本发明涉及一种发酵生产银耳多糖所需的发酵培养基，还涉及使用该发酵培养基低成本、高产量发酵生产银耳多糖的方法，属于微生物发酵培养技术领域。
背景技术：
银耳多糖具有补水保湿、抗氧化、抗血栓、抗肝炎、抗突变、抗肿瘤、提高免疫力、降血脂血糖等功效，被广泛应用于美容、医药、保健食品等领域。目前，银耳多糖主要由子实体提取和分生孢子发酵两种方法制备而成。其中，发酵法制备工艺简单、成本低、产量高，且多糖纯度高，具有很好的开发前景。
为获得更高产量的目标产物，一般都会进行发酵培养基、培养条件的优化，而发酵培养基的成本又直接对发酵产品的工业化生产产生重大影响。氮源是发酵培养基中的一种重要物质，来满足各种微生物生长的需求，蛋白胨和酵母粉为常用的有机氮源，其营养物质丰富，更利于菌体生长和发酵产物生成，但相比于无机氮源，其价格较贵，因此，寻找一种低成本发酵培养基具有重要意义。
专利cn201710986467.1中公开的发酵培养基的配方为（g/l）：土豆淀粉10，葡萄糖20，胰蛋白胨10、酵母提取物5、硫酸镁0.2、磷酸氢二钾0.5、氢氧化钠1，ph为6.5。此配方氮源用量较大，总量为15g/l。专利cn201810421116.0中公开的发酵培养基的制备方法为：称取麸皮100～200g，加500ml水，煮沸15～20min，过滤得到滤液，加入蛋白胨5～7g，葡萄糖10～15g，可溶性淀粉5～10g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁2g，植物浸提液100～500ml，以水补足1l，ph值为5.5～6.0。此配方制备复杂，不利于工业化生产，且蛋白胨用量较高，银耳多糖产量提高67.75%～99.81%。专利cn201210004097.4中公开的发酵培养基配方（g/l）为：葡萄糖30，蛋白胨8，硫酸镁2.5，ynb（无氨基酵母氮源）2，磷酸二氢钾0.5，ph值6.0，5l罐发酵最终银耳多糖产量9.5g/l，该专利银耳多糖产量较高，但蛋白胨用量较大，成本较高。专利cn200910019462.7中公开的发酵培养基配方（g/l）为：葡萄糖20，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾0.46，磷酸氢二钾1，摇瓶发酵4.5天后，银耳多糖产量5.8g/l，银耳多糖产量较低。文献《银耳菌液体发酵工艺优化及卵孢菌素鉴定》中公开的发酵培养基为：葡萄糖50g/l，谷氨酸3g/l和甘氨酸3g/l，磷酸二氢钾0.46g/l，磷酸氢二钾1g/l，硫酸镁1g/l，ph值为6.0，5l罐中孢外多糖产量5.94±0.27g/l，其使用谷氨酸和甘氨酸作为氮源，成本较低，但是银耳多糖含量也较低。文献《平菇深层发酵技术及其多糖分离纯化研究》中公开的发酵培养基（g/l）为：葡萄糖60,硫酸铵3，玉米浆5，硫酸镁1，磷酸二氢钾1，平菇多糖产量为5.22g/l（10l发酵罐），其使用了低成本的玉米浆和硫酸铵作为氮源，但是多糖产量较低。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的银耳多糖发酵培养基成本高以及银耳多糖产量不高的问题，本发明提供了一种银耳多糖发酵培养基，该培养基成分简单、价格低廉，银耳多糖产量高。
本发明还提供了一种发酵生产银耳多糖的方法，该方法使用本发明特制培养基，降低了生产成本、缩短了发酵周期、提高了银耳多糖产量，便于工业化推广应用。
本发明具体技术方案如下：
一种银耳多糖发酵培养基，其由以下有效组分组成：玉米蛋白粉3.0～10.0g/l，硝酸盐0～2.0g/l，硫酸镁1.0～2.0g/l，磷酸氢二钾1.0～2.0g/l，葡萄糖40～60g/l，其中，玉米蛋白粉和硝酸盐的总量为5.0～10.0g/l。该培养基为液态，各有效组分存在在水中，即各有效组分在水中的含量为：玉米蛋白粉3.0～10.0g/l，硝酸盐0～2.0g/l，硫酸镁1.0～2.0g/l，磷酸氢二钾1.0～2.0g/l，葡萄糖40～60g/l，其中，玉米蛋白粉和硝酸盐的总量为5.0～10.0g/l。
进一步的，上述银耳多糖发酵培养基的ph为5.0～6.0。
进一步的，上述银耳多糖发酵培养基中，所述玉米蛋白粉的蛋白含量应大于等于60wt%，本发明玉米蛋白粉通过市购即可获得。玉米蛋白粉含有丰富的蛋白质，氨基酸组成均衡，且其为玉米淀粉生产过程中的一种副产物，绿色环保，价格低廉。
进一步的，所述硝酸盐可以是任意可用作培养基成分的水溶性硝酸盐，例如硝酸钠、硝酸钾等。
发酵培养基提供微生物生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机元素、生长因子等。而培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品的质量和产量都有重要的影响。本发明中，葡萄糖提供碳源，硝酸盐和玉米蛋白粉提供氮源，硫酸镁和磷酸氢二钾提供无机元素，玉米蛋白粉除作为氮源外，还可以提供一定量的生长因子。因此，本发明发酵培养基仅需5种有效成分即可满足银耳菌种的发酵需求。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。一般情况下，氮源的价格高于其它成分的价格，为培养基成本的主要限制因素，且有机氮高于无机氮，而本发明中，氮源总用量较低，且采用无机氮硝酸盐和有机氮玉米蛋白粉复配的方式提供氮源，更加降低了有机氮的用量，降低了氮源的成本，从而降低了培养基成本。硝酸盐和玉米蛋白粉均为常见氮源，价格低、易购买。发酵早期，微生物首先利用硝酸盐，随着发酵的进行，中期时，代谢酶系已形成，此时菌种开始利用有机氮，菌种开始利用玉米蛋白粉，其除含有丰富的氨基酸和小肽外，还含有其它无机盐和生长因子，营养物质更丰富，因此，在不同的发酵时期，菌种分别利用不同来源的氮源，从而缩短了发酵时间，也提高了银耳多糖的产量。
优选的，发酵培养基由以下有效组分组成：玉米蛋白粉3.0～4.0g/l，硝酸盐1.0～2.0g/l，硫酸镁1.0～2.0g/l，磷酸氢二钾1.0～2.0g/l，葡萄糖40～60g/l。
更优选的，发酵培养基由以下有效组分组成：玉米蛋白粉3.0g/l，硝酸盐2.0g/l，硫酸镁1.5g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，葡萄糖50g/l。
本发明还提供了一种发酵生产银耳多糖的方法，该方法包括将银耳种子液接入上述银耳多糖发酵培养基中、发酵培养生产银耳多糖的步骤。
进一步的，发酵培养时，发酵条件为：转速800～1000r/min，通气量4～6l/min，温度24～30℃，ph5.0～7.0。
进一步的，发酵培养时，观察发酵ph曲线，当发酵液ph上升时，流加葡萄糖至浓度为50～60g/l，流加后再发酵至无残糖时结束发酵。
进一步的，发酵培养时，种子液的接入量为5～7wt%。
进一步的，所用的银耳种子液可以采用现有技术公开的方法进行，这对于本领域技术人员来说没有难度。在本发明具体实施方式中，可以采用以下方式制备银耳种子液：将银耳菌种的孢子接入种子培养基中，在24～30℃、150-250r/min的条件下培养3～4天，得到银耳种子液；种子培养基为液态，水为基质，有效组分组成为：蛋白胨8.0～10.0g/l，硫酸镁1.0～2.0g/l，磷酸氢二钾1.0~2.0g/l，葡萄糖15～25g/l，vb1（维生素b1）10~15mg/l，ph值为5.0-6.5。
进一步的，种子培养基和发酵培养基均灭菌后使用。
本发明提供了一种银耳多糖发酵生产时所需的发酵培养基，该培养基组分极其简单，氮源优选采用有机氮源玉米蛋白粉和无机氮源硝酸盐复配的方式提供，玉米蛋白粉为一种副产品，价格低廉，与现有技术中使用的蛋白胨、酵母粉等有机氮源相比，成本大大降低，仅为有机氮源成本的30～60%。采用本发明培养基发酵生产银耳多糖产量较高，能到12.8g/l以上，且生产周期缩短，这进一步降低了银耳多糖的单位生产成本，在工业化生产中具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。
下述实施例和对比例中，所用各成分均从市场中购买得到，其中所用玉米蛋白粉含量大于60%，大豆蛋白粉中蛋白的含量大于50%。
下述实施例中，如无特别说明，所述银耳多糖含量均为孢外银耳多糖含量。
培养基筛选
实施例1发酵培养基氮源含量优化
（1）培养基配制：
种子培养基：蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l和vb115mg/l，ph值为6.0。
发酵培养基：本实施例对四组玉米蛋白粉不同浓度的发酵培养基进行试验，各发酵培养基配方如下：
发酵培养基1：玉米蛋白粉10g/l，葡萄糖50g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，ph值为6.0；
发酵培养基2：玉米蛋白粉7.5g/l，葡萄糖50g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，ph值为6.0；
发酵培养基3：玉米蛋白粉5.0g/l，葡萄糖50g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，ph值为6.0；
发酵培养基4：玉米蛋白粉2.5g/l，葡萄糖50g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，ph值为6.0。
（2）发酵：
将银耳菌种的孢子接入装液量300ml的种子培养基中，26℃下、200r/min摇瓶发酵3天，获得工作种子液；将上述种子液按5wt%的接种量接入5l发酵罐中，发酵培养基装液量为4l，控制转速800r/min、通气量4l/min、温度30℃开始发酵。发酵过程用40wt%naoh溶液控制ph值为5.0～7.0，发酵期间，观察发酵ph曲线，当发酵液ph上升时，通过补料管路流加葡萄糖至浓度为50g/l，再发酵至无残糖时结束发酵。
不同发酵培养基所得发酵液黏度和孢外银耳多糖含量如下表1所示，其中发酵液中孢外银耳多糖含量采用苯酚硫酸法测定，方法如下：
标准溶液制备：准确称取葡萄糖100mg，加入20ml蒸馏水溶解，转移至250ml容量瓶中，加水至刻度，用前稀释10倍，分别吸取0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml、2.0ml于具塞试管中，各以蒸馏水补至2.0ml。
样品溶液制备：在10ml离心管中加入2g发酵液和8g纯化水，涡旋振荡器充分混匀。分别取上述混合液200µl置于2个1.5ml的离心管中作为平行，并加入1ml酒精沉淀，涡旋振荡器充分混匀，10000r/min离心5min，弃上清，并用滤纸吸干，加1ml纯化水重溶，涡旋振荡器充分混匀，40℃水浴加热30～60min后10000r/min离心5min，分别取200µl上清进行下一步实验。
测定：向以上标准溶液与样品溶液中分别加入6wt%重蒸酚1.0ml及浓h2so45.0ml，摇匀冷却，室温反应20min后于490nm测od，以2.0ml水按同样显色操作为空白，以糖浓度为纵坐标，以吸光度值为横坐标，得标准曲线及回归方程：y=83.468x-7.433(r2=0.9996)。将样品溶液所得的吸光度值带入回归方程，计算发酵液中孢外银耳多糖含量。
由上表可以看出，玉米蛋白粉含量为2.5g/l时，银耳多糖产量较低，而玉米蛋白粉添加量分别为10g/l、7.5g/l、5g/l时，银耳多糖产量差别不大，因此玉米蛋白粉含量选择5-10g/l，为降低培养基成本，玉米蛋白粉含量优选为5g/l。
实施例2发酵培养基氮源种类优化
无机氮源价格通常低于有机氮源，因此，使用无机氮部分替代实施例1中的玉米蛋白粉来降低培养基成本。按照下述方法生产银耳多糖，考察本实施例中不同氮源发酵培养基的性能。
种子培养基和发酵方法，按照实施例1进行。
本实施例所用发酵培养基配方如下：
发酵培养基1：玉米蛋白粉5.0g/l，葡萄糖50g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，ph值为6.0；
发酵培养基2：玉米蛋白粉4.0g/l，硝酸钠1.0g/l，葡萄糖50g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，ph值为6.0；
发酵培养基3：玉米蛋白粉4.0g/l，硝酸钾1.0g/l，葡萄糖50g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，ph值为6.0；
发酵培养基4：玉米蛋白粉4.0g/l，氯化铵1.0g/l，葡萄糖50g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，ph值为6.0；
发酵培养基5：玉米蛋白粉4.0g/l，硫酸铵1.0g/l，葡萄糖50g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，ph值为6.0；
发酵培养基6：玉米蛋白粉4.0g/l，尿素1.0g/l，葡萄糖50g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，ph值为6.0。
不同发酵培养基所得发酵液黏度、孢外银耳多糖含量及发酵天数如下表2所示，孢外银耳多糖含量按实施例1的方法计算。
由上表可以看出，发酵培养基2、3黏度和多糖含量与发酵培养基1近似，说明可用硝酸盐替代部分玉米蛋白粉，且发酵时间缩短了1天，而发酵培养基4、5、6的黏度和多糖含量较低，说明铵盐和尿素不可替代玉米蛋白粉。因此选择使用硝酸盐部分替代玉米蛋白粉。
实施例3发酵培养基无机氮和有机氮配比优化
调整发酵培养基中无机氮源和有机氮源的配比，按照实施例2的方法测试不同无机氮源和有机氮源配比下发酵天数、发酵液黏度、孢外银耳多糖含量的差异。
种子培养基和发酵方法，按照实施例1进行。
本实施例所用发酵培养基配方如下，硝酸盐以硝酸钠为例：
发酵培养基1：玉米蛋白粉5.0g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，葡萄糖50g/l，ph值为6.0；
发酵培养基2：玉米蛋白粉4.0g/l，硝酸钠1.0g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，葡萄糖50g/l，ph值为6.0；
发酵培养基3：玉米蛋白粉3.0g/l，硝酸钠2.0g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，葡萄糖50g/l，ph值为6.0；
发酵培养基4：玉米蛋白粉2.0g/l，硝酸钠3.0g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，葡萄糖50g/l，ph值为6.0。
实验结果如下表3所示，孢外银耳多糖含量按实施例1的方法计算。
由上表可以看出，添加硝酸钠后，发酵时间均缩短1天，而培养基配方1、2、3的银耳多糖含量近似，但培养基4的多糖含量较低，说明硝酸盐可以部分替代玉米蛋白粉，但不能完全替代。因此选用玉米蛋白粉3.0g/l，硝酸钠2.0g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，硫酸镁1.5g/l，葡萄糖50g/l的发酵培养基作为最优培养基。
发酵法生产银耳多糖
实施例4
（1）培养基配制：
种子培养基：蛋白胨8.0g/l，硫酸镁1.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，vb110mg/l，葡萄糖25g/l，ph值为5.0，116℃灭菌20min。
发酵培养基：玉米蛋白粉3.0g/l，硝酸钠2.0g/l，硫酸镁1.0g/l，磷酸氢二钾2.0g/l，葡萄糖60g/l，ph值为6.0。116℃灭菌20min。
（2）发酵：
将银耳菌种的孢子接入300ml种子培养基中，24℃，200r/min培养3d，得种子液。将上述种子液按6%的接种量接入5l发酵罐中，发酵培养基装液量为4l，控制转速800r/min、通气量4l/min、温度24℃开始发酵。发酵过程用40wt%naoh溶液控制ph值为5.0～7.0，发酵期间，观察发酵ph曲线，当发酵液ph上升时，补加50g/l葡萄糖，发酵至无残糖时结束发酵。
发酵结束后，所得发酵液终黏度为25000mpa·s，按照实施例1的苯酚硫酸法测定银耳多糖含量，发酵液中银耳多糖含量为14.5g/l。
实施例5
（1）培养基配制：
种子培养基：蛋白胨9.0g/l，硫酸镁2.0g/l，磷酸氢二钾1.0g/l，vb112mg/l，葡萄糖15g/l，ph值为6.0，116℃灭菌20min。
发酵培养基：玉米蛋白粉3.0g/l，硝酸钠2.0g/l，硫酸镁2.0g/l，磷酸氢二钾1.0g/l，葡萄糖40g/l，ph值为5.0。116℃灭菌20min。
（2）发酵：
将银耳菌种的孢子接入300ml种子培养基中，30℃，150r/min培养4d，得种子液。将上述种子液按6%的接种量接入5l发酵罐中，发酵培养基装液量为4l，控制转速900r/min、通气量6l/min、温度28℃开始发酵。发酵过程用40wt%naoh溶液控制ph值为5.0～7.0，发酵期间，观察发酵ph曲线，当发酵液ph上升时，补加55g/l葡萄糖，发酵至无残糖时结束发酵。
发酵结束后，所得发酵液终黏度为26000mpa·s，按照实施例1的苯酚硫酸法测定银耳多糖含量，发酵液中银耳多糖含量为14.7g/l。
实施例6
（1）培养基配制：
种子培养基：按照实施例1。
发酵培养基：玉米蛋白粉3.0g/l，硝酸钾2.0g/l，硫酸镁1.5g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，葡萄糖50g/l，ph值为6.0。116℃灭菌20min。
（2）发酵：按照实施例1。
发酵结束后，所得发酵液终黏度为20000mpa·s，按照实施例1的苯酚硫酸法测定银耳多糖含量，发酵液中银耳多糖含量为12.8g/l。
实施例7
（1）培养基配制：
种子培养基：按照实施例1。
发酵培养基：玉米蛋白粉4.0g/l，硝酸钾1.0g/l，硫酸镁1.5g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，葡萄糖50g/l，ph值为6.0。116℃灭菌20min。
（2）发酵：按照实施例1。
发酵结束后，所得发酵液终黏度为22000mpa·s，按照实施例1的苯酚硫酸法测定银耳多糖含量，发酵液中银耳多糖含量为13.9g/l。
对比例1
（1）培养基配制：
种子培养基：按照实施例1。
发酵培养基：大豆蛋白粉3.0g/l，硫酸铵2.0g/l，硫酸镁1.5g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，葡萄糖50g/l，ph值为6.0。116℃灭菌20min。
（2）发酵：按照实施例1。
发酵结束后，所得发酵液终黏度为15000mpa·s，按照实施例1的苯酚硫酸法测定银耳多糖含量，发酵液中银耳多糖含量为6.9g/l。
对比例2
（1）培养基配制：
种子培养基：按照实施例1。
发酵培养基：玉米蛋白粉3.0g/l，硝酸钠2.0g/l，硫酸镁3.0g/l，磷酸氢二钾3.0g/l，葡萄糖30g/l，ph值为6.0，116℃灭菌20min。
（2）发酵：按照实施例1。
发酵结束后，所得发酵液终黏度为19000mpa·s，按照实施例1的苯酚硫酸法测定银耳多糖含量，发酵液中银耳多糖含量为9.1g/l。
对比例3
（1）培养基配制：
种子培养基：按照实施例1。
发酵培养基：参考文献《银耳菌液体发酵工艺优化及卵孢菌素鉴定》中的发酵培养基（g/l）：葡萄糖50，谷氨酸3.0，甘氨酸3.0，磷酸二氢钾0.46，磷酸氢二钾1.0，硫酸镁1.0，ph值为6.0。
（2）发酵：按照实施例1。
发酵结束后，所得发酵液终黏度为14000mpa·s，按照实施例1的苯酚硫酸法测定银耳多糖含量，发酵液中银耳多糖含量为6.4g/l。
对比例4
（1）培养基配制：
种子培养基：按照实施例1。
发酵培养基：参考专利cn201710986467.1中的发酵培养基的配方（g/l）：土豆淀粉10，葡萄糖20，胰蛋白胨10,酵母提取物5.0,硫酸镁0.2,磷酸氢二钾0.5,氢氧化钠1.0，ph为6.5。
（2）发酵：按照实施例1。
发酵结束后，所得发酵液终黏度为29000mpa·s，按照实施例1的苯酚硫酸法测定银耳多糖含量，发酵液中银耳多糖含量为15.1g/l。
实施例3-3和对比例1、3、4的发酵培养基组成和孢外银耳多糖含量如下表4所示，由表中可以看出，使用对比例1和对比例3的发酵培养基进行发酵时，其孢外银耳多糖含量低于实施例3-3的含量，使用对比例4的发酵培养基进行发酵时，孢外银耳多糖含量与实施例3-3近似，但其培养基氮源总量为15g/l，且均为有机氮源，其成本较高。