引物组合在牛的种属鉴定和/或牛肉鉴定中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物组合在牛的种属鉴定和/或牛肉鉴定中的应用。

背景技术：

牛肉是世界第三消耗肉品，约占肉制品市场的25％。落后于猪肉(38％)和家禽(30％)。美国、巴西和中国是世界消费牛肉前三的国家。按2009年人年消费来看，阿根廷以64.6千克排名第一，美国为42.1千克，欧洲为11.9千克。最大的牛肉出口国包括印度、巴西、澳大利亚和美国。牛肉制品对于巴拉圭、阿根廷、爱尔兰、墨西哥、新西兰、尼加拉瓜、乌拉圭的经济有重要影响。这些因素为国内外不法商贩乘虚而入创造了条件，在市场上肉的掺假和欺诈行为也越来越受到人们的关注。其中，猪肉等常常被用作掺假肉来冒充牛肉。

牦牛、黄牛及水牛属于牛属(或水牛属)的不同亚种，其中牦牛(boggrunniens)是唯一能适应青藏高原及周边地区特殊生态环境且延续至今的牛种，主要分布于我国的青藏高原地区，为广大藏区人民提供奶、肉、毛、役力、燃料等生产、生活必需品，具有不可替代性，也是该区域草地畜牧业和民族经济可持续发展的资源依托。牦牛肉作为一种高品质肉类，氨基酸含量丰富、种类齐全，营养成分显著高于其他牛种。

近年来，随着旅游行业的快速发展，牦牛肉制品以其较好的营养价值和独特的天然口感越来越受到消费者的青睐，但其市场价格与其他牛肉存在较大差异。有报道曝光不良商家用黄牛肉、水牛肉甚至猪肉等肉质来冒充牦牛肉的情况，以次充好，谋取暴利，欺骗消费者。因此，针对水牛、黄牛与牦牛的物种鉴定方法十分必要。为保障消费者合法权益，如何有效、准确地判别出生肉、肉类加工食品等是否掺假，简单易行的检测方法具有紧迫性。

对于现今社会而言，传统的依靠感官和经验的肉类形态鉴别方法已经不能满足市场对肉制品掺假现象进行控制监管的需要。目前对肉类产品的鉴定方法主要在蛋白质和核酸水平进行。在蛋白质水平，常用elisa和高效液相色谱等技术进行检测，其局限性在于对仪器、试剂和样品处理要求高，且检测加工样品时特异性和准确性较差，费时费力。相对来说，检测核酸的方式更方便准确。在核酸水平，常用的核酸水平检测技术有pcr与实时荧光pcr。pcr技术是目前最常用的检测肉源性成分的方法，因为其具有较高的灵敏度、特异性和可操作性。但一般的pcr反应至少1.5h，且后期检测需要使用基因测序和凝胶电泳，而凝胶电泳中的eb具有强致癌性，具有一定的安全隐患。而实时荧光pcr需要昂贵的仪器及试剂，且反应时间至少1.5h，且对操作人员有较高要求，难以在基层得以推广。

目前，国内现阶段并无有效的检测黄牛肉、水牛肉和牦牛肉的lamp引物组及检测方法，更无有效区分水牛、黄牛和牦牛的lamp引物组合。因此，提供一种能够有效检测黄牛肉、水牛肉和牦牛肉的lamp引物组及检测方法具有重要的现实意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种引物组合在牛的种属鉴定和/或牛肉鉴定中的应用。本发明基于环介导等温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermamplification，lamp)，目的是为了建立具有准确率高、特异性好、检测时间短、结果可实时观测，从样品处理到报告结果只需1h的快速简便且后期可能用于现场实时检测的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了线粒体cytb基因在牛的种属鉴定和/或牛肉鉴定中的应用；

所述牛为黄牛、水牛或牦牛；所述牛肉为黄牛肉、水牛肉或牦牛肉。

在此基础上，本发明还提供了标志物，具有如seqidno:19、seqidno:20或seqidno:21所示的核苷酸序列。

此外，本发明还提供了具有如seqidno:19、seqidno:20或seqidno:21所示序列的核苷酸作为标志物在牛的种属鉴定和/或牛肉鉴定中的应用；

所述牛为黄牛、水牛或牦牛；所述牛肉为黄牛肉、水牛肉或牦牛肉。

本发明还提供了引物组合，包括：引物-f3、引物-b3、引物-fip、引物-bip、引物-lf和引物-lb；

所述引物-f3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(i)、具有seqidno:1、seqidno:7、seqidno:13所示的核苷酸序列；

(ii)、具有seqidno:1、seqidno:7、seqidno:13所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(iii)、与seqidno:1、seqidno:7、seqidno:13所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(iv)、如(i)、(ii)或(iii)所示序列的互补序列；

所述引物-b3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(v)、具有seqidno:2、seqidno:8、seqidno:14所示的核苷酸序列；

(vi)、具有seqidno:2、seqidno:8、seqidno:14所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(vii)、与seqidno:2、seqidno:8、seqidno:14所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(viii)、如(v)、(vi)或(vii)所示序列的互补序列；

所述引物-fip具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(ix)、具有seqidno:3、seqidno:9、seqidno:15所示的核苷酸序列；

(x)、具有seqidno:3、seqidno:9、seqidno:15所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xi)、与seqidno:3、seqidno:9、seqidno:15所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xii)、如(ix)、(x)或(xi)所示序列的互补序列；

所述引物-bip具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(xiii)、具有seqidno:4、seqidno:10、seqidno:16所示的核苷酸序列；

(xiv)、具有seqidno:4、seqidno:10、seqidno:16所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xv)、与seqidno:4、seqidno:10、seqidno:16所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xvi)、如(xiii)、(xiv)或(xv)所示序列的互补序列；

所述引物-lf具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(xvii)、具有seqidno:5、seqidno:11、seqidno:17所示的核苷酸序列；

(xviii)、具有seqidno:5、seqidno:11、seqidno:17所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xix)、与seqidno:5、seqidno:11、seqidno:17所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xx)、如(xvii)、(xviii)或(xix)所示序列的互补序列；

所述引物-lb具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(xxi)、具有seqidno:6、seqidno:12、seqidno:18所示的核苷酸序列；

(xxii)、具有seqidno:6、seqidno:12、seqidno:18所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xxiii)、与seqidno:6、seqidno:12、seqidno:18所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xxiv)、如(xxi)、(xxii)或(xxiii)所示序列的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合，包括：引物-f3、引物-b3、引物-fip、引物-bip、引物-lf和引物-lb；

所述引物-f3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(i)、具有seqidno:1所示的核苷酸序列；

(ii)、具有seqidno:1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(iii)、与seqidno:1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(iv)、如(i)、(ii)或(iii)所示序列的互补序列；

所述引物-b3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(v)、具有seqidno:2所示的核苷酸序列；

(vi)、具有seqidno:2所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(vii)、与seqidno:2所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(viii)、如(v)、(vi)或(vii)所示序列的互补序列；

所述引物-fip具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(ix)、具有seqidno:3所示的核苷酸序列；

(x)、具有seqidno:3所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xi)、与seqidno:3所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xii)、如(ix)、(x)或(xi)所示序列的互补序列；

所述引物-bip具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(xiii)、具有seqidno:4所示的核苷酸序列；

(xiv)、具有seqidno:4所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xv)、与seqidno:4所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xvi)、如(xiii)、(xiv)或(xv)所示序列的互补序列；

所述引物-lf具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(xvii)、具有seqidno:5所示的核苷酸序列；

(xviii)、具有seqidno:5所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xix)、与seqidno:5所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xx)、如(xvii)、(xviii)或(xix)所示序列的互补序列；

所述引物-lb具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(xxi)、具有seqidno:6所示的核苷酸序列；

(xxii)、具有seqidno:6所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xxiii)、与seqidno:6所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xxiv)、如(xxi)、(xxii)或(xxiii)所示序列的互补序列。

上述引物组合可以用于鉴定黄牛或黄牛肉。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合，包括：引物-f3、引物-b3、引物-fip、引物-bip、引物-lf和引物-lb；

所述引物-f3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(i)、具有seqidno:7所示的核苷酸序列；

(ii)、具有seqidno:7所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(iii)、与seqidno:7所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(iv)、如(i)、(ii)或(iii)所示序列的互补序列；

所述引物-b3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(v)、具有seqidno:8所示的核苷酸序列；

(vi)、具有seqidno:8所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(vii)、与seqidno:8所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(viii)、如(v)、(vi)或(vii)所示序列的互补序列；

所述引物-fip具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(ix)、具有seqidno:9所示的核苷酸序列；

(x)、具有seqidno:9所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xi)、与seqidno:9所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xii)、如(ix)、(x)或(xi)所示序列的互补序列；

所述引物-bip具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(xiii)、具有seqidno:10所示的核苷酸序列；

(xiv)、具有seqidno:10所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xv)、与seqidno:10所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xvi)、如(xiii)、(xiv)或(xv)所示序列的互补序列；

所述引物-lf具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(xvii)、具有seqidno:11所示的核苷酸序列；

(xviii)、具有seqidno:11所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xix)、与seqidno:11所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xx)、如(xvii)、(xviii)或(xix)所示序列的互补序列；

所述引物-lb具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(xxi)、具有seqidno:12所示的核苷酸序列；

(xxii)、具有seqidno:12所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xxiii)、与seqidno:12所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xxiv)、如(xxi)、(xxii)或(xxiii)所示序列的互补序列。

上述引物组合可以用于鉴定水牛或水牛肉。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合，包括：引物-f3、引物-b3、引物-fip、引物-bip、引物-lf和引物-lb；

所述引物-f3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(i)、具有seqidno:13所示的核苷酸序列；

(ii)、具有seqidno:13所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(iii)、与seqidno:13所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(iv)、如(i)、(ii)或(iii)所示序列的互补序列；

所述引物-b3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(v)、具有seqidno:14所示的核苷酸序列；

(vi)、具有seqidno:14所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(vii)、与seqidno:14所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(viii)、如(v)、(vi)或(vii)所示序列的互补序列；

所述引物-fip具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(ix)、具有seqidno:15所示的核苷酸序列；

(x)、具有seqidno:15所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xi)、与seqidno:15所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xii)、如(ix)、(x)或(xi)所示序列的互补序列；

所述引物-bip具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(xiii)、具有seqidno:16所示的核苷酸序列；

(xiv)、具有seqidno:16所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xv)、与seqidno:16所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xvi)、如(xiii)、(xiv)或(xv)所示序列的互补序列；

所述引物-lf具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(xvii)、具有seqidno:17所示的核苷酸序列；

(xviii)、具有seqidno:17所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xix)、与seqidno:17所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xx)、如(xvii)、(xviii)或(xix)所示序列的互补序列；

所述引物-lb具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(xxi)、具有seqidno:18所示的核苷酸序列；

(xxii)、具有seqidno:18所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(xxiii)、与seqidno:18所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(xxiv)、如(xxi)、(xxii)或(xxiii)所示序列的互补序列。

上述引物组合可以用于鉴定牦牛或牦牛肉。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合中所述引物-f3、所述引物-b3、所述引物-fip、所述引物-bip、所述引物-lf和所述引物-lb的摩尔比为0.3：0.3：2.4：2.4：1：1。

本发明还提供了试剂盒，包括所述的引物组合。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的引物组合或所述的试剂盒在牛的种属鉴定和/或牛肉鉴定中的应用；

所述牛为黄牛、水牛或牦牛；所述牛肉为黄牛肉、水牛肉或牦牛肉。

此外，本发明还提供了牛的种属鉴定的方法，包括如下步骤：

(1)获得待测样品的核酸；

(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，分别采用所述的引物组合中的引物进行环介导等温扩增，获得扩增结果；

(3)根据所述扩增结果获得鉴定结果：如果可以实现特异性扩增，则待测样品为牛；如果不能实现特异性扩增，则待测样品不为牛；

所述牛为黄牛、水牛或牦牛。

本发明还提供了牛肉的鉴定的方法，包括如下步骤：

(1)获得待测样品的核酸；

(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，分别采用如权利要求4或5所述的引物组合中的引物进行环介导等温扩增，获得扩增结果；

(3)根据所述扩增结果获得鉴定结果：如果可以实现特异性扩增，则待测样品为牛肉；如果不能实现特异性扩增，则待测样品不为牛肉；

所述牛肉为黄牛肉、水牛肉或牦牛肉。

在本发明的一些具体实施方案中，所述环介导等温扩增的反应体系为：0.3mm的外引物f3和b3各0.12μl；2.4mm的内引物fip和bip各0.96μl；1mm的环引物lf和lb各0.4μl；2×反应缓冲液10μl；1μl的待测样品核酸，加水至20μl体系。

在本发明的一些具体实施方案中，所述环介导等温扩增的反应温度为60℃～65℃，反应时间为50min。

本发明提供了一种从多种肉中检测黄牛、水牛和牦牛的lamp引物以及检测黄牛肉、水牛肉和牦牛肉的lamp引物及检测方法，可以通过相似物种间微小的短序列差异完成准确的区分检测。本发明使用的荧光法lamp进行检测，可以实时观察结果，避免了造成污染的风险，且可以在总反应时间50min内即能检测到20pg的核酸。为国内在此领域的空白补充了有效的检测引物及方法。

本发明筛选到的引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点，并且可以只通过短序列的差异，完成水牛、黄牛和牦牛的区分。从样品处理到报告结果只需1h，操作简单，比其它pcr方法具有更高的特异性。同时，本发明首次设计、筛选到检测样品中黄牛肉、水牛肉和牦牛肉的lamp引物，并建立了三种不同牛品种的lamp检测方法，填补了国内外在此检测领域的空白。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示20ng/μl的黄牛肉核酸dna采用本发明的引物进行lamp反应的实时荧光值与反应时间图；

图2示20ng/μl的含有黄牛cytb基因的阳性质粒、黄牛肉核酸dna、牦牛肉核酸dna、水牛肉核酸dna、绵羊肉核酸dna、猪肉核酸dna、鸡肉核酸dna和鸭肉核酸dna采用本发明的引物进行lamp反应的实时荧光值与反应时间图，考察引物的特异性，结果只有含有黄牛cytb基因的阳性质粒和黄牛肉核酸dna出现阳性扩增；

图3(a)～图3(d)示20ng/μl的阳性对照样品质粒dna以10^-1、10^-2、10^-3、10^-4的稀释度进行梯度稀释后，采用本发明的引物进行lamp反应的实时荧光值与反应时间图；

图4示20pg/μl的黄牛肉核酸dna采用本发明的引物进行lamp反应的实时荧光值与反应时间图，结果为灵敏度下的重复性(20/20)考察结果；

图5示20ng/μl的水牛肉核酸dna采用本发明的引物进行lamp反应的实时荧光值与反应时间图；

图6示20ng/μl的含有水牛cytb基因的阳性质粒、水牛肉核酸dna、牦牛肉核酸dna、黄牛肉核酸dna、绵羊肉核酸dna、猪肉核酸dna、鸡肉核酸dna和鸭肉核酸dna采用本发明的引物进行lamp反应的实时荧光值与反应时间图，考察引物的特异性，结果只有含有水牛cytb基因的阳性质粒和水牛肉核酸dna出现阳性扩增；

图7(a)～图7(d)示20ng/μl的阳性对照样品质粒dna以10^-1、10^-2、10^-3、10^-4的稀释度进行梯度稀释后，采用本发明的引物进行lamp反应的实时荧光值与反应时间图；

图8示20pg/μl的水牛肉核酸dna采用本发明的引物进行lamp反应的实时荧光值与反应时间图，结果为灵敏度下的重复性(20/20)考察结果；

图9示20ng/μl的牦牛肉核酸dna采用本发明的引物进行lamp反应的实时荧光值与反应时间图；

图10示20ng/μl的含有牦牛cytb基因的阳性质粒、牦牛肉核酸dna、水牛肉核酸dna、黄牛肉核酸dna、绵羊肉核酸dna、猪肉核酸dna、鸡肉核酸dna和鸭肉核酸dna采用本发明的引物进行lamp反应的实时荧光值与反应时间图，考察引物的特异性，结果只有含有牦牛cytb基因的阳性质粒和牦牛肉核酸dna出现阳性扩增；

图11(a)～图11(d)示20ng/μl的阳性对照样品质粒dna以10^-1、10^-2、10^-3、10^-4的稀释度进行梯度稀释后，采用本发明的引物进行lamp反应的实时荧光值与反应时间图；

图12示20pg/μl的牦牛肉核酸dna采用本发明的引物进行lamp反应的实时荧光值与反应时间图，结果为灵敏度下的重复性(20/20)考察结果。

具体实施方式

本发明公开了一种引物组合在牛的种属鉴定和/或牛肉鉴定中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种能够区分基因中短序列差异，从多种肉中准确鉴定出黄牛肉、牦牛肉、水牛肉的lamp引物组合及应用。发明内容涉及检测黄牛肉、牦牛肉、水牛肉的特异性引物组，和利用该引物组建立的检测方法。

具体的，本发明提供了一种能够区分基因中短序列差异，从多种肉中准确鉴定出黄牛肉的lamp引物组合及应用。发明内容涉及检测黄牛肉的特异性引物组，和利用该引物组建立的检测方法。

本发明提供了一种检测样品中黄牛肉核酸dna的lamp检测用引物，lamp检测引物为：

外引物hn-f3-1：5’-cctaattcttgctctaatcc-3(如seqidno.1所示)

外引物hn-b3-1：5’-agatgctagttgtccgat-3’(如seqidno.2所示)

内引物hn-fip-1：5’-ggctcaggaataggcattggcccctactacacacctccaaac-3’(如seqidno.3所示)

内引物hn-bip-1：5’-gccctagtagcagacctactgacacggtgatatatgggtgttcgac-3’(如seqidno.4所示)

环引物hn-lf-1：5’-gtggtcggaatattatgcttcg-3’(如seqidno.5所示)

环引物hn-lb-1：5’-cacatgaattggaggacaacc-3’(如seqidno.6所示)

所述引物是针对ncbi数据库中提供的黄牛的cytb基因的压缩序列进行设计的；为了提高引物的灵敏度，通过文献调研，确定选用线粒体基因cytb作为检测对象。在ncbi的nt数据库中共收集到358条黄牛的cytb序列，使用bioedit软件将收集到的序列进行比对，并进行压缩生成consensussequence序列，此序列即为压缩序列。为了提高引物的特异性，本引物在设计时使用该压缩序列与其他物种的压缩序列进行了比对(其它物种包括：猪、牦牛、水牛、绵羊、山羊、驴、马、鸭、鹅、鸡、鼠、猫、狗、狐狸、兔子和人等常见物种)，通过序列分析，确定了水牛、黄牛和牦牛的序列差异不大，只有零星几个或一小段序列的差异，且还要保证与其他物种能够区分，通过一般软件来设计的lamp引物，无法达到区分二者或多者的目的。所以本发明中涉及保护的引物序列，是针对水牛、黄牛、牦牛和其它物种之间的零星或一小段序列差异进行的人工引物设计。最终确定了能保证该引物特异性无问题的一段序列进行了lamp引物设计。因为引物该lamp引物设计需要人为特异性区分其它物种，因此本发明从每个物种的序列比对压缩、到物种间差异性的对比，得到针对上述分析得到的代表性基因序列区段(如seqidno.7所示)，再通过人工设计的方法得到了多套引物组合，然后进行引物组合的筛选和修改优化等一系列工作，灵敏度、重复性和特异性都达到最好水平的引物组合，其对检测样品中是否含有绵羊成分具有极高的特异性和灵敏度。

seqidno.19：

ggaggagtactagccctagccttctctatcctaattcttgctctaatccccctactacacacctccaaacaacgaagcataatattccgaccactcagccaatgcctattcctgagccctagtagcagacctaytgacactcacatgaattggaggacaaccagtcgaacacccatatatcaccatyggacaactagcatctrtcctatactttctcctcatcctagtrctaataccaacrgccggcaca。

其中，y、r为简并碱基，y＝c/t，r＝a/g。

本发明的另一方面是提供一种检测样品中黄牛肉的lamp检测方法，其特征在于，使用上述的lamp检测用引物进行lamp扩增。

为了进一步优化上述的检测方法，本发明提供的技术方案还包括：

0.3mm的外引物f3和b3各0.12μl；2.4mm的内引物fip和bip各0.96μl；1mm的环引物lf和lb各0.4μl；2×反应缓冲液10μl；1μl的样品dna，加灭菌纯化水至20μl体系。

上述lamp检测反应条件为：60℃-65℃恒温50min。

优选地，上述lamp检测反应条件为：65℃恒温50min。

上述的lamp检测方法中，检测结果通过观察实时荧光pcr仪出峰时间。

本发明另一方面还提供了从多种肉中准确鉴定出黄牛肉的lamp检测方法，样品中牦牛肉检测方法中包含有上述的lamp检测用引物。

本发明提供一种能够区分基因中短序列差异，从多种肉中准确鉴定出黄牛肉的lamp引物组合及应用。使用lamp技术在实时荧光pcr仪中实时检测生肉、肉类加工食品等以肉为主的样品中的黄牛肉核酸dna。本发明筛选到的引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点，从样品处理到报告结果只需1h，操作简单，比其它pcr方法具有更高的特异性。同时，本发明首次设计、筛选到检测样品中黄牛肉核酸dna的lamp引物，并建立了样品中黄牛肉核酸dna的lamp检测方法，填补了国内外在此检测领域的空白。

本发明还提供一种能够区分基因中短序列差异，从多种肉中准确鉴定出水牛肉的lamp引物组合及应用。发明内容涉及检测水牛肉的特异性引物组，和利用该引物组建立的检测方法。

本发明提供了一种检测样品中水牛肉核酸dna的lamp检测用引物，lamp检测引物为：

外引物sn-f3-4：5’-gcaaacccactcaacaca-3(如seqidno.7所示)

外引物sn-b3-2：5’-tgataatatatgggtgttcgac-3’(如seqidno.8所示)

内引物sn-fip-4：5’-

catgagaatgaggattaggatggagctccccacatcaagcct-3’(如seqidno.9所示)

内引物sn-bip-2：5’-tatgatgttccggccattcagcgctgtcctccaatccatg-3’(如seqidno.10所示)

环引物sn-lf-2：5’-gttaggaattgatcgtaagattgc-3’(如seqidno.11所示)

环引物sn-lb-1：5’-gcctattctgaatcctagtagcaaac-3’(如seqidno.12所示)

所述引物是针对ncbi数据库中提供的水牛的cytb基因的压缩序列进行设计的；为了提高引物的灵敏度，通过文献调研，确定选用线粒体基因cytb作为检测对象。在ncbi的nt数据库中共收集到119条水牛的cytb序列，使用bioedit软件将收集到的序列进行比对，并进行压缩生成consensussequence序列，此序列即为压缩序列。为了提高引物的特异性，本引物在设计时使用该压缩序列与其他物种的压缩序列进行了比对(其它物种包括：猪、牦牛、黄牛、绵羊、山羊、驴、马、鸭、鹅、鸡、鼠、猫、狗、狐狸、兔子和人等常见物种)。通过序列分析，确定了水牛、黄牛和牦牛的序列差异不大，只有零星几个或一小段序列的差异，且还要保证与其他物种能够区分，通过一般软件来设计的lamp引物，无法达到区分二者或多者的目的。所以本发明中涉及保护的引物序列，是针对水牛、黄牛、牦牛和其它物种之间的零星或一小段序列差异进行的人工引物设计。最终确定了能保证该引物特异性无问题的一段序列进行了lamp引物设计。因为引物该lamp引物设计需要人为特异性区分其它物种，因此本发明从每个物种的序列比对压缩、到物种间差异性的对比，得到针对上述分析得到的代表性基因序列区段(如seqidno.20所示)，再通过人工设计的方法得到了多套引物组合，然后进行引物组合的筛选和修改优化等一系列工作，灵敏度、重复性和特异性都达到最好水平的引物组合，其对检测样品中是否含有绵羊成分具有极高的特异性和灵敏度。

seqidno.20：

gacccagacaactacaccccagcaaacccactcaacacacctccccacatcaagcctgaatggtacttcctrttcgcatacgcaatcttacgatcaattcctaacaaactaggaggggttctagccctagttctctcyatcctaatcctcattctcatgcccctgctacayacatccaaacaacgaagtatgatgttccgrccattcagccaatgcctattctgaatyctagtagcaaacctgctaacactcacatgrattggaggacagccagtcgaacacccatatattatcat。

其中，y、r为简并碱基，y＝c/t，r＝a/g。

本发明的另一方面是提供一种检测样品中水牛肉的lamp检测方法，其特征在于，使用上述的lamp检测用引物进行lamp扩增。

为了进一步优化上述的检测方法，本发明提供的技术方案还包括：

0.3mm的外引物f3和b3各0.12μl；2.4mm的内引物fip和bip各0.96μl；1mm的环引物lf和lb各0.4μl；2×反应缓冲液10μl；1μl的样品dna，加灭菌纯化水至20μl体系。

上述lamp检测反应条件为：60℃-65℃恒温50min。

优选地，上述lamp检测反应条件为：65℃恒温50min。

上述的lamp检测方法中，检测结果通过观察实时荧光pcr仪出峰时间。

本发明另一方面还提供了从多种肉中准确鉴定出水牛肉的lamp检测方法，样品中绵羊肉检测方法中包含有上述的lamp检测用引物。

本发明提供一种能够区分基因中短序列差异，从多种肉中准确鉴定出水牛肉的lamp引物组合及应用。使用lamp技术在实时荧光pcr仪中实时检测生肉、肉类加工食品等以肉为主的样品中的水牛肉核酸dna。本发明筛选到的引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点，从样品处理到报告结果只需1h，操作简单，比其它pcr方法具有更高的特异性。同时，本发明首次设计、筛选到检测样品中水牛肉核酸dna的lamp引物，并建立了样品中水牛肉核酸dna的lamp检测方法，填补了国内外在此检测领域的空白。

本发明提供了一种能够区分基因中短序列差异，从多种肉中准确鉴定出牦牛肉的lamp引物组合及应用。发明内容涉及检测牦牛肉的特异性引物组，和利用该引物组建立的检测方法。

本发明提供了一种检测样品中牦牛肉核酸dna的lamp检测用引物，lamp检测引物为：

外引物mn-f3-2-1：5’-ggctccaacaatccaa-3’(如seqidno.13所示)

外引物mn-b3-3-2：5’-cgtaaaattgcgtatgca-3’(如seqidno.14所示)

内引物mn-fip-2-2：5’-cagaagtattagggctagaattagtgaatctcctcagacgcag-3’(如seqidno.15所示)

内引物mn-bip-3-6：5’-tctggtactattcacacccgactcattcgggtttgatgtg-3’(如seqidno.16所示)

环引物mn-lf-1-2：5’-ggctcctaagatgtctttaatg-3’(如seqidno.17所示)

环引物mn-lb-2-2：5’-tacaccccagcaaatcca-3’(如seqidno.18所示)

所述引物是针对ncbi数据库中提供的牦牛的cytb基因的压缩序列进行设计的；为了提高引物的灵敏度，通过文献调研，确定选用线粒体基因cytb作为检测对象。在ncbi的nt数据库中共收集到105条牦牛的cytb序列，使用bioedit软件将收集到的序列进行比对，并进行压缩生成consensussequence序列，此序列即为压缩序列。为了提高引物的特异性，本引物在设计时使用该压缩序列与其他物种的压缩序列进行了比对(其它物种包括：猪、黄牛、水牛、绵羊、山羊、驴、马、鸭、鹅、鸡、鼠、猫、狗、狐狸、兔子和人等常见物种)，通过序列分析，确定了水牛、黄牛和牦牛的序列差异不大，只有零星几个或一小段序列的差异，且还要保证与其他物种能够区分，通过一般软件来设计的lamp引物，无法达到区分二者或多者的目的。所以本发明中涉及保护的引物序列，是针对水牛、黄牛、牦牛和其它物种之间的零星或一小段序列差异进行的人工引物设计。最终确定了能保证该引物特异性无问题的一段序列进行了lamp引物设计。因为引物该lamp引物设计需要人为特异性区分其它物种，因此本发明从每个物种的序列比对压缩、到物种间差异性的对比，得到针对上述分析得到的代表性基因序列区段(如seqidno.21所示)，再通过人工设计的方法得到了多套引物组合，然后进行引物组合的筛选和修改优化等一系列工作，灵敏度、重复性和特异性都达到最好水平的引物组合，其对检测样品中是否含有绵羊成分具有极高的特异性和灵敏度。

seqidno.21：

cacgaaacaggctccaacaatccaacaggaatctcctcagacgcagacaaaattccattycacccctactataccattaaagacatcttaggagccttattactaattctagccctaatacttctggtactattcacacccgacctcctcggagacccagacaactacaccccagcaaatccactcaayacacctccccacatcaaacccgaatgatacttcttatttgcatacgcaattttacgatcaatccccaataaac。

其中，y为简并碱基，y＝c/t。

本发明的另一方面是提供一种检测样品中牦牛肉的lamp检测方法，其特征在于，使用上述的lamp检测用引物进行lamp扩增。

为了进一步优化上述的检测方法，本发明提供的技术方案还包括：

0.3mm的外引物f3和b3各0.12μl；2.4mm的内引物fip和bip各0.96μl；1mm的环引物lf和lb各0.4μl；2×反应缓冲液10μl；1μl的样品dna，加灭菌纯化水至20μl体系。

上述lamp检测反应条件为：60℃-65℃恒温50min。

优选地，上述lamp检测反应条件为：65℃恒温50min。

上述的lamp检测方法中，检测结果通过观察实时荧光pcr仪出峰时间。

本发明另一方面还提供了从多种肉中准确鉴定出牦牛肉的lamp检测方法，样品中牦牛肉检测方法中包含有上述的lamp检测用引物。

本发明提供一种能够区分基因中短序列差异，从多种肉中准确鉴定出牦牛肉的lamp引物组合及应用。使用lamp技术在实时荧光pcr仪中实时检测生肉、肉类加工食品等以肉为主的样品中的牦牛肉核酸dna。本发明筛选到的引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点，从样品处理到报告结果只需1h，操作简单，比其它pcr方法具有更高的特异性。同时，本发明首次设计、筛选到检测样品中牦牛肉核酸dna的lamp引物，并建立了样品中牦牛肉核酸dna的lamp检测方法，填补了国内外在此检测领域的空白。

本发明技术方案主要分为以下几个方面：

1、确定检测基因及序列：通过文献调研确定黄牛肉、水牛肉和牦牛肉的检测基因均为cytb基因，全长均在1140bp左右，保守度高特异性好，比对后确定与其相似度最高的物种的序列相似度仅为90％～94％。序列为收集序列(在生物学数据库中搜集待检测基因的序列并进行生物学分析，以保证设计的引物可以达到实际应用的需求)

2、lamp引物设计：观察序列差异，人工手动设计lamp引物

黄牛的lamp引物序列为：

外引物hn-f3-1：5’-cctaattcttgctctaatcc-3

外引物hn-b3-1：5’-agatgctagttgtccgat-3’

内引物hn-fip-1：5’-ggctcaggaataggcattggcccctactacacacctccaaac-3’

内引物hn-bip-1：5’-gccctagtagcagacctactgacacggtgatatatgggtgttcgac-3’

环引物hn-lf-1：5’-gtggtcggaatattatgcttcg-3’

环引物hn-lb-1：5’-cacatgaattggaggacaacc-3’

水牛的lamp引物序列为：

外引物sn-f3-4：5’-gcaaacccactcaacaca-3

外引物sn-b3-2：5’-tgataatatatgggtgttcgac-3’

内引物sn-fip-4：5’-catgagaatgaggattaggatggagctccccacatcaagcct-3’

内引物sn-bip-2：5’-tatgatgttccggccattcagcgctgtcctccaatccatg-3’

环引物sn-lf-2：5’-gttaggaattgatcgtaagattgc-3’

环引物sn-lb-1：5’-gcctattctgaatcctagtagcaaac-3’

牦牛的lamp引物序列为：

外引物mn-f3-2-1：5’-ggctccaacaatccaa-3

外引物mn-b3-3-2：5’-cgtaaaattgcgtatgca-3’

内引物mn-fip-2-2：5’-cagaagtattagggctagaattagtgaatctcctcagacgcag-3’

内引物mn-bip-3-6：5’-tctggtactattcacacccgactcattcgggtttgatgtg-3’

环引物mn-lf-1-2：5’-ggctcctaagatgtctttaatg-3’

环引物mn-lb-2-2：5’-tacaccccagcaaatcca-3’

3、对lamp引物的性能进行验证：

lamp引物的初筛及灵敏度：合成得到多套用于检测对应指标(黄牛、水牛和牦牛)的lamp引物通过初筛确定性能，使用浓度为20ng/μl的核酸来进行引物的筛选；以20ng/μl稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4的核酸来考察引物的灵敏度(每个浓度下重复3次)，使用无核酸水来考察引物是否存在非特异扩增(重复3次)，反应温度为65℃，时间为50min，反应仪器为abi7500。选出灵敏度高且特异性好的引物，进行进一步的性能验证。

lamp引物的复筛：将初筛得到的lamp引物进行复筛，确定其检测下限及是否存在非特异扩增。使用20pg/μl的核酸考察引物在检测下时的重复性，重复20次；使用水考察引物是否存在非特异扩增，重复12次。反应条件与初筛相同。

本发明提供了一种从多种肉中检测黄牛肉、水牛肉和牦牛肉的lamp引物及检测方法，可以通过相似物种间微小的短序列差异完成准确的区分检测。本发明使用的荧光法lamp进行检测，可以实时观察结果，避免了造成污染的风险，且可以在总反应时间50min内即能检测到20pg的核酸。为国内在此领域的空白补充了有效的检测引物及方法。本发明的优点在于准确率高、特异性好、检测时间短、结果可实时观测的特点，从样品处理到报告结果只需1h的快速简便且后期可能用于现场实时检测。

本发明提供的引物组合在牛的种属鉴定和/或牛肉鉴定中的应用所涉及的原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1黄牛肉的鉴别

1、引物的制备

所用引物序列由生工公司合成。针对靶序列设计6条引物，包括两条内引物(fip和bip)和两条外引物(f3和b3)和两条环引物(lf和lb)，其核苷酸序列列于表1。

lamp检测体系的具体配置为0.3mm的外引物f3和b3各0.12μl；2.4mm的内引物fip和bip各0.96μl；1mm的环引物lf和lb各0.4μl；2×反应缓冲液10μl；1μl的样品dna，加灭菌纯化水至20μl体系。

所述lamp检测反应条件为：65℃恒温50min。

表1.环介导等温扩增技术所用引物信息

2、核酸dna模板的制备

严格无菌采集黄牛、绵羊、猪、鸡、鸭的新鲜肌肉组织50mg左右作为样品，然后采用天根动物组织基因组dna提取试剂盒(磁珠法)分别提取组织中的dna。

3.特异性试验

分别以本实验室保存的含有黄牛cytb基因的阳性质粒(阳性对照)，超纯水(阴性对照)，黄牛肉dna，绵羊肉dna，猪肉dna，鸡肉dna和鸭肉dna为模板建立lamp反应体系，进行lamp扩增检测；采用nanodrop2000c超微量分光光度计测定基因组dna浓度及纯度，并将所有样品的基因组dna稀释为20ng/ul。

上述5种样品的基因组核酸dna提取均使用天根动物组织基因组dna提取试剂盒(磁珠法)完成；含有黄牛肉cytb基因的阳性质粒为康为世纪质粒dna提取试剂盒完成。

按如下列原则判定lamp反应结果。

结果判断为阳性反应的现象为：采用实时荧光pcr仪器进行扩增，观察实时荧光曲线，反应时间为50min，观察实时荧光曲线的出峰时间。以灭菌纯化水做阴性对照试验，阴性对照试验结果应为阴性。(见图2)

1)若ct≤40，判定lamp测试结果为阳性；

2)若ct＞45，未出现1)中所述现象，判定lamp测试结果为阴性；

3)若40＜ct≤45，出现1)中所述现象，判定lamp测试结果为可疑，需要重新实验；

4)对可疑结果重新实验后，若ct≤45，出现1)中所述现象，判定lamp测试结果为阳性，否则判断为阴性。

对其他未含有样品中黄牛肉基因组在反应的50min时间内未检测出(无实时荧光曲线)，显示为阴性反应。

表2.试验用肉类及lamp检测结果

4.灵敏度及灵敏度下的重复性试验

将步骤1的阳性对照样品采用nanodrop2000c超微量分光光度计测定基因组dna浓度及纯度，并将阳性对照样品质粒dna稀释为20ng/μl，再将20ng/μl的阳性对照样品质粒dna以10^-1、10^-2、10^-3、10^-4的稀释度进行稀释，最后使用本发明的lamp测试方法对上述dna样本进行测定。

当样品中黄牛肉核酸dna的浓度为20pg/μl时(稀释度为10^-3)，反应阳性结果判读时间小于30min(实测ct值＝19.2min)(图3)。

将步骤1的阳性对照样品采用nanodrop2000c超微量分光光度计测定基因组dna浓度及纯度，并将阳性对照样品质粒dna稀释为20pg/μl(即稀释到该引物所能检测到的最低浓度)，最后使用本发明的lamp测试方法对上述dna样本进行重复性测定。重复次数为20次。(图4)

因此，本发明所采用的lamp检测方法定性试验的检测灵敏度至少可达到20pg/μl(稀释度为10^-3)。

实施例2水牛肉的鉴定

1.引物的制备

所用引物序列由生工公司合成。针对靶序列设计6条引物，包括两条内引物(fip和bip)和两条外引物(f3和b3)和两条环引物(lf和lb)，其核苷酸序列列于表3。

lamp检测体系的具体配置为0.3mm的外引物f3和b3各0.12μl；2.4mm的内引物fip和bip各0.96μl；1mm的环引物lf和lb各0.4μl；2×反应缓冲液10μl；1μl的样品dna，加灭菌纯化水至20μl体系。

所述lamp检测反应条件为：65℃恒温50min。

表3.环介导等温扩增技术所用引物信息

2.核酸dna模板的制备

严格无菌采集水牛、牦牛、黄牛、绵羊、猪、鸡、鸭的新鲜肌肉组织50mg左右作为样品，然后采用天根动物组织基因组dna提取试剂盒(磁珠法)分别提取组织中的dna。

3.特异性试验

分别以本实验室保存的含有水牛cytb基因的阳性质粒(阳性对照)，超纯水(阴性对照)，水牛肉dna，牦牛肉dna，黄牛肉dna，绵羊肉dna，猪肉dna，鸡肉dna和鸭dna为模板建立lamp反应体系，进行lamp扩增检测；采用nanodrop2000c超微量分光光度计测定基因组dna浓度及纯度，并将所有样品的基因组dna稀释为20ng/ul。

上述5种样品的基因组核酸dna提取均使用天根动物组织基因组dna提取试剂盒(磁珠法)完成；含有水牛cytb基因的阳性质粒为康为世纪质粒dna提取试剂盒完成。

按如下列原则判定lamp反应结果。

结果判断为阳性反应的现象为：采用实时荧光pcr仪器进行扩增，观察实时荧光曲线，反应时间为50min，观察实时荧光曲线的出峰时间。以灭菌纯化水做阴性对照试验，阴性对照试验结果应为阴性。(见图6)

1)若ct≤40，判定lamp测试结果为阳性；

2)若ct＞45，未出现1)中所述现象，判定lamp测试结果为阴性；

3)若40＜ct≤45，出现1)中所述现象，判定lamp测试结果为可疑，需要重新实验；

4)对可疑结果重新实验后，若ct≤45，出现1)中所述现象，判定lamp测试结果为阳性，否则判断为阴性。

对其他未含有样品中水牛肉基因组在反应的50min时间内未检测出(无实时荧光曲线)，显示为阴性反应。

表4.试验用肉类及lamp检测结果

4.灵敏度及灵敏度下的重复性试验

将步骤1的阳性对照样品采用nanodrop2000c超微量分光光度计测定基因组dna浓度及纯度，并将阳性对照样品质粒dna稀释为20ng/μl，再将20ng/μl的阳性对照样品质粒dna以10^-1、10^-2、10^-3、10^-4的稀释度进行稀释，最后使用本发明的lamp测试方法对上述dna样本进行测定。

当样品中水牛肉核酸dna的浓度为20pg/μl时(稀释度为10^-3)，反应阳性结果判读时间小于30min(实测ct值＝22.4min)(图7)。

将步骤1的阳性对照样品采用nanodrop2000c超微量分光光度计测定基因组dna浓度及纯度，并将阳性对照样品质粒dna稀释为20pg/μl(即稀释到该引物所能检测到的最低浓度)，最后使用本发明的lamp测试方法对上述dna样本进行重复性测定。重复次数为20次。(图8)

因此，本发明所采用的lamp检测方法定性试验的检测灵敏度至少可达到20pg/μl(稀释度为10^-3)。

实施例3牦牛肉的鉴定

1.引物的制备

所用引物序列由生工公司合成。针对靶序列设计6条引物，包括两条内引物(fip和bip)和两条外引物(f3和b3)和两条环引物(lf和lb)，其核苷酸序列列于表5。

lamp检测体系的具体配置为0.3mm的外引物f3和b3各0.12μl；2.4mm的内引物fip和bip各0.96μl；1mm的环引物lf和lb各0.4μl；2×反应缓冲液10μl；1μl的样品dna，加灭菌纯化水至20μl体系。

所述lamp检测反应条件为：65℃恒温50min。

表5.环介导等温扩增技术所用引物信息

2.核酸dna模板的制备

严格无菌采集牦牛、水牛、黄牛、绵羊、猪、鸡、鸭的新鲜肌肉组织50mg左右作为样品，然后采用天根动物组织基因组dna提取试剂盒(磁珠法)分别提取组织中的dna。3.特异性试验

分别以本实验室保存的含有牦牛肉cytb基因的阳性质粒(阳性对照)，超纯水(阴性对照)，牦牛肉dna，水牛肉dna，黄牛肉dna，绵羊肉dna，猪肉dna，鸡肉dna和鸭dna为模板建立lamp反应体系，进行lamp扩增检测；采用nanodrop2000c超微量分光光度计测定基因组dna浓度及纯度，并将所有样品的基因组dna稀释为20ng/ul。

上述5种样品的基因组核酸dna提取均使用天根动物组织基因组dna提取试剂盒(磁珠法)完成；含有牦牛cytb基因的阳性质粒为康为世纪质粒dna提取试剂盒完成。

按如下列原则判定lamp反应结果。

结果判断为阳性反应的现象为：采用实时荧光pcr仪器进行扩增，观察实时荧光曲线，反应时间为50min，观察实时荧光曲线的出峰时间。以灭菌纯化水做阴性对照试验，阴性对照试验结果应为阴性。(见图10)

1)若ct≤40，判定lamp测试结果为阳性；

2)若ct＞45，未出现1)中所述现象，判定lamp测试结果为阴性；

3)若40＜ct≤45，出现1)中所述现象，判定lamp测试结果为可疑，需要重新实验；

4)对可疑结果重新实验后，若ct≤45，出现1)中所述现象，判定lamp测试结果为阳性，否则判断为阴性。

对其他未含有样品中牦牛肉基因组在反应的50min时间内未检测出(无实时荧光曲线)，显示为阴性反应。

表6.试验用肉类及lamp检测结果

4.灵敏度及灵敏度下的重复性试验

将步骤1的阳性对照样品采用nanodrop2000c超微量分光光度计测定基因组dna浓度及纯度，并将阳性对照样品质粒dna稀释为20ng/μl，再将20ng/μl的阳性对照样品质粒dna以10^-1、10^-2、10^-3、10^-4的稀释度进行稀释，最后使用本发明的lamp测试方法对上述dna样本进行测定。

当样品中牦牛肉核酸dna的浓度为20pg/μl时(稀释度为10^-3)，反应阳性结果判读时间小于30min(实测ct值＝16.2min)(图11)。

将步骤1的阳性对照样品采用nanodrop2000c超微量分光光度计测定基因组dna浓度及纯度，并将阳性对照样品质粒dna稀释为20pg/μl(即稀释到该引物所能检测到的最低浓度)，最后使用本发明的lamp测试方法对上述dna样本进行重复性测定。重复次数为20次。(图12)

因此，本发明所采用的lamp检测方法定性试验的检测灵敏度至少可达到20pg/μl(稀释度为10^-3)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>博奥生物集团有限公司

<120>引物组合在牛的种属鉴定和/或牛肉鉴定中的应用

<130>mp1832067

<160>21

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cctaattcttgctctaatcc20

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

agatgctagttgtccgat18

<210>3

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggctcaggaataggcattggcccctactacacacctccaaac42

<210>4

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gccctagtagcagacctactgacacggtgatatatgggtgttcgac46

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gtggtcggaatattatgcttcg22

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cacatgaattggaggacaacc21

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gcaaacccactcaacaca18

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

tgataatatatgggtgttcgac22

<210>9

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

catgagaatgaggattaggatggagctccccacatcaagcct42

<210>10

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

tatgatgttccggccattcagcgctgtcctccaatccatg40

<210>11

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

gttaggaattgatcgtaagattgc24

<210>12

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

gcctattctgaatcctagtagcaaac26

<210>13

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

ggctccaacaatccaa16

<210>14

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

cgtaaaattgcgtatgca18

<210>15

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

cagaagtattagggctagaattagtgaatctcctcagacgcag43

<210>16

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

tctggtactattcacacccgactcattcgggtttgatgtg40

<210>17

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

ggctcctaagatgtctttaatg22

<210>18

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

tacaccccagcaaatcca18

<210>19

<211>250

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>unsure

<222>(57)..(57)

<223>y=c/t

<220>

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<220>

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