一种抗抑郁降血脂红曲粉及其制备方法与流程

本发明涉及微生物制药领域，尤其涉及一种抗抑郁降血脂红曲粉及其制备方法。

背景技术：

红曲又名红曲米、红米、赤曲或福米，呈棕红色至暗红色，它以籼稻、粳稻和糯米等为原料，用红曲菌发酵而成(参见陈发贵,张丹,刘敏,熊燕,张森林,赵辉.高效液相色谱法测定青稞红曲中内酯式和酸式洛伐他汀的含量.中国酿造,2016,(10):162-5和黄艳,李从发,姚广龙,刘四新.红曲及其安全性研究进展.食品研究与开发,2006,(08):217-21.)。红曲中的主要功能成分有红曲色素(参见苏东晓,张瑞芬,张名位,李利,陈莎.红曲色素生物活性研究进展.河南工业大学学报(自然科学版),2017,(02):129-35.)、洛伐他汀(lovastatin，即monacolink或mevinolin)(参见zhangj,wangyl,lulp,zhangbb,xugr.enhancedproductionofmonacolinkbyadditionofprecursorsandsurfactantsinsubmergedfermentationofmonascuspurpureus9901.biotechnologyandappliedbiochemistry,2014,61(2):202-7.)、酶类活性物质(参见chengm-j,wum-d,cheni-s,tsengm,yuang-f.chemicalconstituentsfromthefungusmonascuspurpureusandtheirantifungalactivity.phytochemistryletters,2011,4(3):372-6.)和γ－氨基丁酸(gaba)等(参见lix-m,shenx-h,duanz-w,guos-r.advancesonthepharmacologicaleffectsofredyeastrice.chinesejournalofnaturalmedicines,2011,9(3):161-6.)，其中洛伐他汀是人体胆固醇合成途径中限速酶——3-羟基-3-甲基戊二酰辅a(hmg-coa)还原酶的抑制剂，具有减少或阻断体内胆固醇合成的作用，因此具有降血压和降血脂的功效(参见nakamurat,komagatad,murakawas,sakaik,endoa.isolationandbiosynthesisof3α-hydroxy-3,5-dihydromonacolinl.thejournalofantibiotics,1990,43(12):1597-600和文镜,常平,顾晓玲,金宗滚.红曲及洛伐他汀的生理活性和测定方法研究进展.中国食品添加剂,2001,112-9以及endo.a.monacolink,anewhypocholesterolemicagentproducedbyamonascusspecies.thejournalofantibiotics1979,32(8):852-4.)。另一活性成分γ－氨基丁酸是哺乳动物中枢神经系统内的主要抑制性神经递质(参见lih,qiut,huangg,caoy.productionofgamma-aminobutyricacidbylactobacillusbrevisncl912usingfed-batchfermentation.microbialcellfactories,2010,9:85.和lik,xue.theroleandthemechanismofγ-aminobutyricacidduringcentralnervoussystemdevelopment.neurosciencebulletin,2008,24(3):195-200.)，具有降压、镇静、利尿作用等作用，并能预防糖尿病(参见lih,qiut,gaod,caoy.mediumoptimizationforproductionofgamma-aminobutyricacidbylactobacillusbrevisncl912.aminoacids,2010,38(5):1439-45.)^[12]。亦有研究表明，gaba在治疗抑郁症患者中发挥着重要作用(参见mannjj,oquendoma,watsonkt,boldrinim,malonekm,ellissp,sullivang,coopertb,xies,currierd.anxietyinmajordepressionandcerebrospinalfluidfreegamma-aminobutyricacid.depressionandanxiety,2014,31(10):814-21.和pehrsonal,sanchezc.alteredgamma-aminobutyricacidneurotransmissioninmajordepressivedisorder:acriticalreviewofthesupportingevidenceandtheinfluenceofserotonergicantidepressants.drugdesign,developmentandtherapy,2015,9603-24.以及bhagwagarz,wylezinskam,taylorm,jezzardp,matthewspm,cowenpj.increasedbraingabaconcentrationsfollowingacuteadministrationofaselectiveserotoninreuptakeinhibitor.theamericanjournalofpsychiatry,2004,161(2):368-70.)。因而富含洛伐他汀和gaba的红曲粉可以兼具抗抑郁和降血脂的双重功效。

经过近年来的研究，红曲粉中的洛伐他汀和gaba含量已有较大的提升，目前可分别达0.59％(w/w)(参见jirasatids,nopharatanam,kitsubunp,vichitsoonthonkult,tongtaa.statisticaloptimizationformonacolinkandyellowpigmentproductionandcitrininreductionbymonascuspurpureusinsolid-statefermentation.journalofmicrobiologyandbiotechnology,2013,23(3):364-74.)和0.5％(w/w)(参见wangjj,leecl,pantm.improvementofmonacolink,gamma-aminobutyricacidandcitrininproductionratioasafunctionofenvironmentalconditionsofmonascuspurpureusntu601.journalofindustrialmicrobiology&biotechnology,2003,30(11):669-76.)。

另外，2011年12月06日出版的《中国食品添加剂》发表了一篇《红曲霉与乳酸菌混合发酵产γ－氨基丁酸工艺研究》的论文，其利用红曲霉(monascus)和乳酸菌(lacticacidbacteria)混合发酵生产gaba具有非常明显优越性和良好的开发前景。红曲霉sm048在与植物性乳酸杆菌lac.1同时接种后，其生长速度受到一定程度的抑制，适合采用分段培养的方式进行混合发酵。在ph4～4.5，30℃条件下，分段发酵gaba产量为0.52g/l，比sm048和lac.1单独发酵分别提高了147.62％和62.5％。

但将两种功能性成分的含量同时提升的发酵方法尚未见报道，且目前市面上的单一菌株生产的红曲粉的口感不佳。

技术实现要素：

为了有效的同时提升两种功能性成分含量并改善红曲粉的适口性，本发明目的之一提供了一种抗抑郁降血脂红曲粉。

本发明目的之二提供了一种利用红曲菌和乳酸菌通过发酵-全细胞催化混合培养生产的抗抑郁降血脂红曲粉方法，该方法通过将前期筛选得到的洛伐他汀高产红曲菌株与产gaba的乳酸菌株进行混合培养，生产出了洛伐他汀和gaba含量同步提升的功能性红曲粉，红曲粉中洛伐他汀含量达到0.22％(w/w)，gaba含量高达2.99％(w/w)。此外，乳酸菌的添加除提升了红曲粉中的gaba含量外，还为红曲粉提供了多种其它有益成分，并改善了红曲粉的口感。

作为本发明第一方面的一种抗抑郁降血脂红曲粉，其中所含降血脂活性成分洛伐他汀和抗抑郁活性成分gaba的含量分别为0.22％(w/w)和2.99％(w/w)。

作为本发明第二方面的一种利用红曲菌和乳酸菌通过发酵-全细胞催化混合培养生产的权利要求1所述的抗抑郁降血脂红曲粉的方法，其特征是将斜面活化后的红曲菌(monascusanka)mon20-2接至种子培养基中进行培养，培养后接种于发酵培养基培养得到红曲菌发酵液；将活化的乳酸菌添加至红曲菌发酵液中进行全细胞催化得到所述的抗抑郁降血脂红曲粉；

所述红曲菌(monascusanka)mon20-2，由亲株红曲菌30192(购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株号accc30192)，经“神州八号”航天飞船搭载，进行太空诱变后筛选获得，已于2015年6月4日在中国典型培养物保藏中心(中国，武汉)保藏，保藏号cctccm2015356。

在本发明的一个优选实施例中，所述将活化的乳酸菌添加至红曲菌发酵液中进行转化得到所述的抗抑郁降血脂红曲粉中，红曲菌与乳酸菌的干重比为3～1:1～3。

在本发明的一个优选实施例中，所述乳酸菌为嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)l5、保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus)l41、保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus)l48、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhanosus)ld、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)7469、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)l22、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)l20、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)l57、罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)l33、罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)l21、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)8014、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)l69、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)l24、干酪乳酸菌(lactobacilluscasei)l54、干酪乳酸菌(lactobacilluscasei)lc、干酪乳酸菌(lactobacilluscasei)l49、长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)b28中的一种。

在本发明的一个优选实施例中，所述将活化的乳酸菌添加至红曲菌发酵液中进行转化得到所述的抗抑郁降血脂红曲粉的转化温度为25℃～41℃。

在本发明的一个优选实施例中，所述将活化的乳酸菌添加至红曲菌发酵液中进行转化得到所述的抗抑郁降血脂红曲粉的转化体系中的离子浓度0.01g/l～0.09g/l。

在本发明的一个优选实施例中，所述离子浓度为锌离子浓度。

在本发明的一个优选实施例中，所述将活化的乳酸菌添加至红曲菌发酵液中进行转化得到所述的抗抑郁降血脂红曲粉的ph值为3.5～7.5。

本发明通过引入特定培养条件下的乳酸菌菌株与红曲菌mon20-2相结合来制备洛伐他汀和gaba含量同步提升的功能性红曲粉，其洛伐他汀和gaba的含量得到了同步提升，所得红曲粉含有乳酸菌的芳香气味，去除了单纯红曲菌发酵所产红曲粉的苦味，更适宜服用。

附图说明

图1a为初筛试验各菌株的l-谷氨酸转化率比较示意图。

图1b为复筛试验各菌株的gaba产量比较示意图。

图2为乳酸菌8014在不同转化温度下的谷氨酸转化率比较示意图。

图3a为乳酸菌8014在添加不同离子条件下的l-谷氨酸的转化率比较示意图。

图3b为乳酸菌8014在不同锌离子浓度下l-谷氨酸的转化率比较示意图。

图4为乳酸菌8014在不同ph转化体系中的谷氨酸转化率和gaba产量比较示意图。

图5不同红曲菌与乳酸菌比例下monacolink和gaba的产量比较示意图。

具体实施方式

材料与方法

1.菌种：

1.1红曲菌：monascusankamon20-2，由亲株红曲菌30192(购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株号accc30192)，经“神州八号”航天飞船搭载，进行太空诱变后筛选获得，已于2015年6月4日在中国典型培养物保藏中心(中国，武汉)保藏，保藏号cctccm2015356。

1.2乳酸菌株：嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)l5；保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus)l41，l48；鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)ld，7469，l22，l20，l57；罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)l33，l21；植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)8014，l69，l24；干酪乳酸菌(lactobacilluscasei)l54，lc，l49；长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)b28。均为本实验室筛选保存。其中嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)l5分离自中国工业微生物菌种保藏管理中心菌株cicc6074；鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)ld、l20、l22、l57分别来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心菌株cicc20255、20257、20258、20259；罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)l21、l33分别来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心菌株cicc6118、6120；植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)l24、l69分别来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心菌株cicc20265、20267；干酪乳酸菌(lactobacilluscasei)lc、l49、l54分别来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心菌株cicc20280、20282、20284；长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)b28来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心菌株cicc6194；保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus)l41、l48分离自美国典型培养物保藏中心菌株atcc8001、7517；鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)7469购自美国典型培养物保藏中心(菌株编号atcc7469)；植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)8014购自美国典型培养物保藏中心(菌株编号atcc8014)。

1.3培养基

1.3.1乳酸菌培养基(mrs)：葡萄糖20.0g，牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，乙酸钠5.0g，酵母粉5.0g，柠檬酸二铵2.0g，磷酸氢二钠2.0g，吐温801.0g，七水硫酸镁0.1g，五水硫酸锰0.05g，溶解于1000ml蒸馏水，于121℃灭菌20分钟，葡萄糖须单独灭菌。

1.3.2红曲菌培养基：

①种子培养基：0.3％麦芽浸膏，溶于蒸馏水，121℃灭菌。

②发酵培养基：7％大米粉，1.5％氯化铵，0.15％磷酸氢二钾，0.05％七水硫酸镁，ph自然。

1.4产gaba乳酸菌的筛选

将-80℃保存的乳酸菌菌株分别划线接种于平板培养基，37℃培养2d，转接于摇管中，在37℃，250r/min摇床中培养12h，测其od600值，离心收菌。将活化的乳酸菌接种于5ml转化体系中至终菌浓度为od600＝5.0，转化体系包括l-谷氨酸6.25g/l，磷酸吡哆醛(plp)0.1mm，cacl250mm,mgso450mm，乙酸缓冲液(ph4.8)。转化12h后，使用sba-40e型生物传感分析仪测定转化体系中l-谷氨酸剩余浓度，计算各菌株的l-谷氨酸转化率(rglu)。

将初筛获得的菌株接种至mrs液体培养基中，37℃培养12h，以1％接种量接种于含有1g/l的l-谷氨酸的mrs液体培养基中，37℃培养24h。发酵液于4℃、12000r/min离心15min收集上清液，0.45μm滤膜过滤后，高效液相色谱法(hplc)检测γ-氨基丁酸及glu的含量。

1.5温度对乳酸菌转化gaba的影响

将过夜培养的植物乳杆菌8014以1％接种量接种于含有1g/l的l-谷氨酸的mrs液体培养基中，分别置于25℃、29℃、33℃、37℃、41℃，250r/min的摇床中培养，共五组每组设立2个平行，在培养24h后，测其od600值与体系中glu的浓度。

1.6离子对乳酸菌转化gaba的影响

(1)配制10g/l的氯化钙，硫酸锌，氯化铁，氯化亚铁，氯化钴，硫酸镁，磷酸二氢钾，硫酸铜溶液，按0.5％加入mrs培养基中，按方法1.4所述在33℃培养24h后检测od600值与glu浓度。

(2)分别配制含有0.01g/l、0.03g/l、0.05g/l、0.07g/l、0.09g/l的硫酸锌溶液的mrs培养基，按方法1.4所述条件检测不同锌离子浓度对植物乳杆菌8014转化合成gaba的影响。

1.7ph对乳酸菌转化gaba的影响

将植物乳杆菌8014种子液按5％接种量接种于装有1lmrs培养基(含0.05g/l硫酸锌)的3l发酵罐中，分别用氢氧化钠或盐酸调节ph至3.5、4.5、5.5、6.5和7.5。当菌液od600达到1.0时，向各罐中加入谷氨酸钠至终浓度1.15g/l(相对于l-谷氨酸1g/l)。培养24h后，测定od600值、发酵液中glu和gaba的浓度。

1.8混合菌种发酵生成功能性红曲

将斜面活化后的红曲菌mon20-2接至种子培养基中，28℃，200r/min摇床上培养48h后接种于装有40ml发酵培养基的100ml医用盐水瓶中，在28℃，200r/min摇床上培养7d。将培养12h的乳酸菌8014在4℃，4000g离心5min，用ph7.5的磷酸盐缓冲液重悬，按红曲菌：乳酸菌(干重比)3:1、2:1、1:1、1:2和1:3分别添加至红曲菌发酵液中，并加入l-谷氨酸溶液至终浓度1g/l,于33℃，200r/min摇床中进行混菌发酵培养，并每20h补加l-谷氨酸至1g/l，每组做2个平行。

1.9检测方法

(1)菌种干重的测定：取在方法1.8所述条件下培养7d的红曲菌液和培养12h的乳酸菌液，在4℃，12000rpm离心5min，弃上清后，于60℃烘干至恒重，称重。

(2)l-谷氨酸和gaba的测定采用异硫氰酸苯酯(pitc)柱前衍生法测定，具体操作参照roger(参见rogerskl,philibertra,allenaj,molitorj,wilsonej,duttongr.hplcanalysisofputativeaminoacidneurotransmittersreleasedfromprimarycerebellarcultures.journalofneurosciencemethods,1987,22(2):173-9.)。洛伐他汀和桔霉素的测定依照国家标准qb/t2847-2007(参见中华人民共和国国家发展和改革委员会.qb/t2847-2007功能性红曲米(粉)[s].北京；中国轻工业出版社.2007.)。hplc检测使用thermou-3000hplc系统，配备dad检测器(dad-3000)，自动进样器(wps-3000sl)和荧光检测器(fld-3400rs)。

1.10数据分析

实验数据使用spssv20(ibm公司)进行分析，各试验条件数据均采用单因素方差分析(anova)及tukeyposthoc检验。图表制作使用originpro8.1。

2.结果与讨论

2.1产gaba乳酸菌的筛选

对17株乳酸菌的谷氨酸转化率(rglu)进行检测，结果如图1a所示。各菌株的12hl-谷氨酸转化率存在显著差异(p<0.001,α＝0.05)，通过对各菌株转化率进行聚类分析(k-meansclusteranalysis)，结果表明菌株8014、l48、lc、l57、l5的谷氨酸转化率高于其它菌株，因此选取上述5株菌通过添加前体l-谷氨酸发酵法进行复筛。复筛结果如图1b所示，各菌株的gaba产量存在显著差异(p<0.001,α＝0.05)，其中植物乳杆菌8014的gaba产量显著高于其它4株菌，在含有1g/l的l-谷氨酸的mrs液体培养基中37℃培养24h后，发酵液中gaba含量达到0.16g/l。

2.2温度对谷氨酸转化的影响

结果如图2所示，植物乳杆菌8014在33℃时谷氨酸的转化率最高，且不同温度下菌株的谷氨酸转化率有显著差异(p＝0.01，α＝0.05)，说明菌株8014的最适l-谷氨酸转化温度为33℃。这一温度不仅随菌株不同而发生变化，如植物乳杆菌taj-apis362最适转化温度为36℃(参见tajabadin,baradarana,ebrahimpoura,rahimra,bakarfa,manapmy,mohammedas,saarin.overexpressionandoptimizationofglutamatedecarboxylaseinlactobacillusplantarumtaj-apis362forhighgamma-aminobutyricacidproduction.microbialbiotechnology,2015,8(4):623-32.)，而短乳杆菌(l.brevis)tccc13007的最适转化温度为30℃(参见zhangy,songl,gaoq,yusm,lil,gaonf.thetwo-stepbiotransformationofmonosodiumglutamatetogababylactobacillusbrevisgrowingandrestingcells.appliedmicrobiologyandbiotechnology,2012,94(6):1619-27.)；还与转化体系的组成有关，如同一菌株短乳杆菌(l.brevis)tccc13007在改变转化体系中的缓冲液组成和底物l-谷氨酸浓度后，其最适转化温度改变为45℃(参见shix,changc,mas,chengy,zhangj,gaoq.efficientbioconversionofl-glutamatetogamma-aminobutyricacidbylactobacillusbrevisrestingcells.journalofindustrialmicrobiology&biotechnology,2017,44(4-5):697-704.)。

2.3离子对谷氨酸转化的影响

通过检测在转化体系中添加不同离子对植物乳杆菌8014转化l-谷氨酸能力的影响，结果如图3a所示。不同离子的添加显著影响了植物乳杆菌8014的l-谷氨酸转化能力(p<0.001，α＝0.05)，并对菌株的生长产生了影响，特别是在单独添加mg²⁺条件下，菌体量显著减少(p<0.001，α＝0.05)。为避免菌体量的变化对菌株l-谷氨酸转化率的影响，试验测定了单位od600菌体的l-谷氨酸转化率(rglu/od)，结果表明其中zn²⁺的添加显著增强了l-谷氨酸的转化能力。通过对zn²⁺的浓度进行优化，结果表明(图3b)，在添加0.05g/l硫酸锌的条件下，植物乳杆菌8014的l-谷氨酸转化率最高。

2.4ph对乳酸菌转化gaba的影响

试验利用发酵罐实时调控转化体系ph的方式检测了不同ph条件下植物乳杆菌8014的l-谷氨酸转化能力和gaba产量，结果如图4所示。在含有1g/ll-谷氨酸的mrs培养基中培养24h后，各ph条件下l-谷氨酸转化率均在80％以上，在ph7.5的体系中，l-谷氨酸转化显著高于其它ph(p＝0.027，α＝0.05)，gaba产量达到0.71g/l，l-谷氨酸转化率达100％。

2.5混合菌种发酵生成功能性红曲

为实现洛伐他汀和gaba的同步提升，试验研究了不同比例的红曲菌和乳酸菌通过两阶段法混菌发酵的洛伐他汀和gaba产量，结果如图5所示。不同红曲菌：乳酸菌(干重比)条件下，洛伐他汀和gaba的产量均存在显著差异(p<0.027，α＝0.05)，其中当红曲菌mon20-2和植物乳杆菌8014为2:1(干重比)时，两种功能性成分的产量均达到最高值，分别为0.22％(w/w)和2.99％(w/w)。表明本研究所得混菌发酵工艺可实现洛伐他汀和gaba的同步提升，所得红曲粉含有乳酸菌的芳香气味，去除了单纯红曲菌发酵所产红曲粉的苦味，更适宜服用。

3.结论

本发明开发了一种利用红曲菌和乳酸菌通过发酵-全细胞催化混合培养生产抗抑郁降血脂红曲粉的生产工艺。为提升抗抑郁功能性成分gaba的含量，试验首先筛选得到一株产gaba菌株植物乳杆菌8014，对其转化l-谷氨酸的最适温度、离子、ph等进行了研究，结果表明在33℃，添加0.05g/l硫酸锌和ph7.5的mrs培养体系中，l-谷氨酸转化率可达100％。而后将植物乳杆菌8014和红曲菌mon20-2按不同比例进行发酵-全细胞催化混合培养，结果表明当红曲菌mon20-2和植物乳杆菌8014为2:1(干重比)时，发酵所得红曲粉中降血脂活性成分洛伐他汀和抗抑郁活性成分gaba的含量均达到最高值，分别为0.22％(w/w)和2.99％(w/w)。表明本研究所得发酵-全细胞催化混合培养工艺可实现洛伐他汀和gaba的同步提升，所得红曲粉含有乳酸菌的芳香气味，去除了单纯红曲菌发酵所产红曲粉的苦味，更适宜服用。