本发明涉及一种生物拆分法，具体涉及(r)-1-(1-萘基)乙胺的化学酶法制备方法。
背景技术：
(r)-1-(1-萘基)乙胺是制备重要的手性切块，目前拆分制备(r)-1-(1-萘基)乙胺的方法主要包括化学法和酶法：
化学拆分法：以l-天冬氨酸(cn101407465a)、手性萘普生(如国际专利文献wo2008058235a2)、手性酒石酸(如国际专利文献wo2004110976a2、中国专利文献cn101735070a、中国专利文献cn103420845a)等手性拆分剂与1-(1-萘基)乙胺消旋体成盐，利用不同手性1-(1-萘基)乙胺盐在溶剂中的溶解度不同，通过结晶将(s)-1-(1-萘基)乙胺和(r)-1-(1-萘基)乙胺分离。该过程流程比较长，且理论收率最大只有50％。
酶法拆分法：由于化学拆分剂的缺点，人们选择了酶作为拆分剂。酶法拆分的优点在于：条件温和，底物识别性好，产品纯度高。但是酶法拆分最高拆分理论收率是50％。为了提高收率，在酶法拆分的基础上结合消旋工艺，实现了1-(1-萘基)乙胺动态动力学拆分。
如以下反应式所示，(r)-1-(1-萘基)乙胺在脂肪酶作用下酯化，同时(s)-1-(1-萘基)乙胺在钯催化剂作用下加氢消旋，拆分和消旋在一个步骤中进行。(r)-1-(1-萘基)乙胺酯化物水解萃取后得到(r)-1-(1-萘基)乙胺。
该工艺路线较短，但是钯催化剂容易脱落，重复利用性差；同时金属钯与酶直接接触，酶易于失活。因此，提高钯催化剂利用率以及提高酶催化速率是该工艺路线需要解决的最大问题。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种动态动力学法化学酶法拆分1-(1-萘基)乙胺，获得(r)-1-(1-萘基)乙胺酯化物，接着在碱性条件下水解得到(r)-1-(1-萘基)乙胺。主要解决目前钯催化剂易于脱落，酶法反应速度慢等问题，提高钯催化剂重复使用率以及南极假丝酵母脂肪酶b拆分的反应速率。
实现本发明采用的技术方案为：
本发明一种酶法拆分制备(r)-1-(1-萘基)乙胺的方法，该方法为包括以下步骤：
(1)固定化calb制备：配置南极假丝酵母脂肪酶b酶液，以下简称calb，往酶液中加入环氧树脂，在25℃下搅拌3h后，将环氧树脂从酶液中分离，并用ph＝7.0缓冲液洗涤，真空干燥，得到固定化calb，酶蛋白所占固定化酶的重量百分比为1.0-3.0％；
(2)反应体系a：在甲苯溶剂中，加入步骤(1)制得的固定化calb、1-(1-萘基)乙胺消旋体、乙氧基乙酸乙酯，在40-70℃的温度下恒温反应9-15h，反应结束后固液分离，固定化calb留在反应体系a中，液相从反应系统a中移出，得的液体备用；
(3)反应体系b：将步骤(2)得到的液体进入反应体系b中，加入固定化纳米钯、h2压力0.01-0.04mpa，在60-100℃的温度下恒温反应6-10h，反应结束后进行固液分离，液相再进入反应体系a中反应，反应结束后进行固液分离，所得液相再进入反应体系b中，如此循环1-10次，得循环反应后的液相；
(4)柱分离：将步骤(3)所得的循环反应后的液相以石油醚和异丙醇(1∶1)为流动相，柱层析分离油状物，得到(r)-1-(1-萘基)乙胺乙酯；
(5)萃取：将步骤(4)所得的(r)-1-(1-萘基)乙胺乙酯用稀盐酸溶液水解，再用甲苯萃取，静置分层，水层用氨水调节ph值>10后用二氯甲烷萃取，将甲苯层和二氯甲烷层合并后减压蒸馏，得到(r)-1-(1-萘基)乙胺。
优选的本发明所述的方法包括以下步骤：
(1)固定化calb制备：配置20ml浓度为1.0mg/ml南极假丝酵母脂肪酶b酶液，以下简称calb，往酶液中加入环氧树脂150mg，在25℃下搅拌3h后，将环氧树脂从酶液中分离，并用ph＝7.0缓冲液洗涤，真空干燥，得到固定化calb，酶蛋白所占固定化酶的重量百分比为3.0％；
(2)反应体系a：在5ml的甲苯溶剂中，加入步骤(1)制得的250mg固定化calb、2565mg的1-(1-萘基)乙胺消旋体、264mg的乙氧基乙酸乙酯，在60℃的温度下恒温反应9h，反应结束后固液分离，固定化calb留在反应体系a中，液相从反应系统a中移出，得的液体备用；
(3)反应体系b：将步骤(2)得到的液体进入反应体系b中，加入固定化纳米钯、h2压力0.02mpa，在90℃的温度下恒温反应6h，反应结束后进行固液分离，液相再进入反应体系a中反应，反应结束后进行固液分离，所得液相再进入反应体系b中，如此循环反应5次，得循环反应后的液相；
(4)柱分离：将步骤(3)所得的循环反应后的液相以石油醚和异丙醇(1∶1)为流动相，柱层析分离油状物，得到(r)-1-(1-萘基)乙胺乙酯；
(5)萃取：将步骤(4)所得的(r)-1-(1-萘基)乙胺乙酯用20ml浓度为5wt％的稀盐酸溶液水解，再用甲苯萃取2次，每次20ml，静置分层，水层用氨水调节ph值>10后用二氯甲烷萃取2次，每次20ml，将甲苯层和二氯甲烷层合并后减压蒸馏，得到(r)-1-(1-萘基)乙胺。
优选的本发明所述的环氧树脂为eupergitc250l,sepabeadsep，sepabeadshfa中的一种。
优选的本发明所述固定化纳米钯的粒径为2-50nm，载体为cao，mgo，水滑石，复合氧化物，固体超强碱中的一种。
优选的本发明所述复合氧化物为(mg(al)o)，所述固体超强碱为kco3/al2o3、koh/al2o3、k2o/al2o3中的一种。
优选的本发明反应体系a的反应温度为50℃。反应体系b的反应温度为90℃
本发明所述的反应式如下：
反应体系a：
反应体系b：
水解反应：
上述工艺中，固定化脂肪酶所用环氧树脂为eupergitc250l,sepabeadsep，sepabeadshfa中一种，以eupergitc250l为最佳；固定化酶蛋白含量为1.0-3.0％，以3.0％为最佳.
本发明效益为：本发明所述固定化南极假丝酵母脂肪酶b(calb)制备简单，有较好的耐高温性能。固定化钯操作稳定性好，重复利用性高。用固定化calb和固定化纳米钯动态动力学拆分制备(r)-1-(1-萘基)乙胺工艺简单，拆分效果优良。手性e.e.值可达99％以上，收率达92％以上，时间仅为22小时。
具体实施方式
实施例1
(实例1)
本实施例的化学酶法动态动力学拆分制备(r)-1-(1-萘基)乙胺的方法具有以下步骤：
(1)固定化calb制备：配置20ml浓度为1.0mg/ml南极假丝酵母脂肪酶b酶液，以下简称calb，往酶液中加入环氧树脂150mg，在25℃下搅拌3h后，将环氧树脂从酶液中分离，并用ph＝7.0缓冲液洗涤，真空干燥，得到固定化calb，酶蛋白所占固定化酶的重量百分比为3.0％；
(2)反应体系a：在5ml的甲苯溶剂中，加入步骤(1)制得的250mg固定化calb、2565mg的1-(1-萘基)乙胺消旋体、264mg的乙氧基乙酸乙酯，在50℃的温度下恒温反应9h，反应结束后固液分离，固定化calb留在反应体系a中，液相从反应系统a中移出，得的液体备用；
(3)反应体系b：将步骤(2)得到的液体进入反应体系b中，加入固定化纳米钯(载体kco3/al2o3,粒径1.56nm，钯含量4.7％)40mg、h2压力0.02mpa，在70℃的温度下恒温反应6h，反应结束后进行固液分离，液相再进入反应体系a中反应，反应结束后进行固液分离，所得液相再进入反应体系b中，如此循环反应5次，得循环反应后的液相；
(4)柱分离：将步骤(3)所得的循环反应后的液相以石油醚和异丙醇(1∶1)为流动相，柱层析分离油状物，得到(r)-1-(1-萘基)乙胺乙酯，收率为87％，e.e.值(对映体过量值)为99.2％。；
(5)萃取：将步骤(4)所得的(r)-1-(1-萘基)乙胺乙酯用20ml浓度为5wt％的稀盐酸溶液水解，再用甲苯萃取2次，每次20ml，静置分层，水层用氨水调节ph值>10后用二氯甲烷萃取2次，每次20ml，，将甲苯层和二氯甲烷层合并后减压蒸馏，得到2155mg的(r)-1-(1-萘基)乙胺，收率为84％，e.e.值为99.1％。
(实例2～实例5)
各实例的方法与实例1基本相同，不同之处见表1。
表1
由表1可以看出，在其它条件相同的情况下，采用载体kco3/al2o3固定的纳米钯作为消旋催化剂最好。
(实施例8～实施例14)
各实施例与实施例1基本相同(即采用实施例1的固定化纳米钯)，不同之处见表2。
表2
由表2可以看出，在采用相同的固定化酶的情况下，实施例12(在90℃的消旋温度下以及氢气压力为0.02mpa)化学酶拆分效果最好。
下面对照实验采用实施例12。
(对比例)
该对比例与实施例12基本相同，不同之处见表3。
表3
由表3可以看出，实施例12中消旋催化剂活力明显高于pb/c，具有良好的操作稳定性。eupergitc固定化酶对底物的选择性要优于商业酶novozym435，e.e.值大于99％，同时其也具有良好的操作稳定性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围内。