本发明涉及一种核酸适配体纯化基因工程中表达蛋白的方法，尤其是涉及一种将核酸配基分子识别原理有机结合，建立核酸适配体纯化基因工程中表达蛋白的方法，本发明同时还涉及基于该方法的试剂盒，属于分子生物学领域。
背景技术：
核酸与蛋白质在细胞内相互作用是普遍现象。核酸能折叠形成二级结构和三级结构，这对其与蛋白质相互结合作用非常重要。通过使核苷酸序列多样化而使核酸蛋白质相互作用来筛选特异靶标蛋白，从而可以纯化基因工程中的表达蛋白。selex技术被用来分离所选靶标的核苷酸配体，这些配体被称为配基或适配体，意即核酸可以形成一定结构并适配入靶分子的口袋，selex技术就是利用该原理分离筛选靶分子配基的方法。
selex即指数级富集的配体进化系统(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)，是利用大容量的随机寡核苷酸库文与靶蛋白相互作用，从中筛选出与靶标特异结合的核酸适配体。该方法具有灵敏度高、特异性强、快速、高效等优点。自tuerk等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体t4dna聚合酶和有机染料分子的特异寡核苷酸配基后，经过二十多年的发展，selex技术已经成为一种重要的研究手段和工具，被应用于生物化学、基因调控、疾病诊断及新药研发等领域。筛选的靶标越来越广泛，从最开始的有机染料和酶逐渐扩展到更小的离子、氨基酸、毒素以及更复杂的癌细胞、干细胞、临床组织切片、血清等，对于不同的靶物质，采用适当的方法，才可以更快更方便地找到亲和力高、特异性强的适配体。
selex技术开始后，许多靶标的核苷酸配基已被筛选出，尤其是已知能和核酸结合的许多蛋白质可作为selex技术的较合适靶标，如t4dna聚合酶、噬菌体r17被膜蛋白，大肠杆菌rho因子，大肠杆菌核糖体蛋白s1，苯丙氨酸-trna合成酶，识别rna的自身免疫抗体，e2f转录因子，不同的hiv相关蛋白。selex技术可筛选出许多不同蛋白配基的事实引发了配基应用的拓展，可作为单抗和多抗产品的替代品应用于诊断和治疗。配基代替抗体应用于诊断已显示其价值。dna聚合酶的配基已被用于热启动pcr来诊断低拷贝的复制子，提高pcr敏感性和保真性。配基也被用于促进实验方法。中性弹性蛋白的酶配体荧光标记后用于流式细胞仪检测弹性酶浓度，中性弹性蛋白酶配基尚用于鼠肺炎症诊断模型体内诊断。
近年来研究者在原有筛选方法的基础上将石墨烯，碳纳米管，毛细管，流式细胞仪，原子力显微镜等不同的材料和仪器引入了分离步骤以提高分离效率，使经典的selex技术得到发展和完善，衍生出了众多改良的selex技术如：反向筛选（counterselex）、消减筛选（subtractiveselex）、毛细管电泳筛选（ceselex）、基因组selex（genomicselex）、加尾筛选（tailoredselex）、切换筛选（toggleselex）和基于修饰核苷酸的selex等。
细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达基因工程表达蛋白是多种分子混合物，针对这些复合物进行蛋白纯化，可以根据已知的靶分子核酸适配体纯化已知蛋白，也可以通过筛选未知的靶分子核酸适配体纯化未知蛋白，为核酸适配体纯化基因工程中表达蛋白及药物研究提供技术支持。因此，建立一种快速提取、微量及高纯度兼得的表达蛋白平台，对基因工程中表达蛋白的分离纯化及药物研究具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种纯化效率高、微量、快速等优点的核酸适配体纯化基因工程中表达蛋白的方法，可用于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达基因工程中表达蛋白的纯化。
本发明核酸适配体纯化基因工程中表达蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）粗蛋白样品的制备：将基因工程中特定表达蛋白发酵液在4℃、12000r/min离心30min后弃去上清（胞外表达蛋白弃去沉淀），用bindingbuffer稀释，重悬细胞，冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。
所述靶分子表达蛋白发酵液为细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达基因工程中表达蛋白中的一种。
（2）提取靶分子：将粗蛋白样品与捕捉琼脂磁珠以4:1的体积比混合在一起，在37±0.3℃孵育30min，形成磁珠-靶分子核酸适配体-靶分子复合物，3×ssc洗涤一次，0.4mmbindingbuffer洗涤3次，磁分离弃去不结合的发酵液，得到磁珠-靶分子核酸适配体-靶分子复合物；
所述捕捉琼脂磁珠为：琼脂磁珠包被有靶分子核酸适配体的复合磁珠，是针对特定表达蛋白，利用指数级富集的配体进化系统（systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex）筛选获得的特异性靶分子核酸适配体。
其中琼脂磁珠，由本研究组自主研发提供，琼脂磁珠通过化学键与蛋白质等生物分子结合，并通过结合的生物分子与其他分子发生酶催化、免疫、配体配基等反应，非特异性吸附作用极小，在缓冲液离子强度＞0.05mol/l时，对蛋白类几乎没有特异性吸附作用，并且具有较好的亲水性，可以使生物分子易于靠近并与配体作用，且不会使生物分子丧失活性。其具体制备如下：
以油酸作为分散剂制备fe3o4磁流体：在氮气保护下，将19.48gfecl2•4h2o和52.98gfecl3•6h2o置于烧瓶后溶于600ml三蒸水，80℃下磁力搅拌并缓慢加入含25%tween-20的氨水30ml，80℃磁力搅拌30min。反应结束后，向悬浮液中缓慢加入30ml油酸，80℃磁力搅拌30min，用盐酸调节ph至中性，用磁铁分离溶液中的fe3o4，用三蒸水反复洗去过量的油酸后自然干燥。取3g油酸改性fe3o4微粒于广口瓶中，加入10ml三蒸水和120µltween-20超声10min，制备成磁流体，保存于4℃冰箱中备用。
反相聚合包埋法制备琼脂糖磁性微球（amm）：有机相：在250ml三口烧瓶中加入2gspan-80，50ml液体石蜡，预热至80℃。水相：在4ml蒸馏水中加入0.125g琼脂糖，加热溶解后加入1ml自制的磁流体，充分混合。在850r/min机械搅拌下，迅速将水相滴入有机相，80℃反应10min后冷却至室温，250r/min搅拌5min使微球成形。微球用10ml石油醚和1ml异丙醇洗涤、抽滤，之后用石油醚和三蒸水分别清洗2次除去有机相后置于20%乙醇中，制得琼脂糖磁性微球，4℃保存冰箱备用。
（3）靶分子制备：在磁珠-靶分子适配体-靶分子复合物中加入洗脱缓冲液，晃动1min，收集洗脱缓冲液，立即加入ph为8.0、1m的tris-hcl中和；重复加入洗脱缓冲液洗脱三次，混合三次洗脱中和液，透析除盐，即得纯化的靶分子-表达蛋白。
洗脱缓冲液的配方：0.1m甘氨酸，0.5mnacl，ph3.0的0.05%tween20。洗脱可以将结合在磁珠上的蛋白分子，从磁珠上解离至上清中。洗脱分离适配体和靶分子的洗脱效率为98%以上。
二、核酸适配体纯化基因工程中表达蛋白的试剂盒
包括如下试剂：
试剂1：5~10ml、ph值为7.4的0.4mm1×bindingbuffer缓冲液，内溶50%粒径5~150微米的琼脂磁珠-特异性核酸适配体复合捕捉磁珠。其中ph值为7.4的1×bindingbuffer（含0.01%叠氮钠的防腐剂），1l1×bindingbuffer的配制：138mmol/lnacl，2.7mmol/lkcl，8.1mmol/lna2hpo4，1.1mmol/lkh2po4，5nmol/lmgcl2，用hcl调节溶液的ph值至7.4，加水定容至1l，高压蒸汽灭菌20min，室温保存；
试剂2：洗脱缓冲液3×ssc，包括柠檬酸、氯化钠；1l3×ssc的配制：25.04gnacl，12.6g柠檬酸三钠，加水定容至1l，室温保存。3×ssc的洗脱缓冲液用于分离结合在琼脂磁珠上的寡核苷酸分子；
试剂3：酸洗脱液：0.5ml洗脱缓冲液（0.1m甘氨酸，0.5mnacl,ph3.0的0.05%tween20）；
试剂4：碱洗脱液：ph为8.0、1m的tris-hcl。ph为8.0、1m的tris-hcl的配制：121gtris碱，加800ml纯水溶解后用浓盐酸调节ph值到8.0，然后再定容到1l。
本发明相对于现有技术具有以下优点：
1、本发明将核酸配基分子识别原理有机结合，无需对表达的粗蛋白进行多次长时间的高速离心及滤膜过滤，可从粗样品直接纯化目标蛋白，极大的缩短纯化时间。通过调节洗脱缓冲液体积的方式，实现对目标蛋白浓度和体积的控制，无蛋白损失，且不存在蛋白变性、沉淀的风险。一步纯化即可获得高纯度目标蛋白，无需控制流速，更不需要昂贵的层析设备；磁珠-适配体-靶分子复合物的特异性结合以及酸洗脱操作简单、快速，同时也提高了核酸适配体分离纯化基因工程中表达蛋白的效率和纯度；
2、琼脂磁珠是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子，其结构是核心为超顺磁性粒子，核心外层包裹聚合物，最外层是核酸配基。琼脂磁珠具有磁性，可方便简单地进行分离和磁性导向，具有很好的生物相容性、化学稳定性、分散性，非特异性吸附作用小，能保持结合分子的空间结构等特性，外加活性基团，如羧基、环氧基和氨基等活性基团，可以使生物分子易于靠近并与配体作用，且不会使生物分子丧失活性。可机械化完成孵育、洗脱、分离等步骤，减少了人为操作的误差。
3、细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达基因工程表达蛋白是多种分子混合物，针对这些复合物进行蛋白纯化，可以根据已知的靶分子核酸适配体纯化已知蛋白，也可以通过筛选未知的靶分子核酸适配体纯化未知蛋白，为核酸适配体纯化基因工程中表达蛋白及药物研究提供技术支持。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明核酸适配体纯化基因工程中表达蛋白的方法及试剂盒作进一步的说明。
一、表达蛋白的试剂盒
核酸适配体纯化基因工程中表达蛋白的试剂盒，包括如下试剂：
试剂1：5~10ml、ph值为7.4的0.4mm1×bindingbuffer缓冲液（含0.01%叠氮钠的防腐剂），内溶50%粒径5-150微米的琼脂磁珠-特异性核酸适配体复合捕捉磁珠。1l1×bindingbuffer的配制：138mmol/lnacl，2.7mmol/lkcl，8.1mmol/lna2hpo4，1.1mmol/lkh2po4，5nmol/lmgcl2，用hcl调节溶液的ph值至7.4，加水定容至1l，高压蒸汽灭菌20min，室温保存；
试剂2：洗脱缓冲液3×ssc包括柠檬酸、氯化钠。1l3×ssc的配制：25.04gnacl，12.6g柠檬酸三钠，加水定容至1l，室温保存；
试剂3：酸洗脱液：0.1m甘氨酸，0.5mnacl,ph3.0的0.05%tween20
试剂4：碱洗脱液：ph为8.0、1m的tris-hcl。1lph为8.0、1m的tris-hcl的配制：121gtris碱，加800ml纯水溶解后用浓盐酸调节ph值到8.0，然后再定容到1l。
二、核酸适配体纯化基因工程中表达蛋白的方法
1、应用核酸适配体纯化基因工程中表达蛋白试剂盒纯化毕赤酵母表达人胎盘生长因子2蛋白的方法
（1）将毕赤酵母表达人胎盘生长因子2蛋白发酵液在4℃，12000r/min，离心30min后弃去上清，用500µlbindingbuffer稀释，重悬细胞，冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品；
（2）将400µl粗蛋白样品与100µl捕捉琼脂磁珠（琼脂磁珠包被有生长因子2蛋白特异性核酸适配体的复合磁珠）混合在一起，37±0.3℃旋转孵育30min，形成磁珠-人胎盘生长因子2核酸适配体-胎盘生长因子2的复合物，经3×ssc洗涤一次，20倍体积的0.4mmbindingbuffer洗涤3次，磁分离弃上清；
（3）在磁分离得到的复合物中加入0.5ml洗脱缓冲液（0.1m甘氨酸，0.5mnacl，ph3.0的0.05%tween20），晃动1min，收集洗脱缓冲液，立即加入250μl、ph为8.0、1m的tris-hcl中和；重复洗脱三次，混合三次洗脱中和液，透析除去盐离子，即得纯化好的人胎盘生长因子2蛋白。
2、应用his核酸适配体纯化基因工程中表达蛋白试剂盒纯化大肠杆菌细胞内表达his融合蛋白的方法
（1）将大肠杆菌细胞表达融合蛋白菌液在4℃，12000r/min，离心30min后弃去上清，用500µlbindingbuffer稀释，重悬细胞，冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品；
（2）将400µl粗蛋白样品与100µl捕捉琼脂磁珠（琼脂磁珠包被有his核酸适配体的复合磁珠）混合在一起，37±0.3℃旋转孵育30min，形成磁珠-his核酸适配体-his融合蛋白的复合物，经3×ssc洗涤一次，20倍体积的0.4mmbindingbuffer洗涤3次，磁分离弃上清；
（3）在磁分离得到的复合物中加入0.5ml洗脱缓冲液（0.1m甘氨酸，0.5mnacl，ph3.0的0.05%tween20），晃动1min，收集洗脱缓冲液，立即加入250μl、ph为8.0、1m的tris-hcl中和，重复洗脱三次，混合三次洗脱中和液，透析除去盐离子，即得纯化好的his融合蛋白。
3、应用多个核酸适配体纯化基因工程中表达蛋白试剂盒纯化毕赤酵母胞外表达人源ec-sod蛋白的方法
本方法主要用于：由于核酸适配体的非特异性较大，严重影响提取蛋白的纯度，或通过多个适配体分离纯化得到高纯度蛋白的方法。
（1）将毕赤酵母胞外表达人源ec-sod蛋白菌液在4℃，12000r/min，离心30min后弃去沉淀，取胞外表达上清，即为粗蛋白样品；
（2）将400µl粗蛋白样品与100µl捕捉琼脂磁珠1（琼脂磁珠包被有ec-sod蛋白的核酸适配体1的复合磁珠，核酸适配体1为ec-sod蛋白多个核酸适配体的其中一个）混合一起，37±0.3℃旋转孵育30min，形成磁珠-人源ec-sod核酸适配体1-人源ec-sod蛋白，经3×ssc洗涤一次，20倍体积的0.4mmbindingbuffer洗涤3次，磁分离弃上清。
（3）在磁分离得到的复合物中加入0.5ml洗脱缓冲液（0.1m甘氨酸，0.5mnacl，ph3.0的0.05%tween20），晃动1min，收集洗脱缓冲液，立即加入250μl、ph为8.0、1m的tris-hcl中和，重复洗脱三次，混合三次洗脱中和液，透析除去盐离子，即得经过第1次纯化的人源ec-sod蛋白（人源ec-sod蛋白1）；
（4）用包被有ec-sod蛋白核酸适配体2的捕捉磁珠与纯化的人源ec-sod蛋白1结合，重复步骤（2）和（3）的即得到第2次纯化的人源ec-sod蛋白（人源ec-sod蛋白2）。
（5）经过n次，用n个人源ec-sod核酸适配体构建的捕捉琼脂磁珠纯化人源ec-sod蛋白，即得到高纯度的人源ec-sod蛋白。