一种双钛功能化磁性纳米材料分离富集磷酸化肽的方法与流程

本发明属于磷酸化肽分离富集方法，具体尤其涉及一种双钛功能化磁性纳米材料特异性分离富集磷酸化肽的方法。

背景技术：

蛋白质的可逆磷酸化在各种生物过程中均扮演着十分重要的作用，对于细胞信号传导过程而言尤为重要。研究表明蛋白质不同程度的磷酸化（单磷酸化或多磷酸化）在生物过程中起到不同的作用：单磷酸化经常作为肿瘤抑制因子的激活剂，而多磷酸化则通常负责钾通道的分级调节或是细胞周期转化的调节等。因此，更加全面地鉴定与分析磷酸化蛋白质组学对理解蛋白质磷酸化在生物过程中扮演的角色尤为重要。在过去几十年中，随着质谱的快速发展，基于质谱策略的磷酸化蛋白质/肽段分析手段已越来越受到人们的广泛关注。然而，这种分析方法面临的一大挑战就是实际样品中存在着大量非磷酸化蛋白质/肽段严重抑制了质谱信号。因此，在质谱分析前使用高效分离富集策略以对更多不同程度的蛋白质磷酸化进行分析值得人们为之探索。

在所有磷酸化肽段的分离富集方法中，金属氧化物亲和色谱法和固定金属离子亲和色谱法是两种比较常用的富集方法，其主要是依靠肽段上的磷酸基团与金属离子/金属氧化物之间形成不同的配位作用而实现与样品体系分离富集的。这两种方法富集得到的磷酸化肽段具有各自的偏好，比如固定金属离子亲和色谱法偏好富集更加碱性亲水的多磷酸化肽，而金属氧化物亲和色谱法则对单磷酸化肽段比较偏好。目前，虽然已开发了分步多次洗脱或者色谱联用等方法以加强对磷酸化肽段的分离分析，但这些方法通常具有操作繁琐，通量低等缺点，开发一种集聚金属氧化物亲和色谱法及固定金属离子亲和色谱法两者优点的多功能化纳米材料对大规模磷酸化蛋白质组学分析尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种双钛功能化磁性纳米材料特异性分离富集磷酸化肽的方法，首次合成了具有强磁响应性的双钛功能化磁性纳米材料并将其用于磷酸化肽段的分离纯化中。在外加磁场的作用下，捕获了磷酸化肽段的双钛功能化磁性纳米材料可以快速地从复杂样品溶液中分离开来，使整个富集、洗脱过程所需时间大大缩短。同时，兼备了固定金属离子亲和色谱法及金属氧化物亲和色谱法优点的本材料对不同程度磷酸化的肽段均有很好的富集效果。

本发明提供的一种双钛功能化磁性纳米材料特异性分离富集磷酸化肽的方法，具体步骤如下，将双钛功能化磁性纳米材料借助超声作用分散于磷酸化肽上样液中，37℃下孵育10-60分钟，用磷酸化肽上样液充分洗涤，以体积比0.5-20%氨水作为洗脱液，37℃下洗脱10-60分钟，取洗脱液点靶，进行质谱分析。

本发明中，所述双钛功能化磁性纳米材料的合成方法，具体步骤如下：

（1）将三氯化铁溶解于乙二醇中，充分溶解后，加入无水醋酸钠，经充分搅拌超声后转移至水热反应釜中，在100-350℃下加热8-16小时，冷却至室温后，分别用去离子水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于50-100℃下真空干燥；

（2）将步骤（1）所得产物均匀分散于溶剂中，加入二氧化钛前驱体，将所得混合溶液在20-80℃搅拌反应12-48小时，分别用去离子水和无水乙醇充分洗涤；

（3）将腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐溶解于碱性溶剂中，在0-20℃下搅拌5-30分钟，加入γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，10-80℃下搅拌反应6-18小时；

（4）将步骤（3）所得溶液用酸调节ph值至3-7之间，加入步骤（2）所得产物，在50-95℃之间搅拌1-6小时，用去离子水和无水乙醇充分洗涤；

（5）将步骤（4）所得产物均匀分散于含有钛盐的溶剂中，20-80℃下反应6-24小时，所得产物用去离子水充分洗涤后于40-75℃下真空干燥，即得目标产物。

本发明中，步骤（2）中的溶剂为甲醇、乙醇或乙醇/去离子水混合溶液中的一种或几种。

本发明中，步骤（2）中二氧化钛前驱体为钛酸四异丙酯、钛酸正丁酯、硫酸钛或四氯化钛中的一种或几种。

本发明中，步骤（2）中在加入二氧化钛前驱体前还加入氢氧化钠、碳酸钠或氨水中的一种或几种。

本发明中，步骤（2）中步骤（1）所得产物与二氧化钛前驱体的质量比为30:1-15:1。

本发明中，步骤（3）中碱性溶剂为氢氧化钠水溶液、碳酸钠水溶液或氨水中的一种或几种。

本发明中，步骤（3）中γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷与腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐的质量比为1:5-1:1。

本发明中，步骤（4）中酸为浓盐酸、硫酸或硝酸中的一种或几种。

本发明中，步骤（5）中钛盐为硫酸钛、四氯化钛或硝酸钛中的一种或几种。

本发明所述的特异性分离富集磷酸化肽的方法具有如下优点：

1.双钛功能化磁性纳米材料具有良好的磁响应性，与磷酸化肽具有强烈相互作用，可以更灵敏、更高效地分离富集磷酸化肽。

2.双钛功能化磁性纳米材料上的二氧化钛与钛离子结合有益于不同程度磷酸化的肽肽段的捕获，使该材料在复杂的生物样品中显示出对磷酸化肽良好的富集能力。

3.双钛功能化磁性纳米材料应用于蛋白质翻译后修饰研究中，通过结合金属氧化物亲和色谱法和固定金属离子亲和色谱法两者的优点，可以对磷酸化肽这种翻译后修饰肽段实现深度覆盖，结合nano-lcms/ms可以大规模鉴定磷酸化蛋白质并确定磷酸化位点。

附图说明

图1为实施例1的双钛功能化磁性纳米材料的扫描电子显微镜照片；

图2为实施例1的双钛功能化磁性纳米材料的透射电子显微镜照片；

图3为实施例1的双钛功能化磁性纳米材料的x光电子能谱；

图4为实施例2中的双钛功能化磁性纳米材料对单磷酸化标肽和双磷酸化标肽的富集质谱图。图a为未经双钛功能化磁性纳米材料富集的磷酸化标肽的质谱图，图b为经磁性二氧化钛纳米材料富集后的磷酸化标肽的质谱图，图c为双钛功能化磁性纳米材料富集后的磷酸化标肽的质谱图；

图5为实施例3的双钛功能化磁性纳米材料对标准磷酸化蛋白β-casein酶解产物中磷酸化肽分离富集的质谱图。图a为未经富集的β-casein磷酸化肽的质谱图，图b为磁性二氧化钛纳米材料富集β-casein酶解液中磷酸化肽的质谱图，图c为双钛功能化磁性纳米材料富集β-casein酶解液中磷酸化肽的质谱图；

图6为实施例4的双钛功能化磁性纳米材料对β-casein酶解产物中磷酸化肽富集的选择性质谱图。图a为β-casein和非磷酸化蛋白bsa的混合酶解产物未经富集的质谱图，图b为两者质量比为1：100时使用双钛功能化磁性纳米材料富集β-casein酶解产物中磷酸化肽的质谱图，图c为两者质量比为1：400时使用双钛功能化磁性纳米材料富集β-casein酶解产物中磷酸化肽的质谱图，图d为两者质量比为1：800时使用双钛功能化磁性纳米材料富集β-casein酶解产物中磷酸化肽的质谱图；

图7为实施例5的双钛功能化磁性纳米材料富集唾液中磷酸化肽的质谱图。图a为未经富集直接分析唾液中磷酸化肽段的质谱图，图b为磁性二氧化钛纳米材料富集唾液中磷酸化肽的质谱图，图c为双钛功能化磁性纳米材料富集唾液中磷酸化肽的质谱图；

图8为实施例6的双钛功能化磁性纳米材料富集牛奶中单/多磷酸化肽的质谱图。图a为未经富集直接分析牛奶中磷酸化肽段的质谱图，图b为磁性二氧化钛纳米材料富集牛奶中磷酸化肽的质谱图，图c为双钛功能化磁性纳米材料富集牛奶中磷酸化肽的质谱图。

具体实施方式

本发明利用双钛功能化磁性纳米材料与磷酸化肽的相互作用实现对复杂样品中磷酸化肽的分离富集，以下介绍具体实施方式。

实施例1：亲水性磁性介孔二氧化钛材料的合成

（1）将1.35gfecl3·6h2o在75ml乙二醇中经磁力搅拌至溶液澄清后，加入3.6gnaac，再经充分搅拌超声后转移至水热反应釜中，200℃下加热16小时，待反应釜冷却后，用去离子水和乙醇分别洗涤产物三次，50℃下真空干燥；

（2）将（1）中所得产物80mg超声分散于含0.72ml氨水的200ml乙醇中，逐滴滴加1.6ml钛酸正丁酯，将所得混合溶液在45℃下反应24h，用去离子水和无水乙醇充分洗涤；

（3）将2.5g腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐溶解于2m碳酸钠溶液中，在0℃下搅拌10min，加入0.8mlγ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，65℃下搅拌反应12小时；

（4）将步骤（3）所得溶液使用浓盐酸调节ph值至6，加入步骤（2）所得产物，在95℃下搅拌2小时，用去离子水充分洗涤；

（5）将步骤（4）所得产物均匀分散于硫酸钛溶液中，25℃下反应2小时，所得产物用去离子水充分洗涤后于40℃下真空干燥，即得所述双钛功能化磁性纳米材料。

将制得的双钛功能化磁性纳米材料用扫描电子显微镜检测，检测条件是：15kv工作电压下，将干燥的材料取少量黏贴在绝缘胶带上，经喷金、抽真空后，8微米比例尺下扫描电子显微镜观察，检测结果如图1所示。

将制得的双钛功能化磁性纳米材料用透射电子显微镜检测，检测条件是：200kv工作电压下，取少量干燥的材料均匀分散于无水乙醇中并用混合液将微栅网浸润，干燥后插入仪器抽真空，在100纳米比例尺下观察投射电子显微镜图，检测结果如图2所示。

图3为双钛功能化磁性纳米材料的x光电子能谱。

实施例2：将实施例1得到的双钛功能化磁性纳米材料作为固相吸附剂用于单磷酸化标肽和双磷酸化标肽的富集

（1）试样的制备：将1mg单磷酸化标肽或双磷酸化标肽溶解于1ml50mmnh4hco3溶液中；

（2）100μg双钛功能化磁性纳米材料超声分散在100μl含有0.1μl步骤（1）中标肽溶液的上样液中，37℃孵育20min。用100μl上样液冲洗样品三次。用10μl0.4m氨水洗脱30min；

（3）质谱分析：取1μl步骤（2）中洗脱液与1μl基质溶液点靶，自然干燥后进行质谱分析，质谱图如图4所示。

分析结果：由图4可以看出，单磷酸化标肽和双磷酸化标肽经本材料富集后信号峰强度均有很大改善。

实施例3：将实施例1得到的双钛功能化磁性纳米材料作为固相吸附剂用于磷酸化蛋白β-casein中磷酸化肽的分离富集

（1）试样的制备：1mgβ-casein在50mmnh4hco3溶液中37℃酶解16h；

（2）100μg双钛功能化磁性纳米材料超声分散在100μl含有100fmol/μl步骤（1）β-casein酶解产物的上样液中，37℃孵育20min。用100μl上样液冲洗样品三次。用10μl0.4m氨水洗脱30min；

（3）质谱分析：取1μl步骤（2）中洗脱液与1μl基质溶液点靶，自然干燥后进行质谱分析，质谱图如图5所示。

分析结果：由图5可以看出，来自于磷酸化蛋白β-casein酶解产物的磷酸化肽被本材料所捕获，而在原液中非磷酸化肽造成的干扰被大幅去除。

实施例4：将实施例1得到的双钛功能化磁性纳米材料作为固相吸附剂用于模拟复杂环境中磷酸化肽的分离富集

（1）将β-casein和非磷酸化蛋白bsa的混合酶解产物按质量比1:100，1:400和1:800分别配制成复杂程度上升的模拟复杂样品体系；

（2）100μg双钛功能化磁性纳米材料超声分散在100μl含有步骤（1）配制溶液的上样液中，37℃孵育30min。用200μl上样液冲洗样品三次。用8μl0.8m氨水洗脱30min；

（3）质谱分析：取1μl步骤（1）中洗脱液与1μl基质溶液点靶，自然干燥后进行质谱分析，质谱图如图6所示。

分析结果：由图6可以看出，来自于非磷酸化蛋白bsa的杂质峰在经过本材料富集后均被除去，而磷酸化蛋白β-casein酶解产物中的磷酸化肽被本材料所捕获，信号峰强度得到大幅增强。

实施例5：将实施例1得到的双钛功能化磁性纳米材料作为固相吸附剂用于唾液中磷酸化肽的分离富集

（1）100μg双钛功能化磁性纳米材料超声分散在100μl含有5μl唾液的上样液中，37℃孵育30min。用100μl上样液冲洗样品三次。用8μl0.4m氨水洗脱30min；

（2）质谱分析：取1μl步骤（1）中洗脱液与1μl基质溶液点靶，自然干燥后进行质谱分析，质谱图如图7所示。

分析结果：由图7可以看出，本材料在唾液的复杂环境中依然能展现出对单/多磷酸化肽段良好的富集效果。

实施例6：将实施例1得到的双钛功能化磁性纳米材料作为固相吸附剂用于牛奶中磷酸化肽的分离富集

（1）100μg双钛功能化磁性纳米材料超声分散在100μl含有5μl牛奶的上样液中，37℃孵育30min。用100μl上样液冲洗样品三次。用8μl0.4m氨水洗脱30min；

（2）质谱分析：取1μl步骤（1）中洗脱液与1μl基质溶液点靶，自然干燥后进行质谱分析，质谱图如图8所示。

分析结果：由图8可以看出，本材料在牛奶的复杂环境中依然能展现出对单/多磷酸化肽段良好的富集效果。

实施例7：双钛功能化磁性纳米材料的合成

（1）将1.35gfecl3·6h2o在75ml乙二醇中经磁力搅拌至溶液澄清后，加入3.6gnaac，再经充分搅拌超声后转移至水热反应釜中，180℃下加热12小时，待反应釜冷却后，用去离子水和乙醇分别洗涤产物三次，40℃下真空干燥；

（2）将（1）中所得产物50mg超声分散于500ml乙醇中，逐滴滴加1.5ml钛酸四异丙酯，将所得混合溶液在45℃下反应20h，用去离子水和无水乙醇充分洗涤；

（3）将2g腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐溶解于氢氧化钠溶液中，在0℃下搅拌30min，加入1mlγ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，65℃下搅拌反应16小时；

（4）将步骤（3）所得溶液使用浓盐酸调节ph值至5，加入步骤（2）所得产物，在90℃搅拌3小时，用去离子水充分洗涤；

（5）将步骤（4）所得产物均匀分散于硫酸钛溶液中，45℃下反应2小时，所得产物用去离子水充分洗涤后于50℃下真空干燥，即得所述双钛功能化磁性纳米材料。

实施例8：双钛功能化磁性纳米材料的合成

（1）将1.5gfecl3·6h2o在80ml乙二醇中经磁力搅拌至溶液澄清后，加入3.6gnaac，再经充分搅拌超声后转移至水热反应釜中，200℃下加热16小时，待反应釜冷却后，用去离子水和乙醇分别洗涤产物三次，40℃下真空干燥；

（2）将（1）中所得产物50mg超声分散于含0.05mmol氢氧化钠的200ml甲醇中，加入0.5mg硫酸钛，将所得溶液在30℃下反应20h，用去离子水和无水乙醇充分洗涤；

（3）将5g腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐溶解于0.1m氨水中，在0℃下搅拌30min，加入0.7mlγ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，65℃下搅拌反应16小时；

（4）将步骤（3）所得溶液使用5m硫酸调节ph值至5，加入步骤（2）所得产物，在90℃搅拌3小时，用去离子水充分洗涤；

（5）将步骤（4）所得产物均匀分散于四氯化钛溶液中，45℃下反应2小时，所得产物用去离子水充分洗涤后于50℃下真空干燥，即得所述双钛功能化磁性纳米材料。

实施例9：双钛功能化磁性纳米材料的合成

（1）将1gfecl3·6h2o在60ml乙二醇中经磁力搅拌至溶液澄清后，加入3.2gnaac，再经充分搅拌超声后转移至水热反应釜中，200℃下加热12小时，待反应釜冷却后，用去离子水和乙醇分别洗涤产物三次，40℃下真空干燥；

（2）将（1）中所得产物10mg超声分散于含0.5g碳酸钠的乙醇/水混合液（体积比为95：5）中，逐滴滴加0.5ml四氯化钛溶液中，将所得混合溶液在25℃下反应30h，用去离子水和无水乙醇充分洗涤；

（3）将2g腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐溶解于氢氧化钠溶液中，在0℃下搅拌30min，加入1mlγ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，65℃下搅拌反应16小时；

（4）将步骤（3）所得溶液使用5m硝酸调节ph值至5，加入步骤（2）所得产物，在90℃搅拌3小时，用去离子水充分洗涤；

（5）将步骤（4）所得产物均匀分散于硝酸钛溶液中，20℃下反应2小时，所得产物用去离子水充分洗涤后于50℃下真空干燥，即得所述双钛功能化磁性纳米材料。