本发明涉及一种重组酵母菌催化合成莱鲍迪苷m的方法，属于食品添加剂
技术领域：
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背景技术：
：甜味剂是指能赋予软饮料甜味的物质。目前，人们使用最多的天然甜味剂为蔗糖，蔗糖能够为人们提供甜味，其口感也被人们普遍接受，但是，蔗糖中的热量较高，糖尿病患者以及肥胖人群均需要在饮食中进行严格控制，因此，需要无热量或者低热量的代替蔗糖的甜味剂。甜菊糖(steviolglycosides)是从甜叶菊(steviarehaudiana)叶片中提取分离得到的一类甜菊糖苷类化合物，具有高甜度(为蔗糖的250～300倍)、低热量(为蔗糖的1/300)，无毒副作用，无致癌物质，食用安全等优点，受到了科学界、产业界等多个领域的广泛重视，成为继甘蔗糖、甜菜糖之外的第三种具有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被国际上誉为“世界第三糖源”。甜菊糖苷类化合物组分众多，均具有四环二萜母核并且有不同程度的糖基化修饰及不同程度的甜味口感，目前，被识别的甜菊糖苷化合物主要有甜菊苷(stevioside.st)、莱鲍迪苷a(ra)、莱鲍迪苷c(rc)、莱鲍迪苷d(rd)、莱鲍迪苷m(rm)等，其中，仅甜菊苷和莱鲍迪苷a被商业化应用，广泛用于饮料、食品、调味剂、酒类、乳制品等食品加工领域。而其余的物质，比如莱鲍迪苷m，由于生产成本高，限制了其产业化的发展。专利cn103757074a公开了一种酶法制备瑞鲍迪甙m的方法，该方法采用瑞鲍迪甙a或瑞鲍迪甙d为底物，在蔗糖、udp的存在下，以重组细胞或者相应的重组细胞表达的酶为催化剂进行转化，得到瑞鲍迪甙m。但是，该方法需要额外加入价格昂贵的udp，这无疑增加了成本，且采用该方法，以重组细胞为催化剂时，瑞鲍迪甙a的转化率较低，仅为40％以上，需要进一步的提高。技术实现要素：本发明解决的技术问题是提供一种转化率高的重组酵母菌催化合成莱鲍迪苷m的方法。本发明重组酵母菌催化合成莱鲍迪苷m的方法，以莱鲍迪苷a为底物，以重组酵母菌为催化剂，在蔗糖、氯化锌和柠檬酸三钠的存在下，催化底物进行反应，反应后，过滤，并加热滤液使重组微生物失活，得到粗制莱鲍迪苷m溶液，再进行纯化浓缩，得到莱鲍迪苷m；其中，重组酵母菌的菌体浓度od600为80～120，莱鲍迪苷a浓度为1～80g/l；柠檬酸三钠浓度为50～80mmol/l，氯化锌浓度为0.5～2mmol/l，蔗糖浓度为30～50％(w/v)，ph值为7.5～8.5，所述重组酵母菌含有eugt11编码基因和ugt76g1编码基因，且该重组酵母菌敲除了pgm基因、glgc基因和agp基因。优选的，将该重组酵母菌的usha基因替换为包含basp和ugpa基因的t5操纵子。优选的，反应温度为35～40℃，反应时间为20～60h。作为优选方案，重组酵母菌的菌体浓度od600为100，莱鲍迪苷a浓度为5g/l；柠檬酸三钠浓度为60mmol/l，氯化锌浓度为1mmol/l，蔗糖浓度为40％(w/v)，ph值为8.0。作为优选方案，反应温度为37℃，反应时间为24h。与现有技术相比，本发明具有以下优点：1)本发明采用特定的重组酵母菌为催化剂，全细胞催化转化，方法简单，控制转化条件可以得到莱鲍迪苷m，其转化率高达90％以上。2)采用本发明方法，无需加入udp或udpg，生产成本较低。具体实施方式本发明重组酵母菌催化合成莱鲍迪苷m的方法，以莱鲍迪苷a为底物，以重组酵母菌为催化剂，在蔗糖、氯化锌和柠檬酸三钠的存在下，催化底物进行反应，反应后，过滤，并加热滤液使重组微生物失活，得到粗制莱鲍迪苷m溶液，再进行纯化浓缩，得到莱鲍迪苷m；其中，重组酵母菌的菌体浓度od600为80～120，莱鲍迪苷a浓度为1～80g/l；柠檬酸三钠浓度为50～80mmol/l，氯化锌浓度为0.5～2mmol/l，蔗糖浓度为30～50％(w/v)，ph值为7.5～8.5，所述重组酵母菌含有eugt11编码基因和ugt76g1编码基因，且该重组酵母菌敲除了pgm基因、glgc基因和agp基因。本发明方法，采用莱鲍迪苷a为底物，添加蔗糖、氯化锌和柠檬酸三钠，以含有eugt11编码基因和ugt76g1编码基因的重组酵母菌为催化剂，即可催化底物转换为莱鲍迪苷m。由于重组酵母菌可代谢产生特定的糖基转移酶，促进底物进行转化，而敲除了pgm基因、glgc基因和agp基因，对宿主自身的代谢进行改造，减少udpg的消耗，使其自身合成的udpg即可满足转化需求，从而无需加入外源的udpg即可进行转化，降低转化成本，提高转化率。且发明人在研究中发现，与大肠杆菌相比，采用酵母菌为表达菌株，其催化活性较好，最终的转化率较高。本发明所述的udpg为尿苷二磷酸葡萄糖。其中，eugt11编码基因为现有的，在genbank数据库中可以查到(accessionno.ak121682.1)。ugt76g1为udp-glycosyltransferase76g1，其氨基酸序列号为aar06912.1，ugt76g1编码基因如序列1所示。pgm基因为磷酸变位酶基因(phospoglucomutase)，其核苷酸序列如序列2所示。glgc基因为1-磷酸葡萄糖腺苷酰基转移酶基因(gipadenylyltransferase)，其核苷酸序列如序列3所示。agp基因为1-磷酸葡萄糖磷酸酶基因(gipphosphatases)，其核苷酸序列如序列4所示。本发明重组酵母菌该可以采用现有的基因工程方法得到，比如，参照经改良的λred-crispr/cas技术方法，首先针对各个被敲除基因设计crispr/cas9特异性靶点grna，然后设计同源臂，接着构建相应目标基因质粒，转化目标菌株，对目标基因进行无痕敲除。将水稻eugt11编码基因、甜菊ugt76g1编码基因与载体连接构建重组质粒，然后转化到敲除部分基因的酵母菌株中，得到重组酵母菌。优选的，将该重组酵母菌的usha基因替换为包含basp和ugpa基因的t5操纵子。将该基因进行替换，可以引入自然界其他物种的udp合成通路，增加体系中的udp。其中，usha基因为原有的udp合成酶基因，其核苷酸序列如序列5所示。basp为来源于青春双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶基因(ncbigeneid.4556453)，ugpa为来源于两歧双歧杆菌的gip尿苷基转移酶基因(ncbigeneid.no.9889115)。本发明方法中，蔗糖浓度为重量体积比，即反应体系中的蔗糖重量与整个反应体系的体积之比，研究发现，蔗糖浓度对转化率的影响较大，蔗糖浓度较低，将会导致udpg合成机制无法充分运转，udpg供应不足，从而影响转化率，因此，优选的，蔗糖浓度为30～50％。反应温度对转化有一定的影响，反应温度过低，重组微生物活性不高，催化活性不强，而反应温度过高，则可能破坏蛋白结构，导致催化活性下降。优选的，反应温度为35～40℃，反应时间为20～60h。作为优选方案，重组酵母菌的菌体浓度od600为100，莱鲍迪苷a浓度为5g/l；柠檬酸三钠浓度为60mmol/l，氯化锌浓度为1mmol/l，蔗糖浓度为40％(w/v)，ph值为8.0。进一步优选的，反应温度为37℃，反应时间为24h。下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例11、重组酵母菌的制备：提取水稻(oryzasativa)叶总rna并通过反转录获得水稻cdna。根据genebank数据库中的eugt11基因序列(accessionno.ak121682)，设计pcr扩增引物，上下游引物分别引入bamhi、hindiii位点，pcr扩增得到eugt11编码基因。提取甜叶菊总rna并通过反转录获得水稻cdna。根据genebank数据库中的eugt11基因序列(accessionno.ak121682)，设计pcr扩增引物，上下游引物分别引入ndei、xhoiii位点，pcr扩增得到ugt76g1编码基因。将eugt11片段与表达载体petduet分别用bamhi和hindiii双酶切，回收目的片段后以连接酶进行连接，得到petduet-eugt11。将ugt76g1片段与petduet-eugt11分别用ndei和xhoiii双酶切，回收目的片段后以连接酶进行连接，得到petduet-eugt11-ugt76g1。参照经改良的λred-crispr/cas技术方法，首先针对各个被敲除基因设计crispr/cas9特异性靶点grna，然后设计同源臂，接着构建相应目标基因质粒，转化目标酵母菌株，对目标基因进行无痕敲除。设计两种酵母菌株，其中，酵母菌株1敲除pgm基因、glgc基因和agp基因；酵母菌株2敲除pgm基因、glgc基因和agp基因，且将usha基因替换为包含basp和ugpa基因的t5操纵子。将重组质粒petduet-eugt11-ugt76g1转化至敲除目标基因的酵母菌株1和酵母菌株1中，通过氨苄霉素抗性筛选，获得重组酵母菌1(简写czjm1)和重组酵母菌2(简写czjm2)。2、菌体培养及蛋白表达：挑重组酵母菌2(czjm2))接种于2ml含amp(氨苄霉素，100μg/ml)的lb培养基中(20ml小试管)，37℃培养4h，然后1％接种于100mlm9培养基中(500ml三角瓶)，37℃，250r/m条件培养2h(od600～0.6)，用自来水浸泡，冷却10min，加iptg(工作浓度100mm)，置于22℃，180r/m条件下诱导表达20h，收菌，冰浴。m9培养基组分如表1：表1m9培养基组分1l用量备注5×m9盐200ml可合并灭菌(121℃20min)甘油4ml0.1mmgso4(0.6g定容50ml)20ml单独灭菌(121℃20min)0.02mcacl2(0.11g定容50ml)5ml单独灭菌(121℃20min)5×m9盐组分为：na2hpo4·12h2o8.55g/100ml，kh2po41.5g/100ml，nacl0.25g/100ml，nh4cl0.5g/100ml。3、静息细胞转化测定菌液的od600，然后离心(4℃，3000g，离心10min)弃上清收集菌体，用静息细胞转化反应缓冲液(即磷酸钠缓冲液ph8.0，附加底物、蔗糖、氯化锌和柠檬酸三钠等)重悬菌体至od600＝100。37℃培养箱静置24h，然后12000r/m室温离心10min，取上清过0.22μm滤膜以除去沉淀和剩余的酵母细胞，得到粗制莱鲍迪苷m溶液。加热过滤的溶液以使残留的酶失活并杀死剩余的酵母细胞。其中，底物莱鲍迪苷a浓度为5g/l，蔗糖浓度为40％(w/v)，氯化锌浓度为1mm，柠檬酸三钠浓度为60mm。对粗制莱鲍迪苷m溶液进行纯化和浓缩：将粗制莱鲍迪苷m溶液加载到大孔树脂柱上并使其通过重力流过，粗莱鲍迪苷m溶液吸附到柱上。用食品级乙醇洗涤柱以从柱中洗脱吸附的莱鲍迪苷m溶液。收集洗脱液并用刮膜蒸发器浓缩以回收乙醇。将浓缩物冷却并离心以获得溶解在乙醇中的湿结晶沉淀物。加入活性炭，将溶液过滤，重结晶，并离心，干燥，得到莱鲍迪苷m晶体。然后处理湿晶体以产生最终的高纯度莱鲍迪苷m产品(≥95wt％莱鲍迪苷m)。测定莱鲍迪苷a的转化率，为90％。实施例2～4采用实施例1的方法，仅改变重组酵母菌的种类，转化时的部分参数，得到产物，并测定转化率，其中，改变的参数以及测定结果如表2所示。表2反应参数实施例1实施例2实施例3实施例4重组微生物种类czjm2czjm1czjm2czjm1od60010080120110莱鲍迪苷a浓度(g/l)511080柠檬酸三钠浓度(mmol/l)60507080氯化锌浓度(mmol/l)10.51.52蔗糖浓度(％，w/v)40304050ph值8.08.57.58.0反应温度(℃)37353840反应时间(h)24202830转化率(％)90848780当前第1页12