一种飞蝗金属硫蛋白I型基因LmMtI在蝗虫防治中的应用的制作方法

本发明涉及一种飞蝗金属硫蛋白i型基因lmmti在蝗虫防治中的应用，属于生物技术领域。

背景技术：

飞蝗是世界各地广泛分布的重要农业害虫，由于其具有迁飞性、群居性、杂食性等特点，一旦成群后其食量巨大，可以进行远距离飞行，可能对对农作物造成严重的危害。目前主要依靠化学药物防治飞蝗，长期施用化学杀虫剂导致环境污染，农产品中农药残留，胁迫害虫产生抗药性，对非靶标生物和天敌昆虫造成危害等一系列问题。因此，急需开发新型、无公害、特异性好的防治技术来替代化学防治。

金属离子在生物体内发挥着极其重要的生理作用，如参与酶的构成和合成，维持必要的生理渗透压，调节多种生理过程。昆虫也不例外，体内一定浓度的金属离子，可以保证昆虫生命活动的正常进行，而金属硫蛋白基因及其编码的金属硫蛋白正是昆虫体内金属离子吸收、转运、调节的必需蛋白质。大量的研究显示金属硫蛋白基因及其蛋白在维持昆虫体内必需金属离子平稳和稳态、有害重金属解毒、清除自由基方面起着极其重要的功能。

随着生物技术的发展和进步，rna干扰成为研究基因功能的便捷工具，其原理和技术在目的基因干扰方面被广泛应用，在疾病治疗和害虫防治方面也具有极大的应用潜力。rna干扰(rnai)是一种由双链rna分子引起的特异性转录后基因沉默的现象，应用rna干扰技术进行害虫防治的优点：1)基于某一特定的昆虫基因而设计，其针对性强特异性好，对非靶标生物无害；2)离开生理环境后双链rna在自然界极易降解，无污染无残留。因此利用rna干扰进行害虫防治是一种新的技术和途径。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种飞蝗金属硫蛋白i型基因在蝗虫防治中的应用，具体地说，是一种飞蝗金属硫蛋白i型基因及其dsrna在飞蝗因生理异常致死中的应用。

本发明原理：飞蝗金属硫蛋白ⅰ型基因在飞蝗体内金属代谢方面具有重要的生理功能，该基因的异常表达会引起飞蝗生理异常，最终导致飞蝗因体内金属离子的生理性代谢紊乱，出现多种症状而死亡。该双链特异性好，干扰效率高，因此选择飞蝗特异性的金属硫蛋白ⅰ型基因做为靶标基因进行rna干扰来防治害虫，具有很大的应用潜力和可操作性。

本发明提供的一种飞蝗金属硫蛋白i型基因lmmti在蝗虫防治中的应用，所述的飞蝗金属硫蛋白i型基因，其核苷酸序列是seqidno：1。通过飞蝗转录组测序获得飞蝗金属硫蛋白i型基因片段，通过race-pcr进一步克隆获得该基因的cdna全长序列。该序列长489bp，其中开放阅读框327bp，编码109个氨基酸。

进一步地，所述的飞蝗金属硫蛋白i型基因片段，其开放阅读框的核苷酸序列为seqidno：2。

根据seqidno：2的序列特征，应用primerpremier5.0软件分别设计含有t7启动子的上、下游引物seqidno：3和seqidno：4，通过pcr扩增获得seqidno：2，其含有t7启动子，然后按照t7ribomax^tmexpressrnaisystem试剂盒说明书在体外转录合成与seqidno：2对应的dsrna。

本发明提供了一种飞蝗金属硫蛋白i型基因在蝗虫防治中的应用，即是：以seqidno：2为模板合成的dsrna在飞蝗死亡中的应用：用微量注射器向飞蝗腹腔注射5-8微克（μg）上述dsrna，24小时后飞蝗陆续出现拒食、腹部肿胀、行动迟缓，消化异常直至死亡。

本发明的有益效果：

将一种基于金属硫蛋白ⅰ型基因片段合成的dsrna，从飞蝗腹部第二腹节注射到腹腔内，可检测到24小时后与对照相比较，该dsrna对飞蝗金属硫蛋白ⅰ型基因（lmmti）沉默效率为75.2%，飞蝗对金属的耐受性大大降低，用同等剂量的药物作用后死亡率上升1.8-2.3倍；表现出良好的特异性和高效性，本发明为利用rna干扰技术进行害虫防治提供新的靶标和途径。

附图说明

图1为注射dsrna后飞蝗金属硫蛋白i型基因相对表达量显著下降；

图2为注射dsrna干扰金属硫蛋白基因后低浓度的铜使飞蝗死亡率升高。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明，但不局限于以下实施例。

实施例1：

飞蝗金属硫蛋白i型基因（lmmti）序列的获得及其应用；

经转录组测序并利用生物信息学的方法搜索到飞蝗金属硫蛋白i型基因，以飞蝗dna为模板，克隆该基因并通过测序验证，确认该基因（lmmti）的序列seqidno：1；

选择seqidno：1序列中的开放阅读框seqidno：2的基因片段；

根据seqidno：2的序列特征，应用primerpremier5.0软件设计含有t7启动子的上、下游引物seqidno：3和seqidno：4，然后按照t7ribomax^tmexpressrnaisystem试剂盒说明书体外转录合成dsrna；

用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dsrna的单一性，然后将其定量为终浓度：1.5μg/μl；

选择健康的飞蝗4龄若虫120头，均分为两组，即对照组和实验组，经腹节向腹腔内注射seqidno：2对应的dsrna6μl，对照组折射等量的dsgfp。注射完毕后将昆虫置于25度气候箱内，用新鲜芦苇饲喂并观察；

检测dsrna对lmmti的沉默效率：分别在注射dsrna后饲养12、24、48h后取20头虫子，用real-timepcr检测目的基因lmmti相对与对照组的表达量，结果表明注射dsrna后48h该基因的沉默效率达75.2％(如图1)。

上述注射dsrna饲养36h后发现飞蝗出现拒食、行动迟缓，解剖消化道可见中肠松弛、失去机械强度现象；再向腹部注射低浓度铜溶液（0.4μg/μl），12h后与对照组相比较，飞蝗死亡率大幅上升了79.6%，致死效果显著。

实施例2：

飞蝗金属硫蛋白i型基因（lmmti）序列的应用；

合成dsrna的方法如实施例1所述；

检测并确定dsrna的单一性后，将其定量为终浓度为1.5μg/μl；

选择健康的飞蝗5龄若虫100头，均分为对照组和实验组，用微量注射器向实验组昆虫腹腔内注射特异dsrna5μl，对照组蝗虫注射等量的dsgfp。后将昆虫置于27度气候箱内，用新鲜稻叶饲喂并观察；

注射dsrna后24、48h取20头虫子检测dsrna对lmmti的沉默效率，结果表明注射dsrna后48h时lmmti基因的沉默效率达74.7％；

经上述方法注射dsrna36h时陆续发现飞蝗出现呕吐、消化道可见中肠失去机械强度和弹性；再向腹部注射低浓度铜溶液（0.5μg/μl），12h后与对照组相比较，飞蝗死亡率大幅上升，24h后有显著致死效果。

实施例3：

飞蝗金属硫蛋白i型基因（lmmti）序列的应用；

合成dsrna的方法如实施例1所述；

将dsrna其定量为终浓度为2.0μg/μl；

选择健康的飞蝗成虫90头，分为对照组和实验组，用微量注射器向实验组昆虫体内注射dsrna4μl，对照组蝗虫注射等量的dsgfp，后置于29度气候箱内，用新鲜稻叶饲喂；

24、48h后随即取20头虫子检测lmmti的沉默效率为77.3％；

注射dsrna后36-48h时陆续发现飞蝗出现一系列异常生理行为，向腹部注射低浓度铜溶液（0.3μg/μl）12h后，与对照组相比较，飞蝗死亡率显著上升。

序列表

<110>山西大学

<120>一种飞蝗金属硫蛋白i型基因lmmti在蝗虫防治中的应用

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