedspacer,its)、钙调蛋白(calmodulin,cal)、延长因子(elongationfactors,ef)等，通过设计针对靶基因的特异性引物，扩增获得长度不同的目的片段，进一步运用琼脂糖凝胶电泳对其进行区分，从而对孢子丝菌进行种间鉴定。2015年，rodrigues【参考文献：rodrigues,a.m.etal.2015,9(12),e0004190.】建立了普通单重pcr检测技术可检测并区分球形孢子丝菌、申克孢子丝菌以及巴西孢子丝菌，是目前最灵敏和特异的致病孢子丝菌核酸检测技术。

目前，临床上常用的孢子丝菌诊断方法包括直接镜检、培养、组织病理检查等。除培养外，都不能对其鉴定到种水平。由于种间形态十分相似，常需要经验丰富的真菌学专家进行鉴定，并且孢子丝菌培养耗时较长，通常需2-4周，不适用于临床早期诊断。目前常用的分子鉴定手段主要包括对目的片段扩增及测序、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(pcr-rflp)以及特异性引物普通pcr检测等。2015年，rodrigues建立了普通单重pcr检测技术，可检测并区分球形孢子丝菌、申克孢子丝菌以及巴西孢子丝菌，是目前最灵敏和特异的致病性孢子丝菌核酸检测技术。该方法使用普通pcr技术，检测的灵敏度和特异性与荧光pcr相比相对较低，对每种致病孢子丝菌均需单独扩增，并进行凝胶电泳对扩增产物进行鉴定和检测，总检测时间至少需要三个小时以上。因此，建立更加灵敏、特异、便捷的区分不同种致病性孢子丝菌的检测技术非常必要。

实时荧光定量pcr方法在目标物检测灵敏度水平具有普通单重pcr不可逾越的优势，然而针对孢子丝菌的主要致病菌球形孢子丝菌(sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(sporothrixbransiliensis)的三重荧光定量pcr至今未见报道。孢子丝菌不同亲缘种之间的基因序列极其相似，钙调蛋白(800bp左右)作为蛋白编码基因，相对保守，能够对不同种的孢子丝菌进行区分，公认为是鉴定孢子“条形码”。即便如此，孢子丝菌钙调蛋白序列种间之间差异仍然较小，只有个别的片段碱基序列不同。另外，荧光定量pcr对于特异性引物和探针的设计具有较高的要求和需满足的原则，其要求目标核苷酸序列长度在100-150bp左右，因此在较小的片段中很难找到即有种间差异又符合荧光pcr要求的目标序列，并且在这段长度较小的序列中，不仅要设计出适合的引物，也要设计出符合要求的特异性探针。将孢子丝菌钙调蛋白序列中具有种间差异性的目标序列输入软件中，无法找到符合荧光pcr要求特异性的引物及探针。只能根据经验，进行人工调整及较对，并通过简并碱基减少不同菌株之间的点突变对引物设计造成的影响，使用mgb探针缩短长度，提高探针的特异性。此外，多重荧光pcr体系中往往具有多对引物及多条探针，其设计要求往往比单重荧光pcr更高、更复杂。只有通过不断地调整，最终才能选择出gc含量适合，自身不会形成发夹结构，相互之间不会形成二聚体的引物及探针。因此，对于多重荧光pcr鉴定不同种的孢子丝菌来说，采用公知的引物设计软件并不能获得满足要求的引物和探针。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供鉴别球形孢子丝菌、申克孢子丝菌以及巴西孢子丝菌的三重荧光定量pcr方法以及用于该方法的特异性引物和探针。

为实现上述目的，发明人通过ncbi数据库已报道的孢子丝菌所有种属基因组进行比对，选取孢子丝菌属特异性钙调蛋白基因序列进一步进行序列分析，使用primerexpressversion软件设计球形孢子丝菌(以下简称sg)、申克孢子丝菌(以下简称ss)、巴西孢子丝菌(以下简称sb)特异性扩增引物和探针，并建立一种三重荧光pcr检测体系，适用于ss，sb和sg的快速核酸检测。

本发明首先提供了用于鉴别孢子丝菌的特异性探针组合，其具有seqidno.3-5所示的序列，所述三种孢子丝菌分别为球形孢子丝菌(sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(sporothrixbransiliensis)。

本发明提供了上述特异性探针组合在制备鉴别球形孢子丝菌(sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(sporothrixbransiliensis)试剂盒或检测试剂中的应用。

本发明还提供了与所述的特异性探针组合搭配使用的特异性引物对，其具有seqidno.1-2所示的序列。

该特异性引物对可用于鉴别上述三种孢子丝菌。

进一步，本发明提供了上述特异性引物在制备鉴别球形孢子丝菌(sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(sporothrixbransiliensis)试剂盒或检测试剂中的应用。

本发明提供了一种用于鉴别孢子丝菌的荧光定量pcr特异性引物和探针组合，所述荧光定量pcr特异性引物的核苷酸序列如seqidno.1-2所示；所述探针的核苷酸序列如seqidno.3-5所示，且三条探针标记的荧光基团不相同；所述孢子丝菌分别为球形孢子丝菌(sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(sporothrixbransiliensis)。

在本发明的一个实施例中，探针seqidno.3-5的5’分别标记荧光基团fam、vic、cy5，3’标记淬灭基团bhq1。

本发明提供了上述荧光定量pcr特异性引物和探针组合在制备鉴别球形孢子丝菌(sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(sporothrixschenckii)和巴西孢子丝菌(sporothrixbransiliensis)试剂盒或检测试剂中的应用。

进一步，本发明提供了一种鉴别上述三种孢子丝菌的试剂盒，该试剂盒含有seqidno.1-2所示的荧光定量pcr特异性引物和seqidno.3-5所示的探针组合，三条探针的5’标记荧光基团，3’标记淬灭基团，并且三条探针的荧光基团各不相同。

即，检测球形孢子丝菌sg的探针核苷酸序列如seqidno.3所示。检测球形孢子丝菌ss的探针核苷酸序列如seqidno.4所示。检测球形孢子丝菌sb的探针核苷酸序列如seqidno.5所示。

具体地，本发明的试剂盒工作时，以待测样品总dna为模板，利用上述的荧光定量pcr特异性引物和探针组合进行实时荧光定量pcr，根据扩增曲线和荧光信号判定结果。

优选地，实时荧光定量pcr的25μl反应体系为：

优选地，所述实时荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，57-59℃退火15s，45个循环。

本发明每次检测标本时必须设立ntc对照(无模板对照)、neg(阴性对照)和pos对照(阳性对照)，三种对照对于结果判读起决定性作用：

有效扩增：ntc(-)、neg(-)、pos(+)；

无效扩增：ntc(-)、neg(-)、pos(-)提示试剂失效；

无效扩增：ntc(-)、neg(+)、pos(+)提示加样污染；

无效扩增：ntc(+)、neg(+)、pos(+)提示体系污染。

只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。

在检测中三种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

ct值小于等于38的标本为阳性结果；

ct值大于40的标本为阴性结果；

ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。

由于三条探针标记不同的荧光基团，可根据扩增结果的荧光信号判断待测样品为球形孢子丝菌、申克孢子丝菌和巴西孢子丝菌中的哪一种。

本发明提供的鉴别上述三种孢子丝菌的荧光定量pcr方法遵循上述试剂盒的试剂配置和方法以及判断标准。

本发明通过ncbi数据库已报道的具有代表性的孢子丝菌复合体的钙调蛋白基因序列比对，发现了sg，ss，sb钙调蛋白基因中一段两端保守，中间具有差异碱基的序列，其核苷酸序列分别如seqidno.6-8所示，可用于针对该序列设计引物和/或探针用于对球形孢子丝菌、申克孢子丝菌和巴西孢子丝菌进行检测。本发明实施例针对该序列设计了多个组合的引物和探针，通过实验室条件优化和筛选，最终选定其中一个引物探针组合的灵敏度最高，鉴别效果最好。该体系在多重荧光情况下，可以对单一或者混合的靶序列进行特异性的扩增，相比以往的分子检测手段，更加灵敏，操作简单，用时短，模板用量少，并且能够检测混合感染。本发明是目前已知的首次应用多重荧光pcr方法对孢子丝菌病原体进行检测。对常见28种其他真菌、3种细菌、人类基因组以及小鼠基因组均无非特异扩增，显示出良好的特异性。应用本发明的多重荧光pcr技术同时检测球形孢子丝菌、申克孢子丝菌和巴西孢子丝菌这三种致病性孢子丝菌，简化致病性孢子丝菌核酸检测技术操作流程，提高检测灵敏度，缩短检测时间，为临床常见孢子丝菌病的快速诊断提供方法，针对不同种的病原菌进行精准治疗。

传统的三重荧光pcr检测技术一般需要针对3种待检病原分别设计3对(6条)相对应的检测引物和3条探针，并在同一体系中混合使用，过多的引物和探针会不同程度的相互干扰，影响检测效率。本发明巧妙地设计了一对引物，可有效的扩增孢子丝菌属，通过三条不同的taqmanmgb荧光探针有效检测ss，sb和sg(5’分别标记荧光基团fam(sg)、vic(ss)、cy5(sb)，3’标记淬灭基团bhq1)。相对传统三重荧光pcr检测体系，本发明节省了4条扩增引物，可有效降低体系中引物探针交叉干扰，提升扩增效率，节约检测成本。本发明的试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，标本检测能力良好。

附图说明

图1为本发明球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌钙调蛋白基因组序列中用于设计特异性引物和探针的核算区域示意图。

图2为本发明引物探针优选实验中八套引物及探针阴性对照(ntc)扩增曲线示意图。

图3为本发明引物探针优选实验中八套引物及探针检测球形孢子丝菌扩增曲线示意图。

图4为本发明引物探针优选实验中八套引物及探针检测申克孢子丝菌扩增曲线示意图。

图5为本发明引物探针优选实验中第一、三、五、七套引物及探针检测巴西孢子丝菌扩增曲线示意图。

图6为本发明引物探针优选实验中第二、四、六、八套引物及探针检测巴西孢子丝菌扩增曲线示意图。

图7为本发明引物探针优选实验中第六套及第八套引物及探针检测巴西孢子丝菌扩增曲线示意图。

图8为本发明引物探针优选实验中第六套引物及探针检测球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌扩增曲线示意图。

图9为本发明的三重荧光pcr扩增体系退火温度扩增曲线。

图10为本发明的三重荧光pcr体系对球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌的检测限图。

图11为本发明的三重荧光pcr体系对球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌扩增的标准曲线图。图中1：10⁶copies，2：10⁵copies，3：10⁴copies，4：10³copies，5：10²copies，6：10copies，7：1copies，8：空白对照。

图12为本发明的三重荧光pcr方法与目前一致的普通pcr方法检测限的对比图。图中，1：10⁶copies，2：10⁵copies，3：10⁴copies，4：10³copies，5：10²copies，6：10copies，7：1copies，方框标识检测低限。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1孢子丝菌复合体的钙调蛋白基因序列比对与靶序列确定

将ncbi数据库中具有代表性的孢子丝菌复合体的钙调蛋白基因序列使用vectorntisuite6软件序列比对，找出sg，ss，sb两端保守(仅该三种致病孢子丝菌保守，相对其他孢子丝菌核算序列变异)，中间具有碱基差异的序列(图1)，其核苷酸序列分别如seqidno.6-8所示，将此三段序列作为三种致病孢子丝菌多重荧光pcr检测靶序列使用。

实施例2针对靶序列的引物和探针的设计

针对实施例1确定的靶序列(seqidno.6-8)，发明人设计了很多套引物与探针组合。

表1引物序列

表2探针序列

上游引物(f1/f2)、下游引物(r1/r2)，两两组合，共四对引物；ss/sb/sg-p1，ss/sb/sg-p2，共两套引物。引物及探针相互组合，共八套。针对以下八套引物及探针进行优选：

第一套：f1-r1-p1(ss+sb+sg:三种探针等比混合)

第二套：f2-r1-p1(ss+sb+sg:三种探针等比混合)

第三套：f1-r2-p1(ss+sb+sg:三种探针等比混合)

第四套：f2-r2-p1(ss+sb+sg:三种探针等比混合)

第五套：f1-r1-p2(ss+sb+sg:三种探针等比混合)

第六套：f2-r1-p2(ss+sb+sg:三种探针等比混合)

第七套：f1-r2-p2(ss+sb+sg:三种探针等比混合)

第八套：f2-r2-p2(ss+sb+sg:三种探针等比混合)

反应体系及反应条件，遵循荧光pcr一般反应要求，对检测结果进行分析：

1.ntc:

阴性对照的三种荧光都是阴性，说明体系没有污染，且不会发生非特异性扩增，是合格的扩增体系。见图2。

2.fam荧光检测sg：

56℃退火温度下，均是特异性扩增，vic与cy5阴性，fam的ct值波动范围非常小(22.26-23.00，相差不到1个ct)，且荧光曲线良好，说明八套引物及探针效果接近。见图3。

3.vic荧光检测ss：

同理，ss扩增的8套引物及探针效果接近。ct值波动范围：28.11-28.41。见图4。

4.cy5荧光检测sb：

其中第一、三、五、七套探针发生了非特异性扩增，vic荧光非特异性起峰，见下图。说明探针p1对应这四套检测效果不好，应弃用。见图5。

探针p2对应的四套未发生非特异性扩增，见图6。但是可以看出20的循环后vic的基线下信号，以及40个循环后fam荧光背景信号有上扬趋势，说明还是有非特异性扩增的可能性。

但其中第六套及第八套背景信号更低，见图7。尤其是第六套，不但背景信号更低，且cy5检测荧光信号更强。

根据上述结果分析，第六套(f2-r1-p2)效果最好，荧光信号值稳定，扩增效果良好，见图8。最终选用这一套引物及探针进行后续的反应体系及反应条件的优化。本发明确定以下引物和探针组合为最佳用于荧光定量pcr检测sg，ss，sb的组合。

spo-f:5'-cattgacttccctggtaygtttgac-3'

spo-r:5'-cargaactctgtggayggttagc-3'

spo-mgb-sgp:(fam)5'-agcacgggtagacat-3'(bhq1)

spo-mgb-ssp:(vic)5'-ctgcactatgacacggt-3'(bhq1)

spo-mgb-sbp:(cy5)5'-acacacggttatcc-3'(bhq1)

实施例3sg，ss，sb三重荧光pcr检测实验参数的优化与方法建立

(1)体系退火温度优化：体系退火温度从55℃-60℃改变，结果显示退火温度为57℃-59℃体系扩增效果最好(见图9)。

(2)体系镁离子浓度优化：将体系中mgcl2从0.5μl依次递增为6μl，每次增幅0.5μl，每个浓度梯度做3个平行样。结果mgcl2添加量为2μl(mgcl2终浓度为4mm)时体系扩增效果最好。

(3)荧光定量pcr扩增体系及扩增条件的优化

扩增条件：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，57-59℃退火15s，45个循环。

每次检测标本时必须设立ntc对照(无模板对照)、neg(阴性对照)和pos对照(阳性对照)，三种对照对于结果判读起决定性作用：有效扩增：ntc(-)、neg(-)、pos(+)；

无效扩增：ntc(-)、neg(-)、pos(-)提示试剂失效；

无效扩增：ntc(-)、neg(+)、pos(+)提示加样污染；

无效扩增：ntc(+)、neg(+)、pos(+)提示体系污染。

只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。

在检测中三种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

ct值小于等于38的标本为阳性结果；

ct值大于40的标本为阴性性结果；

ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。

实施例4sg，ss，sb多重荧光pcr检测体系的灵敏度、特异度及检出限评价

1.灵敏度评价

用本发明实施例3优化了的sg，ss，sb多重荧光pcr方法检测5株球形孢子丝菌(经测序验证的临床分离株)、3株申克孢子丝菌(标准株cbs498.86^t，2株测序验证的临床分离株)、1株巴西孢子丝菌(标准株cbs120339^t)和10份临床怀疑为孢子丝菌病的皮损处组织(其中培养阳性6例，污染2例，培养阴性2例；病理确诊8例，排除诊断2例)。结果，除ntc对照及2例排除诊断的临床样本外，所有17份阳性模板的检测结果呈阳性，灵敏度达100％。

2.特异度评价

用本发明实施例3优化了的sg，ss，sb多重荧光pcr方法检测常见28种其他真菌、3种细菌、人类基因组以及小鼠基因组均无非特异扩增(表3)，以sg，ss，sb为阳性对照。结果除阳性对照外，其余33种非sg，ss，sb模板均为阴性。

表3用于检测sg，ss，sb多重荧光pcr体系特异性的病原模板

bmu：北京大学第一医院真菌保藏库

atcc：美国模式培养物集存库

3.检测限的评价

检测下限即以实施例3已优化的检测方法从一系列倍比稀释的阳性质粒模板中检测，结果为阳性的能力。以梯度浓度(0.2copies/μl～2.0×10⁵copies/μl)的sg(临床分离株)，ss(标准株cbs498.86^t)，sb(标准株cbs120339^t)阳性质粒为模板，每个浓度梯度取5μl检测。按照优化的反应体系和反应条件进行荧光pcr，每个浓度梯度做3个平行样。结果显示，本发明建立的sg，ss，sb三重荧光pcr体系检测限分别为10、10和100copies(见图10)。

实施例5sg，ss，sb多重荧光pcr体系标准曲线的建立

以标准浓度模板的sg，ss和sb阳性质粒(2.0×10⁵copies/μl)依次进行10倍稀释共计7个浓度梯度，上样标准品各5μl扩增，模板量为10～10⁶copies，绘制sg，ss，sb多重荧光pcr体系的标准曲线，见图11。

实施例6本发明sg，ss，sb多重荧光pcr方法与文献报道的特异性引物扩增方法的比较

本发明建立的sg，ss，sb多重荧光pcr方法与文献报道的使用特异性引物通过普通pcr技术扩增不同长度目的片段的方法相比，以标准浓度模板的sg，ss和sb阳性质粒(2.0×10⁵copies/μl)10倍稀释7个浓度梯度作为模板，每个浓度梯度取5μl检测，每个浓度梯度重复3次，比较两种方法最低检测限。

sg，ss，sb多重荧光pcr体系检测限分别为10copies、10copies、100copies，根据文献报道(参考文献：rodrigues,a.m.etal.2015,9(12),e0004190.)的特异性引物普通pcr方法对相同的模板进行扩增，所得检测限分别为100copies、100copies、100copies(图12)。在sg与ss检测体系中，本发明的检测限要比目前报道的检测方法更灵敏；在sb检测体系中，虽然本发明中方法与目前报道方法检测水平持平，但是在实验操作、耗时等方面均明显优于目前报道的方法(表4)。

表4sg，ss，sb多重荧光pcr方法与目前报道特异性引物普通pcr方法对比

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>吉林大学

<120>用于鉴别三种孢子丝菌的荧光pcr引物、探针及检测试剂盒

<130>khp181116609.3

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ttatctggagtcgacaatggctaaccatccacagagttcctg162

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