一种鲤春病毒血症病毒的定量方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种病毒的定量方法。

背景技术：

鲤春病毒血症(springviraemiaofcarp，简称svc)是鲤科鱼类的一种高度传染性的流行病，该病的病原是鲤春病毒血症病毒(springviremiaofcarpvirus,svcv)。svcv造成鱼的死亡率高达90％以上，对淡水鱼的健康养殖造成极大的威胁，农业部颁布的《一、二、三类动物疫病病种名录(水生动物疫病部分)》(中华人民共和国农业部公告，第1125号)中将其列为一类动物疫病。而且，世界动物卫生组织也将其列入水生动物疫病名录(oie，2009，chapter2.3.8)。就其传染性而言，可以称为“水生动物中的禽流感”(我国将此病与禽流感和口蹄疫并列一类动物疫病)。

svc的流行地域广，从流行于欧洲、中东和俄罗斯，近几年逐步蔓延到美洲(goodwin&liopo,2002；dikkeboometal.,2004)和亚洲。1998年英国环境、渔业和水产养殖科学研究中心(thecentreforenvironment,fisheriesandaquaculturescience,简称cefas)从来自中国北京的金鱼和锦鲤中分离出病毒，并鉴定为svcv(goodwinae,liopog.springviremiaofcarpvirus(svcv):globalstatusofoutbreaks,diagnosis,surveillance,andresearch.theisraelijournalofaquaculture＝bamidgeh,2009,61(3):180-187；dikkeboomal,radic,tooheykurthk,etal.firstreportofspringviremiaofcarpvirus(svcv)inwildcommoncarpinnorthamerica.[j].journalofaquaticanimalhealth,2004,16(4):169-178；liuh,gaol,shix,etal.isolationofspringviraemiaofcarpvirus(svcv)fromculturedkoi(cyprinuscarpiokoi)andcommoncarp(c.carpiocarpio)inp.r.china.bulletin-europeanassociationoffishpathologists,2004,24(4):194-202；stonedm,ahnew,denhamkl,etal.nucleotidesequenceanalysisoftheglycoproteingeneofputativespringviraemiaofcarpvirusandpikefryrhabdovirusisolatesrevealsfourgenogroups.disaquatorgan,2003,53:203-210.]

svcv的宿主范围广，能感染鲤科四大家鱼，非鲤科鱼如欧鲶也能被感染，鲤鱼是其中主要的和最易感的宿主，svc在春季疾病暴发时，1龄鱼死亡率可达70％。鲤科鱼类是我国水产业的主要养殖种类，如果爆发svc，经济损失的后果将不堪设想。[付峰,刘荭,黄倢,蔡生力.鲤春病毒血症病毒(svcv)的研究进展,中国水产科学,2006,13(2):328-334]

svc虽然不是人畜共患病，但是，却严重威胁水产养殖业的健康发展，鉴于我国渔业经济发展的使命和国际贸易的责任，全面深入研究该病毒(svcv)感染机理及防治方法的工作迫在眉睫。对于病毒的相关研究，病毒的定量是一个基础性但极为重要的工作。常用的病毒定量的方法包括：(1)对病毒粒子负染后采用电子显微镜(electronmicroscopy,em)观察计数；(2)空斑形成试验定量法，即以营养琼脂覆盖病毒感染的单层细胞，通过计数平板上空斑形成数量计算出样品中活病毒的数量；(3)实时荧光定量pcr(real-timefluorescentquantitativepcr,qpcr)检测病毒拷贝数；(4)微滴数字pcr(dropletdigitalpcr，ddpcr)检测病毒拷贝数。

以上4种方法的比较分析：

(一)电子显微镜技术

电子显微镜技术对于人类认识病毒和病毒性传染病起了巨大的作用，尽管有时会被认为费力、过时或者不必要，但由于其检测周期短(负染)并且可以辨别未知病原体归属，因此适用于新发病原体监测的第一线，这是因为形态学是病毒分类的重要依据，电子显微镜赋予病毒超微结构特征以及形态发生的可视性，这些信息对未知病原体的临床诊断非常宝贵。但是使用电子显微镜进行病毒定量，则有一些明显的不足，比如：

(1)必须使用亲水性好的支持膜，使样品结构和染色效果得以均衡一致，从而确保定量分析的准确性，普通铜网难以达到制样要求，新制备的碳-福尔瓦(formvar或collodion,butvar以及pioloform等替代物)铜网支持膜可以保证所吸附颗粒的均匀分布,但是随存放时间延长则效果显著下降；

(2)在负染制样环节,病毒颗粒与支持膜或者染料之间亲和的程度将会影响所吸附病毒颗粒的数量、病毒结构整体的表象以及渗透压的改变而影响定量；

(3)设备要求高；

(4)制样操作较复杂，对实验者操作水平要求高。

(二)空斑实验

空斑实验即空斑形成试验定量法是将适当稀释的病毒液定量接种于敏感的单层细胞，经一段时间培育后，在细胞上覆盖一层未凝固琼脂，待其固定后继续培养，由于病毒的增殖使感染的单层细胞病变脱落，形成肉眼可见的空斑，若在理想状态，一个空斑是由一个感染性病毒颗粒增殖而形成，计数空斑数即可计算出样品中活病毒的数量。通常以每毫升病毒液的空斑形成单位(plaqueformingunite,pfu)即pfu/ml表示。空斑实验是常用的确定病毒滴度和分离病毒的经典方法，但该方法也存在明显的不足，比如：

(1)空斑形成试验定量法的基础是一个感染性颗粒能够形成一个空斑，但是存在多个感染性颗粒同时形成一个空斑的可能，从而影响定量的准确性。有研究者将10种基因标记的脊髓灰质炎病毒(polioviruses)混合后进行空斑实验，在形成的123个空斑中，有6个空斑包含不止一个病毒，研究还发现低ph会导致病毒颗粒的聚集，从而增加了共感染发生的概率；

(2)空斑形成试验定量法耗时较长，从细胞的准备、病毒接种，到空斑的出现，整个过程需要3天或更长时间。

(三)实时荧光定量pcr(qpcr)检测

qpcr以其特异性高、灵敏度高、可定量、有效解决pcr污染问题及自动化程度高等优点,在医学领域、微生物和动植物疾病检疫方面得到了广泛应用。qpcr法可通过测定病毒基因组拷贝数较精确地反映病毒数量。qpcr是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(pcr)循环后产物总量的方法。qpcr是在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr进程进行实时检测。由于在pcr扩增的指数时期，模板的ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。检测方法有：(1)sybrgreenⅰ法：在pcr反应体系中，加入过量sybr荧光染料，sybr荧光染料特异性地掺入dna双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的sybr染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步；(2)taqman探针法：taqman荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭剂则在3'末端，pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个目的基因序列特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，pcr扩增时，特异性的探针在扩增退火环节与pcr产物结合，taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。

相对与sybrgreenⅰ法qpcr，taqman探针法qpcr检测基因能够具有特异性更强、灵敏度更高，加之重复性好以及线性范围广等优点，在生物医学、农业等多个领域得到广泛应用。我国学者yue等建立了基于taqman探针法的qpcr定量检测svcv的方法。[yuez,etal.developmentofasensitiveandquantitativeassayforspringviremiaofcarpvirsbasedonreal-timert-pcr.jvirolmethods.2008,152(1-2):43-38.]

(四)微滴数字pcr(dropletdigitalpcr，ddpcr)

ddpcr是近年发展起来的新一代的pcr技术，其原理是在反应前将反应体系进行微滴化处理形成几万至几十万个油包水的液化微滴，核酸分子分布于每个微滴中，经过pcr扩增后，经过微滴检测器检测，根据泊松分布原理和阳性微滴数即可计算出核酸初始拷贝数。

与实时荧光定量pcr相比，同样是基于taqman探针法的qpcr，不过由于将反应体系进行微滴化处理，理论上该方法灵敏度会更高。但是ddpcr也存在一些不足，例如仪器设备昂贵，每一份的检测成本较qpcr高；微滴读取速度慢导致检测时间是qpcr的2～3倍；荧光通道少(目前只有fam和vic两通道)；样品需稀释到一定浓度方可检测；目前尚无成熟的ddpcr商品化试剂盒可供使用。

吴斌等探索建立了数字rt-pcr检测鲤春病毒血症的方法，通过与目前主流常规taqman探针法的qpcr相比，发现两种方法检测svcv的灵敏度基本一致，检测低限均为10^-4稀释。[吴斌等.数字rt-pcr检测鲤春病毒血症的方法建立与应用.中国动物检疫,2015,32(7):72-76.]

综上所述，taqman探针法qpcr具有特异性好、灵敏度高、重现性好等优点，在定量检测包括svcv在内的病毒中是一种相对较好的方法，但是由于其成本较高，对实验技术和设备要求都较高。

技术实现要素：

本发明的目的是根据现有技术的不足，建立一种将荧光定量rt-pcr方法与病毒蛋白定量测定方法之间的关联，通过直接测定病毒蛋白含量而对鲤春病毒血症病毒(springviremiaofcarpvirus,svcv)实现定量，方法准确，用来检测经过纯化的svcv，操作简便、成本低廉，为svcv的相关研究带来极大方便。

根据本发明的一方面，通过鲤鱼上皮瘤细胞(epitheliomapapulosumcyprini,epc)扩培svcv，反复冻融细胞收集svcv，然后采用超速离心与密度梯度离心相结合的方法，获得高纯度的svcv病毒粒子。

本发明的另一方面是通过分子生物学技术，扩增svcv基因，将svcv核蛋白n基因序列基因克隆至质粒pmd^tm18-t，构建重组质粒pmd^tm18-t-svcv-n。然后，设计合成用于基于taqman探针法qpcr的引物和相应的荧光探针，以梯度稀释的质粒pmd^tm18-t-svcv-n为模板，建立了基于taqman探针法qpcr的svcv拷贝数绝对定量方法，qpcr的ct值(y)与对数化的模板浓度(x,log(copies/μl))之间的线性回归(linearregression)方程为y＝-3.3407x+40.489，相关系数r²高达0.9967。

本发明的又一方面是以bradford法测定梯度稀释的牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,bsa)作标准曲线，测定svcv蛋白浓度，然后将所测梯度稀释的svcv蛋白浓度(y)与吸光度(opticaldensity,od)值(x)之间的线性回归方程为y＝434.98x-163.01，相关系数r²高达0.9952。同时，采用基于taqman探针法qpcr测定相应梯度稀释svcv拷贝数，然后建立svcv蛋白浓度与svcv拷贝数之间的关联，二者线性回归方程为y＝3.0×10^-6x+9.4967，相关系数r²高达0.9965。

具体地，本发明方法包括下述步骤：

一种鲤春病毒血症病毒的定量方法，所述方法包括：

1)从待测鲤春病毒血症病毒中扩增核蛋白n基因，构建重组质粒，以该质粒作为模板基于taqman探针法qpcr作标准曲线建立绝对定量svcv病毒拷贝数的方法；

2)用bradford法测定待测svcv病毒的蛋白浓度，建立与基于qpcr法所测svcv拷贝数的关联；

3)通过步骤2)所述的关联建立再次检测所述svcv病毒时，直接测蛋白浓度以确定所述病毒拷贝数的定量方法。

1、根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于所述步骤1)包括：

1a)接种待测病毒至宿主细胞，扩大培养，提取并纯化含svcv的样本制备待测样本溶液；

1b)从所述步骤1a)获得的待测样本溶液中反转录提取待测病毒的cdna，制备含编码svcv核蛋白n基因的重组质粒；

1c)以步骤1b)的重组质粒作为标准品模板，分别使用染料法和taqman探针法进行实时荧光定量pcr反应,计算重组质粒的dna拷贝数；

1d)以质粒的拷贝数的对数为横坐标、ct值为纵坐标制作标准曲线。

本发明所述的定量方法，其中所述步骤2)包括：

2a)以梯度稀释的牛血清白蛋白为标准品制作蛋白标准曲线；

2b)将待测的病毒液进行梯度稀释，用bradford法595nm条件下的od值，通过步骤2a)的蛋白标准曲线求出每个稀释梯度的病毒液的蛋白浓度；

2c)以稀释好的病毒液作为模板，使用将病毒反转录为cdna，再以反转后的cdna为模板，进行实时荧光定量pcr反应；

2d)根据步骤1d)所作的标准曲线，推算出病毒液的拷贝数；

2f)将步骤2b)测得的蛋白浓度与2d)测得的病毒拷贝数进行相关性分析。

本发明所述的定量方法，其中所述步骤3)包括：

3a)再次扩增并纯化待测的svcv病毒；

3b)将再次纯化的病毒液进行梯度稀释，以bradford法测定每个稀释梯度的病毒液的蛋白浓度；

3c)根据步骤2f)建立的相关性，通过步骤3b)所测得的蛋白浓度计算病毒的拷贝数。

更优选地，本发明所述的定量方法，依次包括下述步骤：

i)m199培养基培养epc细胞并传代，接种待测病毒，继续培养至90％细胞出现细胞病变效应后，收集细胞及病毒混合液；

ii)将收集的细胞及病毒混合液反复冻融后过滤除去细胞碎片得到病毒初提液；

iii)离心沉淀所述病毒初提液，以缓冲溶液重悬病毒样品，获得超离病毒样品；

iv)配制密度梯度为15％、30％、45％、60％的蔗糖溶液，将超离病毒样品加至密度梯度蔗糖溶液上面，离心后收集在45％与30％蔗糖层的病毒的分布区带液体，制备纯化的病毒样品；

v)以seqidno.2和seqidno.3为引物，以纯化的病毒样品作为rna模板，用takara的反转录试剂盒primescript^tmrt-pcrkit进行rt-pcr，扩增核蛋白n基因的cdna；

vi)将获得的cdna构建重组质粒pmd^tm18-t-svcv-n并转化至dh5α；

vii)设计pmd^tm18-t-svcv-n的qpcr引物及taqman探针，从菌液中提取质粒pmd^tm18-t-svcv-n作为标准品模板，分别使用染料法和taqman探针法进行实时荧光定量pcr反应；

根据以下方法计算重组质粒的dna拷贝数：

分子拷贝(拷贝/μl)＝(6.02×10²³)×(质粒浓度×10^-9)/(质粒bp数×660)

以质粒的拷贝数的对数为横坐标、ct值为纵坐标作标准曲线；

viii)以bsa为标准品，稀释一系列的浓度梯度,然后加入bradford试剂,反应后使用酶标仪在595nm的波长下测量吸光度，以吸光度od值为横坐标、蛋白浓度为纵坐标作标准曲线；

ix)将纯化的svcv病毒液梯度稀释后，再用bradford法595nm条件下的吸光度值，通过步骤viii)的蛋白标准曲线求出每个稀释梯度的病毒液的蛋白浓度；

x)以稀释好的svcv病毒液作为模板，将病毒反转录为cdna，再以反转后的cdna为模板，进行实时荧光定量pcr反应,根据步骤vii)所作的标准曲线，推算出病毒液的拷贝数；

将步骤ix)中bradford法测得的svcv的蛋白浓度与步骤x)中rt-qpcr所测得的病毒拷贝数进行相关性分析，获得梯度稀释的蛋白质浓度与拷贝数之间的回归方程；

对于同批次的病毒，随后研究中直接通过测定纯化svcv的蛋白质含量，通过回归方程计算svcv的拷贝数。

本发明在taqman探针法qpcr的基础上，将常规蛋白定量方法与taqman探针法qpcr分子检测建立关联，建立了直接以bradford法蛋白定量确定svcv拷贝数的创新方法，该方法一旦建立，用来检测经过纯化的svcv，操作简便、成本低廉。

附图说明

图1rt-pcr扩增svcv-n基因结果的琼脂糖凝胶电泳图；

图中：m：dnamarker；1、2：svcv病毒原液rt-pcr产物；3：阴性(以无菌水代替模板的pcr产物)。

图2质粒转化后验证目的片段是否连接上载体菌落pcr产物的核酸电泳图；

图中：m：dnamarker；1-5不同单菌落为模板；6阴性(以无菌水代替模板的pcr产物)。

图3svcv-n连接载体后测序峰图；

图4通过超速离心及密度梯度离心纯化svcv蛋白的sds-page电泳图；

图中：1：超速离心沉淀重悬样品；2：密度梯度离心样品层(最上一层)样品；3：密度梯度离心15％蔗糖层样品；4：密度梯度离心30％蔗糖层样品；5：密度梯度离心45％蔗糖层样品；6：密度梯度离心60％蔗糖层样品；mproteinmarker。

图5纯化的svcv非变性酸性胶蛋白电泳图；

图中：1：含10％fbs的m199培养基；2：svcv病毒原液；3：蔗糖密度梯度离心纯化的svcv。

图6纯化的svcv非变性碱性胶蛋白电泳图；

图中：1：含10％fbs的m199培养基；2：svcv病毒原液；3：蔗糖密度梯度离心纯化的svcv。

图7taqman探针法检测svcvn基因的扩增曲线(a)及标准曲线(a)；

图8sybr染料法所作的溶解曲线(a)及标准曲线(a)；

图9bradford法所作的蛋白标准曲线；

图10taqman探针法检测病毒与bradford法测蛋白浓度的相关性分析(第一批次)；

图11taqman探针法检测病毒与bradford法测蛋白浓度的相关性分析(第二批次)。

具体实施方式

一、试验材料和设备

1、生物实验材料来源

(1)大肠杆菌(e.colidh5α),购自上海唯地生物技术有限公司。

(2)鲤鱼上皮瘤细胞(epitheliomapapulosumcyprinid，epc)及鲤春病毒血症病毒(springviremiaofcarpvirus,svcv)由深圳出入境检验检疫局提供。

2、试剂

dl-500dnamarker、dl-2000dnamarker均购自宝生物工程(大连)有限公司。extaq酶、反转录试剂盒primescript^tmrt-pcrkit、荧光定量pcr试剂盒premixextaq^tm(probeqpcr)、tbgreen^tmpremixextaq^tmii(tlirnasehplus)、dna片段纯化试剂盒minibestdnafragmentpurificationkitver.4.0、pmd^tm18-tvectorcloningkit购于宝生物工程(大连)有限公司(大连takara公司)。培养基m199购自gbico公司(美国)。快速质粒小提试剂盒(dp105)购自天根生化科技(北京)有限公司。改良型bradford蛋白浓度测定试剂盒、抗生素penicillin-streptomycin37.5:1等购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,depc)处理水、40％聚丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(sds)、四甲基二乙胺(temed)、过硫酸铵(aps)、浓盐酸氨苄青霉素、nacl、蛋白胨、细菌培养用酵母提取物、琼脂粉、琼脂糖、甲基绿、溴酚蓝、甘油、koh、β-alanine、tris、甘氨酸、kcl、na2po4、kh2po4、血清(fbs)、二甲基亚砜(dmso)、hepes、胰酶、碳酸氢钠(nahco3)、蔗糖等购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

3、仪器设备

【实施例1】鲤春病毒血症病毒的扩培及纯化

1.1svcv病毒的扩培

使用fbs浓度为10％的m199培养基培养epc细胞，培养条件为25℃恒温、5％co2。接种病毒前一天，对epc细胞进行传代，适当调节细胞浓度，使细胞次日在培养瓶贴壁后覆盖率为90％左右，接种病毒。加入病毒液后轻轻摇晃培养瓶，使病毒分散均匀、充分接触细胞，然后置于25℃培养箱中继续培养。每天观察细胞，进行拍照，当90％细胞出现细胞病变效应(cpe)后，可收集细胞及病毒混合液。

将收集到的细胞及病毒混合液反复冻融3次后用孔径0.22μm的滤膜过滤除去细胞碎片即得到病毒初提液。

1.2病毒纯化

取病毒初提液以140,000g在10℃下离心3h，弃上清，以适量的hepes缓冲溶液重悬超速离心沉淀下来的病毒样品，获得超离病毒样品。

配制15％、30％、45％、60％的蔗糖溶液，在离心管中依次小心地加入60％、45％、30％、15％的蔗糖溶液，注意加的时候要保持不同蔗糖的分界，不能将不同浓度的蔗糖混在一起。然后将超离病毒样品小心加至密度梯度蔗糖溶液上面，以120,000g在10℃下离心3h。离心后在45％与30％蔗糖层可看到明显的白色区带，为svcv的分布区带，收集此区带液体，以140,000g在10℃下离心3h，弃上清以去除蔗糖，用适量hepes缓冲液重悬沉淀，即为纯化的svcv病毒样，用于下一步实验或存于-80℃。

【实施例2】编码鲤春病毒血症病毒核蛋白n基因序列的获得

2.1鲤春病毒血症病毒核蛋白n核酸序列获取

在genbank上获取鲤春病毒血症病毒(springviraemiaofcarpvirus)

svcv-265株系的全基因组序列,登录号为kj513477.1。从中获取编码核蛋白n的基因序列如下(seqidno.1)：

atgagtgtcattcggatcaaaacaaatgctacagttgctgccgtgcttccggctaacgaagatcaggccgattatccttccactttttttgaaggggggaatgagattagattgtatgttaacaggggggagaaattggatgttttaaggcaatatgtctatatgggactggtggagaaaaactgtaggatacagcatgtgaatgcttatctatatgctgtgctgaagggagaaagagagctgctagaagcggattgggatagctttgggcacaagattgggattcagggggataagatcgggccttttaacttggtgcgagtggaagacatccccgacgggttaccagatgggaaactgaatgcagaggtgagtgctgaggatgatgcatggctgcctctcttcttgctgggtctttacagagtgggaagggcaagtgagactgcataccggactttgctgatggagtccctgataaaacagtgtaaggcaataaaatctgactgggtgtctcctgtaacggcaactcacaaatatttcgatatctggggcaatgatgggaattacctgaagattgtggcctgtgtggacatgttttacaaccattttaaaaagagcattaaagcaacattccgatggggaacgattgtatcacggttcaaagactgtgctgcactcgccaccctgggacatgttgtcaaaatcaccggtttgaccattgaagaggtgttcacatgggtactgcagactgaagtcgcggatgagttagtcaaaatgatgaagcctggacaggagatagataaaagcacgtcttacatgccgtacctgattgatatgggaatctctgccaaatcaccatactcaacaataaagaatccgtctttccatttctgggggcagcttgttgctgcattgtgccgctccaagagagcactgaacgcaagacagcctgatgagattgactcaatgtctatctcaaatgcaagcttgctgatggcttacgcattaggcagcagccctgacattgagcagcaattcagtacaggagacacatacagaaaaccgccaaaagaggcttcgtacctggtgagtgaggaaccgaaaaaccgatctgtcgttgaatggattgcatggtattctgacgtggacaacaaacctacggatgacatgctcatgatggcaaaacgagtagcggggactatctctgggcctcgcgataattcagttggcaaatggataaaacaaacctatgggtaa

2.2扩增核蛋白n基因引物的设计

使用软件primerpremier5.0设计一对特异性引物fsvcv-n、rsvcv-n扩增核蛋白n基因，将序列送至广州艾基生物技术有限公司合成。引物序列如下：fsvcv-n(5’-3’)：gtgggaagggcaagtgaga(seqidno.2)rsvcv-n(5’-3’)：ttgttgtccacgtcagaatacc(seqidno.3)

目的扩增序列为731bp，序列如下(seqidno.4)：

gtgggaagggcaagtgagactgcataccggactttgctgatggagtccctgataaaacagtgtaaggcaataaaatctgactgggtgtctcctgtaacggcaactcacaaatatttcgatatctggggcaatgatgggaattacctgaagattgtggcctgtgtggacatgttttacaaccattttaaaaagagcattaaagcaacattccgatggggaacgattgtatcacggttcaaagactgtgctgcactcgccaccctgggacatgttgtcaaaatcaccggtttgaccattgaagaggtgttcacatgggtactgcagactgaagtcgcggatgagttagtcaaaatgatgaagcctggacaggagatagataaaagcacgtcttacatgccgtacctgattgatatgggaatctctgccaaatcaccatactcaacaataaagaatccgtctttccatttctgggggcagcttgttgctgcattgtgccgctccaagagagcactgaacgcaagacagcctgatgagattgactcaatgtctatctcaaatgcaagcttgctgatggcttacgcattaggcagcagccctgacattgagcagcaattcagtacaggagacacatacagaaaaccgccaaaagaggcttcgtacctggtgagtgaggaaccgaaaaaccgatctgtcgttgaatggattgcatggtattctgacgtggacaacaa

【实施例3】重组质粒pmd^tm18-t-svcv-n的构建

3.1反转录获取病毒svcv的cdna

使用实验室前期获得的svcv病毒原液作为rna模板，用takara的反转录试剂盒primescript^tmrt-pcrkit进行rt-pcr。

1)模板rna变性及反转录反应

使用干净的rnasefree的pcr管，按照下表配制反应混合液：

2)按照以下程序在pcr仪上进行变性、退火反应

65℃5min

4℃

3)在上述反应管中配制下列反转录反应液

4)在pcr仪上按照下列条件进行反转录反应：

30℃10min

42℃30min

95℃5min

4℃

3.2pcr反应扩增基质蛋白m的目的基因序列

1)按照下列组成配制pcr反应液：

2)按照下列的touchdown程序在pcr仪上进行扩增反应：

3)将pcr产物用2％的琼脂糖凝胶进行电泳。

3.3构建重组质粒pmd^tm18-t-svcv-n并转化至dh5α

1)用takara的试剂盒minibestdnafragmentpurificationkitver.4.0，对上述获得的pcr产物进行纯化获得纯化的dna片段。

2)用上一步骤纯化所得的dna片段作为insertdna，按照下表配制dna溶液，再加入等量(5μl)的solutionⅰ，混匀后于16℃静置4h再于4℃过夜。

加样表

3)质粒转化及测序验证

从-80℃冰箱取出购买dh5α感受态细胞，置于冰上缓慢解冻，取5μl上述连接载体后的反应液，加入至50μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置30min后，转至42℃恒温金属浴中，热激45s，热激后置于冰上5min，向离心管中加入250μllb液体培养基，吹打混匀后置于摇床中，于37℃，200rpm的条件下培养1h复苏，然后吸取其中150μl培养液到lb平板上(含抗生素氨苄青霉素，amp)均匀涂布，平板在37℃培养箱过夜倒置培养。挑取单菌落至5μl无菌水中，取其中1μl作为模板，以fsvcvn和rsvcvn为引物进行pcr扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，对于扩增出预期大小片段的单菌落，取溶于无菌水的其余4μl进行过夜扩大培养，次日将菌液送至广州艾基生物技术有限公司测序，以确定插入的目的基因的序列及连接方向是否正确，选择正确的从菌液中提取质粒作为下一步qpcr的标准品。

【实施例4】实时荧光定量pcr作标曲线

4.1使用软件alleleid6设计pmd^tm18-t-svcv-n的qpcr引物及taqman探针，引物及探针由广州艾基生物科技有限公司合成。引物及探针序列如下：

qfsvcvn(5’-3’):agcttgttgctgcattgtgc(seqidno.5)

qrsvcvn(5’-3’):tgcctaatgcgtaagccatcag(seqidno.6)

proben(5’-3’):fam-ccaagagagcactgaacgcaagacagcc-tamra(seqidno.7)

4.2使用天根生化科技有限公司的快速质粒小提试剂盒(dp105)从菌液中提取质粒pmd^tm18-t-svcv-n，以10倍倍比梯度稀释质粒，以稀释后的质粒作为标准品模板，分别使用荧光定量pcr试剂盒premixextaq^tm(probeqpcr)和tbgreen^tmpremixextaq^tmii(tlirnasehplus)，即分别使用染料法和taqman探针法进行实时荧光定量pcr反应。

根据以下方法计算重组质粒的dna拷贝数：

分子拷贝(拷贝/μl)＝(6.02×10²³)×(质粒浓度×10^-9)/(质粒bp数×660)

以质粒的拷贝数的对数为横坐标、ct值(每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，c代表cycle，t代表threshold)为纵坐标作标准曲线。sybr染料法的反应体系如下反应参数为95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s；共40个循环，每个稀释度设三个平行：

taqman探针法的反应体系如下，反应参数为95℃，30s；95℃，5s；60℃，34s，共40个循环，每个稀释度设三个平行：

【实施例5】将纯化的svcv进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-page)

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-page)检测纯化的svcv的纯度，酸性非变性胶的工作液如下：

4x分离buffer(0.24mkoh):0.673gkoh溶于ddh2o中，调ph至4.3，定容至50ml；

4x堆积buffer(0.24mkoh):0.673koh溶于ddh2o中，调ph至6.8，定容至50ml；

5x电泳缓冲液：17.82gβ-alanine溶于ddh2o中，调ph至4.4，定容至500ml。

5x甲基绿蛋白上样缓冲液(10ml)：甲基绿1mg、甘油7.5ml、β-ala-hcl电泳buffer2.5ml。

碱性非变性胶的工作液如下：

4×分离胶buffer(1.5mtris-hcl，ph8.8)：9.0855gtris溶于ddh2o中，用浓盐酸调ph至8.8，定容至50ml；

4×堆积胶buffer(0.5mtris-hcl，ph6.8)：3.0285gtris溶于ddh2o中，用浓盐酸调ph至8.8，定容至50ml；

10×电泳buffer(ph8.8tris-gly):15.15gtris，72g甘氨酸，加水定容到500ml，4℃贮存；

5×溴酚蓝上样buffer:1mtris-hcl(ph＝6.8)0.6ml，50％甘油5ml，1％溴酚蓝1ml，ddh2o3.4ml；-20℃贮存。

native-page的酸性胶及碱性胶如下表：

native-page酸性蛋白胶配方

native-page碱性蛋白胶配方

培养液及svcv病毒原液各10μl、纯化的svcv20μl，分别加入5x电泳缓冲液，混匀，不加任何样品100v恒压将胶进行预电泳30min，加样，将电泳槽置于冰水中，100v电泳至样品进入分离胶，再调为160v恒压电泳，待甲基绿或者溴酚蓝移动至分离胶的最底部时停止电泳，注意进行酸性非变性胶电泳时需反转电极。切除浓缩胶，将分离胶移至考马斯亮蓝染色液中，染色30min，将胶置于适量脱色液中，水平摇床缓慢摇动4-6h，视脱色情况换脱色液3-4次，直至背景干净条带清晰。将脱色完毕的蛋白胶使用紫外成像仪拍照保存，观察结果并进行分析。

【实施例6】建立bradford法测svcv蛋白浓度与病毒rt-qpcr的关联

1)bradford法作蛋白标准曲线

以bradford试剂盒中的bsa为标准品，稀释一系列的浓度梯度：0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml，每个稀释度设三个重复，加20μl至96孔板中，然后每孔加入200μlbradford试剂,反应片刻后使用酶标仪在595nm的波长下测量吸光度(od值)，以od值为横坐标、蛋白浓度为纵坐标作标准曲线。

2)将实验室前期获得的纯化的svcv病毒液进行二倍比梯度稀释，稀释倍数为1/2-1/2⁷共7个浓度，再用bradford法595nm条件下的od值，通过上一步骤的蛋白标准曲线求出每个稀释梯度的病毒液的蛋白浓度。

3)以稀释好的svcv病毒液作为模板，使用takara的试剂盒primescript^tmrt-pcrkit将病毒反转录为cdna，再以反转后的cdna为模板，分别使用takara的试剂盒premixextaq^tm(probeqpcr)和tbgreen^tmpremixextaq^tmii(tlirnasehplus)进行实时荧光定量pcr反应。根据实施例4所作的标准曲线，推算出病毒液的拷贝数。

4)将bradford法测得的svcv的蛋白浓度与rt-qpcr所测得的病毒拷贝数进行相关性分析。

【实施例7】方法的应用

7.1依据【实施例1】的方法再次扩增并纯化病毒svcv

7.2依据【实施例6】的方法，将再次纯化的病毒svcv液进行二倍比梯度稀释，以bradford法测定每个稀释梯度的病毒液的蛋白浓度，以基于taqman探针法qpcr测定相应梯度稀释svcv拷贝数，分析本批次纯化的svcv蛋白浓度与病毒拷贝数之间的相关性。

结果表明：

(1)通过扩增svcv基因，将svcv核蛋白n基因序列基因克隆至质粒pmd^tm18-t，构建重组质粒pmd^tm18-t-svcv-n，质粒测序显示svcv核蛋白n基因成功插入pmd^tm18-t载体。质粒构建过程的基因扩增及质粒测序验证结果分别见图1、图2及图3。

(2)通过epc扩培svcv，反复冻融细胞收集svcv，然后采用超速离心与密度梯度离心相结合的方法纯化svcv，再经过超速离心出去蔗糖，sds-page电泳结果见图4，结果可见svcv纯度最高的样品位于密度梯度离心30％蔗糖层，收集该层svcv样品，再通过非变性酸性及碱性胶蛋白电泳检测，结果纯化svcv样品所在泳道未见蛋白进入非变性蛋白胶，证明获得高纯度的svcv病毒粒子(图5，图6)。

(3)设计合成用于基于taqman探针法qpcr的引物和相应的荧光探针，以梯度稀释的质粒pmd^tm18-t-svcv-n为模板，建立了基于taqman探针法qpcr的svcv拷贝数绝对定量方法，由图7(a)扩增曲线可见，各模板梯度均有“s”型扩增曲线，反映了pcr的指数增长期、线性增长期、平台期三个阶段，同时，每个稀释度2个平行扩增曲线吻合好，表明实验的重复性好。该方法最低可检测50拷贝(copies)的svcv，svcv在50copies至4.96×10⁹copies范围内，qpcr的ct值(y)与对数化的模板量(x,log(copies))之间具有极高的线性相关性，线性回归(linearregression)方程为y＝-3.1996x+41.543，相关系数r²高达0.995(见图7(b))。

采用染料法qpcr的svcv拷贝数绝对定量方法，由图8(a)可见，溶解曲线为单峰，说明扩增产物特异性好，该方法最低可检测500拷贝(copies)的svcv，svcv浓度在500copies至4.96×10⁹copies范围内也具有极高的线性相关性，线性回归(linearregression)方程为y＝-3.3407x+40.489，r²高达0.997(见图8(b))。

我国学者yue等(2008)建立了基于taqman探针法的qpcr定量检测svcv的方法，检测的是svcv囊膜糖蛋白g。最低可检测40拷贝(copies)的svcv，svcv浓度在40copies至4×10⁷copies范围内，qpcr的ct值(y)与对数化的模板浓度(x,log(copies))之间具有极高的线性相关性，线性回归(linearregression)方程为y＝-3.36x+38.42，r²为0.992。

表明本发明建立的基于taqman探针法qpcr检测svcv核蛋白n具有灵敏度高、线性更好，线性范围更广的优势。

(3)以bradford法测定梯度稀释的牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,bsa)作标准曲线，建立bradford法测定的梯度稀释的svcv蛋白浓度(y)与吸光度(opticaldensity,od)值(x)之间的线性回归方程为y＝434.98x-163.01，r²高达0.995(见图9)。同时，采用基于taqman探针法qpcr测定相应梯度稀释svcv拷贝数，然后建立svcv蛋白浓度与svcv拷贝数之间的关联，二者线性回归方程为y＝3.48×10^-5x-3.26×10^-6(x为svcv蛋白浓度，单位μg/ml；y为svcv的拷贝数，单位copies/μl)，r²高达0.997(见图10)。

为了验证该方法的可重复性，采用已建立的svcv扩增培养及超速离心结合密度梯度离心纯化法再次培养扩增及纯化svcv，通过bradford法测定梯度稀释的本批次svcv蛋白浓度，采用基于taqman探针法qpcr测定相应梯度稀释svcv拷贝数，结果表明，对于再次纯化的svcv，其蛋白浓度与svcv拷贝数之间同样显著正相关，二者线性回归方程为y＝2.52×10^-5x-3.64×10^-6(x为svcv蛋白浓度，单位μg/ml；y为svcv的拷贝数，单位copies/μl)，r²高达0.982(见图11)。

由于本发明建立的基于taqman探针法qpcr检测svcv核蛋白n反映的拷贝数与bradford法直接测定svcv的蛋白质浓度之间的关联，不同批次纯化的svcv所测蛋白浓度与拷贝数之间均具有显著正相关。

因此表明，通过本发明建立了灵敏度高、重复性的svcv简便定量方法，每一批次纯化的svcv，建立其梯度稀释的蛋白质浓度与拷贝数之间的回归方程后，对于同批次的病毒，随后研究中即可直接通过测定纯化svcv的蛋白质含量，通过回归方程计算svcv的拷贝数。

sequencelisting

<110>深圳大学

深圳市检验检疫科学研究院

<120>一种鲤春病毒血症病毒的定量方法

<130>sz1137-18p122149

<160>7

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1257

<212>dna

<213>springviraemiaofcarpvirus

<400>1

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<220>

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<210>4

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<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>svcv核蛋白n基因

<400>4

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<212>dna

<213>artificial

<220>

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