一种表达禽流感H9N2病毒HA蛋白的新城疫病毒载体疫苗株的制作方法

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种表达禽流感h9n2病毒ha蛋白的新城疫病毒载体疫苗株。

技术背景

世界动物卫生组织(oie)规定的a类传染病中，高致病性禽流感(hpai)和新城疫(nd)是其中的2种禽类烈性传染病。高致病性禽流感由h5或h7亚型禽流感病毒(aiv)引起，可导致感染禽群100％的死亡，每年给养殖业造成巨大的经济损失，尤其是近年流行的h7n9aiv，再次引起大家对禽流感的恐慌。h9亚型aiv属于低致病性禽流感病毒，感染鸡群的直接致死率不高，但传播迅速，可造成禽群的免疫抑制并继发其它疾病。新城疫是由新城疫病毒(ndv)引起的急性传染病，目前已在世界范围内发生了4次大流行，每次流行造成的损失难以估计。流行病学调查显示，当前流行的新城疫病毒主要是基因ⅶ型。

疫苗接种是预防禽流感和新城疫最有效的措施，但弱毒苗和灭活苗的免疫接种在临床上会干扰对这2种疾病的检测和流行病学调查，2种疫苗同时免疫还会增加家禽的免疫压力，且生产成本较高。虽然基因工程疫苗能够解决上述的问题，但与生产要求相比，还有一定的差距。因此获得免疫原性更好、诱导抗体效价更高、与流行毒株更匹配的重组毒株是目前生产急需解决的问题。但现有技术构建的表达禽流感h9n2病毒ha蛋白的重组毒表达效率较低，诱导的抗体水平不高，免疫原性不理想。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种表达禽流感h9n2病毒ha蛋白的新城疫病毒载体疫苗株，通过反向遗传技术获得表达禽流感病毒aivh9n2蛋白的重组ndv毒株作为疫苗的侯选株。

本发明首先提供一种表达禽流感h9n2病毒ha蛋白的新城疫病毒株,所述的病毒株的制备方法如下：

1)构建新城疫病毒ndv全基因组转录质粒，所述的转录质粒，其中将核苷酸序列为seqidno:2的h9n2的ha蛋白编码基因插入到新城疫病毒株ndv基因组的p基因与m基因之间；

所述的将ha蛋白编码基因插入到新城疫病毒株ndv基因组的p基因与m基因之间，其一种方法是在新城疫病毒株ndv基因组的第3171nt之后引入pmei酶切位点，再将核苷酸序列为seqidno:2的h9n2ha蛋白编构建码基因插入到酶切位点处；

2)构建用于表达新城疫病毒np蛋白、p蛋白和l蛋白的辅助重组质粒；

3)将构建的新城疫病毒ndv全基因组转录质粒和3个辅助重组质粒共转染表达t7rna聚合酶的细胞系df1-t7，培养获得表达禽流感h9n2病毒ha蛋白的新城疫病毒株。

本发明再一个方面提供一种表达禽流感h9n2病毒ha蛋白的新城疫病毒株，是用上述方法构建的；

所获得的表达禽流感h9n2病毒ha蛋白的新城疫病毒株用于制备疫苗。

本发明另一个方面提供一种重组疫苗，其中使用的抗原为上述的表达禽流感h9n2病毒ha蛋白的新城疫病毒株。

本发明通过对h9n2病毒ha蛋白的编码基因进行序列优化，解决了表达禽流感h9n2病毒ha蛋白的重组毒表达效率较低，诱导的抗体水平不高，免疫原性不理想的问题。制备的弱毒株免疫动物后均可以对当前流行的基因vii新城疫病毒提供良好的保护作用，同时可以提供对h9n2禽流感病毒侵害的防控。

附图说明

图1：ndv基因组中pmei酶切位点的引入图；

图2：ha基因的pcr鉴定电泳图；

图3：ndv毒株生长曲线的测定图。

具体实施方式

本发明通过在构建的ndv全基因组质粒基础上，分别在ndv的np基因和p基因之间、p基因和m基因之间以及hn基因和l基因之间插入egfp基因，拯救获得重组病毒。通过荧光观察和生长曲线测定等，确定egfp基因在插入ndv的p基因和m基因之间时表达效率最高，且不影响毒株的增殖活性，因此选择p基因和m基因之间作为外源基因的插入位点。在p基因和m基因之间插入h9n的ha基因。为了解决现有技术中构建的重组毒株免疫原性弱的问题，对h9n2ha基因进行密码子优化，拯救获得重组ha基因的ndv弱毒株，研究获得的弱毒株的生物学特性，并做成活疫苗进行动物免疫，通过抗体效价测定发现，经过密码子优化的重组病毒免疫动物后与未进行密码子优化的重组病毒相比，诱导的抗体水平明显提高，且与已经报道过的研究结果相比有明显优势；从而促成了本发明。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1全长cdna克隆载体的构建

根据全基因组载体构建方法，在ndv全基因组序列3171nt之后引入pmei酶切位点(图1)，构建的ndv全基因组载体命名为pbrt-ndv-t。根据ncbi公布的h9n2ha基因的序列(seqidno:1)，

将序列为seqidno:1的ha基因进行鸡体偏嗜性密码子优化并合成序列，优化后的ha基因的序列为seqidno:2。

合成的ha基因包括密码子优化和密码子未优化的序列。在扩增ha基因的上下游引物中分别添加pmei酶切位点和ndv自身聚合酶l识别的转录终止序列ge(ttaagaaaaaa)及转录起始序列gs(acgggtagaa)，引物h9-f/h9-r扩增h9n2的ha基因，引物h7-f/h7-r扩增h7n9的ha基因。构建了全长cdna克隆载体，其中将构建的含h9n2ha基因的载体分别命名为pbrt-ndv-1a(密码子进行优化)和pbrt-ndv-1b(密码子未优化)。引物和基因合成由上海生工生物工程有限公司完成，引物序列见表1。其中，cl2-2f/cl2-t7/cl2-t8/cl2-2r为引入pmei酶切位点所用的引物。

表1：ndv全基因组载体构建用引物序列

实施例2重组病毒的拯救

df1-t7细胞接种于35mm六孔板内生长至70％-80％单层时，将转录质粒pbrt-ndv-1a、pbrt-ndv-1b与3个辅助质粒pci-np、pci-p和pci-l共转染df1-t7细胞系，采用磷酸钙转染试剂盒，操作按试剂盒说明书进行。转染3-5天后，收获培养物上清接种9-11日龄的spf鸡胚尿囊腔，培养3-5天，取鸡胚尿囊液测ha效价。收获ha试验结果阳性尿囊液，分装后-70℃冻存。将拯救的含h9n2ha基因的重组ndv分别命名为rndv-h9a(密码子优化)和rndv-h9b(密码子未优化)。

将第一代转染液接胚后4天收获尿囊液，血凝(ha)试验阴性；收取的尿囊液1:10稀释，继续接胚盲传，0.1ml/枚，4天后收获鸡胚尿囊液，血凝(ha)试验阳性，重组病毒的鸡胚效价均稳定在2⁵-2⁷。收获的尿囊液1:10000稀释，继续接胚，传代至15代。分别取病毒的原代、第5代、第10代和第15代病毒尿囊液提取rna，反转录；根据ndv的全基因组序列设计引物，引物序列：ndv-ha-f：gtcacttcagcatcacacggaatcccct，ndv-ha-r：atgctgctggattggttgcagttgtgcg，pcr扩增插入的ha基因序列并测序，鉴定结果与预期的结果一致(图2)。表明病毒拯救成功，且传代稳定，插入的序列没有再次发生突变。

实施例3重组病毒在鸡胚内的生长特性

将不含ha基因的新城疫病毒rsl株与含ha基因的重组新城疫病毒尿囊液按10⁵eid50接种spf鸡胚尿囊腔。分别在接种后24h、48h、72h和96h收获尿囊液，每一检测时间点随机收取spf鸡胚6枚，并检测病毒的每毫升尿囊液病毒量eid50。绘制生长曲线，结果见图3所示，病毒的生长特性一致。表明ha基因插入后，没有影响ndv的生长速度，仍然保持高滴度的生长特性。

实施例4鸡胚平均致死时间(mdt)的测定

用无菌生理盐水将新收获的含毒尿囊液作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，分别接种10日龄鸡胚，每个稀释度接种5个鸡胚，每胚尿囊腔内注射0.1ml，每天在接种的相同时间照蛋1次，记录每一鸡胚的死亡时间，并测定ha效价。连续观察7日，接种鸡胚全部死亡的最高稀释度即为最小致死量，具体结果见表2。

表2鸡胚平均致死时间(mdt)的测定

结果显示，重组ha基因的ndv与rsl株的mdt值基本一致，没有显著差异。

实施例5脑内致病指数(icpi)的测定(icpi)

取1日龄spf雏鸡10只，各脑内注射10^-1稀释的新鲜含毒尿囊液0.05ml。另取5只以同样方法注射稀释病毒用的生理盐水各0.05ml。

接种后，每日在相应接种时间观察，记录雏鸡的情况，分正常、发病和死亡。观察8日，计算正常、发病、死亡鸡的总数，根据不同的权值(正常为0，发病为1，死亡为2)累计总分数。icpi为累计总分除以正常、发病和死亡鸡的累计总数的平均值。

结果显示ndv的icpi基本一致，均小于0.5，具体结果见表3。

表3脑内致病指数(icpi)的测定

实施例6静脉致病指数(ivpi)的测定

取6周龄spf鸡10只，各静脉接种10^-1稀释的含毒尿囊液0.1ml，另取5只接种生理盐水作对照。每日在接种的相应时间观察，记录接种鸡情况，分正常、发病、麻痹和死亡。

观察10日后，累计正常、发病、麻痹和死亡动物数，根据不同权值(正常为0，发病为1，麻痹为2，死亡为3)累计总分数。ivpi为累计总分除以正常、发病和死亡动物的累计总数。

结果显示，各株ndv的ivpi值均为0，具体结果见表4。

表4静脉致病指数(ivpi)的测定

综合各毒株mdt、icpi和ivpi的测定结果，表明重组ha基因的ndv均表现为弱毒株的特征，其生长特性与rsl株相比也没有发生显著变化。作为疫苗候选株，rndv-h9a、rndv-h9b均符合低毒力毒株的特征，可保证疫苗的安全性。

实施例7重组病毒的安全性试验

5日龄spf雏鸡78只随机分为13组，12组实验组，1组对照组，每组6只。其中实验组，每只鸡分别接种0.1ml的ndv尿囊液，对照组接种0.1μl的pbs。隔离饲养，接种后每天观察雏鸡的状态及发病、死亡状况，连续观察4周。具体分组及免疫剂量见表5。

表5：安全性实验分组

结果显示，在4周的观察期内，雏鸡状态良好，采食和饮水正常，，无不良反应，没有发病和死亡现象，实验组的鸡与对照组的鸡相比，没有可观察到的生长发育差异。表明重组ndv用于雏鸡是安全的。

实施例8重组病毒在spf鸡上的毒力返强试验

5日龄spf雏鸡30只随机分为5组，每组6只。其中4组实验组，1组对照组。其中实验组的雏鸡，每只分别免疫10⁵eid50的相应毒株，对照组免疫0.1μl的pbs，隔离器里面隔离饲养。每隔3天，每个隔离器再放入6只10日龄的spf健康雏鸡，最终每个隔离器共放入5批雏鸡，每批都做好脚标。最后一批放入后，再观察2周。实验期内，每天观察鸡的状态，记录发病和死亡现象。具体分组见表6。

表6：毒力返强实验分组

结果显示，在实验观察期内，所有批次的实验组雏鸡与对照组均无差异，没有出现采食下降、发病和死亡现象，状态正常。表明重组ndv在雏鸡体内不会出现毒力返强的现象，再次验证了重组毒的安全性。

实施例9重组病毒活疫苗的免疫效果评价

10日龄的spf雏鸡50只随机分为5组，每组10只，4组实验组，1组对照组，隔离饲养。实验组每只分别免疫10⁵eid50的相应毒株，对照组免疫0.1μl的pbs(表7)。

免疫后第5天，每只鸡均采集喉拭子和肛拭子。冻融3次后，每个样品接种5枚10日龄的spf鸡胚，放37℃温箱孵育。每天照胚，弃去24h内死亡的鸡胚。96h后，所有鸡胚放于4℃冰箱一段时间后，采集尿囊液测病毒效价(ha试验)。没有效价的鸡胚尿囊液继续接种10日龄spf鸡胚一次，温箱孵育后收取尿囊液，按相同的方法测定病毒效价。记录数据。

雏鸡免疫后21天采血，分离血清，用红细胞凝集抑制试验(hi试验)测定抗体效价。其中第1组、第2组分别测定ndv和h9n2的抗体效价，对照组分别测定ndv、h9n2的抗体效价。其中配制ndv的四单位抗原所用的毒株为rsl株，配制h9n2的四单位抗原所用毒株购自中国兽医药品监察所，所有抗原均为灭活过的毒株。

表7免疫实验分组

结果显示，免疫后第5天采集的棉拭子接胚，收集尿囊液，用红细胞凝集试验测定病毒效价，均为0；再次接胚后，尿囊液依然没有检测到病毒效价。表明重组ndv免疫雏鸡后，没有排毒风险，安全性较好。

免疫后21天采集血清，测定hi效价，免疫组均能检测出针对ndv的高水平的抗体效价，对照组无效价。而针对ha蛋白的抗体效价，各组毒株表现了较大的差异：rndv-h9a的平均抗体效价为2⁸，显著高于曹有才、丁平云等的研究(见表9)，而rndv-h9b的平均抗体效价为2⁴，与曹有才等的研究相似(免疫后3周平均hi抗体滴度可以达到4log2)(曹有才.表达h9亚型禽流感病毒ha基因重组新城疫病毒的研究[d].呼和浩特:内蒙古农业大学,2009)。

结果表明，ha基因的密码子进行优化为seqidno:2后，毒株rndv-h9a和rndv-h7a免疫动物后可分别诱导针对ndv/aivh9n2和ndv/aivh7n9高水平的抗体效价，符合二联疫苗对抗原免疫原性的要求，应用前景广阔，真正达到1种疫苗防控2种疾病的目的。

表8：抗体水平检测结果(hi效价测定)

表9弱毒活疫苗免疫后抗体hi效价测定(log2)

摘自:丁平云,等.h9亚型禽流感与新城疫重组二联疫苗株的构建与拯救[j].中国家禽,2013,35(16):16-20.)。

序列表

<110>山东信得科技股份有限公司青岛信得药业有限公司

<120>一种表达禽流感h9n2病毒ha蛋白的新城疫病毒载体疫苗株

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1683

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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