一种环（亮氨酰-精氨酰）二肽盐的液相高纯度规模化合成方法与流程

本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种环(亮氨酰-精氨酰)二肽盐的液相高纯度规模化合成方法。

背景技术：

环(亮氨酰-精氨酰)二肽[cyclo(leu-arg)，简称clr]是一系列具有显著抗炎、抗癌、抗真菌作用的活性环二肽，其中cyclo(d-leu-d-arg)从人体伤口中的无色杆菌首次提取得到，在0.5μg/ml的浓度下创造了对金黄色葡萄球菌目前已知的最高活性记录，且与氨苄西林有协同抗菌作用；cyclo(l-leu-d-arg)能诱导乳腺癌细胞株madam-b23细胞凋亡和dna裂解，是首次分离并报道的对医学上重要的抗真菌和癌细胞的潜在药物来源的环二肽；cyclo(l-leu-l-arg)可热杀真菌镰刀菌和链霉菌，同样具有抗菌和抗真菌活性。近年来，随着对环(亮氨酰-精氨酰)二肽抗真菌和抗癌活性的不断研究，有望作为新的一类药物投入临床研究。

目前，环(亮氨酰-精氨酰)二肽的合成方法中，由于精氨酸侧链胍基的特殊性化学性质，使得其基本为pbf、pmc、mtr、mts等磺酰基类似物保护，原料价格昂贵，且脱保护需用到强腐蚀性的三氟乙酸、甲磺酸等，不易规模化，操作安全系数低，环境污染大，成本高昂。因此，开发一种环境压力小、操作安全、液相规模化绿色合成高纯度环(亮氨酰-精氨酰)二肽的方法成为研究重点之一。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有合成技术的不足，提供一种低成本绿色合成高纯度环(亮氨酰-精氨酰)二肽盐的方法。

针对上述目的，本发明所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、以四氢呋喃为溶剂，将boc-leu-oh或fmoc-leu-oh与n-羟基琥珀酰亚胺在n,n’-二环己基碳二亚胺或n,n’-二异丙基碳二亚胺作用下，常温搅拌反应8～12小时，过滤，向滤液中加入h-arg(no2)-ome的盐、碳酸氢钠或碳酸钠、水，在常温下搅拌反应4～6小时，分离纯化，得到boc-leu-arg(no2)-ome或fmoc-leu-arg(no2)-ome。

2、将boc-leu-arg(no2)-ome脱boc保护基或将fmoc-leu-arg(no2)-ome脱fmoc保护基后合环，得到cyclo[leu-arg(no2)]。

3、在钯碳和氢气条件下脱除cyclo[leu-arg(no2)]中no2保护基，并成盐得cyclo(leu-arg)二肽盐，即环(亮氨酰-精氨酰)二肽盐。

上述步骤1中，所述boc-leu-oh或fmoc-leu-oh、n-羟基琥珀酰亚胺、n,n’-二环己基碳酰亚胺或n,n’-二异丙基碳二亚胺、h-arg(no2)-ome的盐、碳酸氢钠或碳酸钠的摩尔比优选1:1.2～1.6:1.2～1.6:1.05～1.5，其中所述h-arg(no2)-ome的盐为h-arg(no2)-ome的盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐、磺酸盐中任意一种。

上述步骤2中，优选用氯化氢溶液或用三氟乙酸溶液脱除boc-leu-arg(no2)-ome的boc保护基，其中，所述氯化氢溶液为4～6mol/l的氯化氢乙酸乙酯溶液或氯化氢甲醇溶液或氯化氢丙酮溶液，所述三氟乙酸溶液为体积分数为20～50％的三氟乙酸丙酮溶液或三氟乙酸四氢呋喃溶液。将boc-leu-arg(no2)-ome脱boc保护基后，加入碱，常温搅拌合环，其中boc-leu-arg(no2)-ome与碱的摩尔比为1:2.5～4，所述的碱为哌啶、n-甲基吗啉、碳酸钠、碳酸钾中任意一种。

上述步骤2中，优选用哌啶的四氢呋喃溶液或哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液脱除fmoc-leu-arg(no2)-ome的fmoc保护基。

上述步骤3中，所述环(亮氨酰-精氨酰)二肽盐为环(l-亮氨酰-l-精氨酰)二肽盐、环(l-亮氨酰-d-精氨酰)二肽盐、环(d-亮氨酰-d-精氨酰)二肽盐中任意一种，其中所述的盐为乙酸盐或盐酸盐。

相比于现有的合成技术，本发明合成方法具有以下优点：

1、使用胍基被硝基保护的精氨酸甲酯和n-α保护的亮氨酸，避免了常规合成中缩合困难、环合后需要在强腐蚀性、强污染性体系中脱除侧链保护的缺陷，所用方法操作简单安全，绿色环保。

2、相对于传统的合成方法，环合条件温和简单，无需加热，避免了由于高温引起的手性变化，分离简单，无需色谱纯化。

3、相对于传统的合成方法，避免了环合以后需要析晶、色谱纯化、除盐、冻干的过程，所用方法步骤少，产品纯度高，易于规模化合成。

附图说明

图1是实施例2合成的环(l-亮氨酰-l-精氨酰)二肽乙酸盐的质谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

缩写和相关英文对应含义如下：

fmoc：9-芴甲氧羰基；boc：叔丁氧羰基；hosu：n-羟基琥珀酰亚胺；dcc：二环己基碳二亚胺；dmf：n,n-二甲基甲酰胺；leu：亮氨酸；arg(no2)：硝基精氨酸；arg：精氨酸；pd/c：钯碳；thf：四氢呋喃；nmm：n-甲基吗啉；tlc：薄层色谱分析。

实施例1

环(d-亮氨酰-d-精氨酰)二肽盐酸盐的合成

1、将23.1g(0.1mol)boc-d-leu-oh、13.8g(0.12mol)hosu和200mlthf加入到500ml三口瓶中，室温搅拌10分钟使其全部溶解，然后加入24.76g(0.12mol)dcc，搅拌反应10小时，过滤收集滤液，搅拌下向滤液中加入32.4g(0.12mol)d-arg(no2)-ome·hcl、100ml蒸馏水、21g(0.25mol)碳酸氢钠，室温搅拌反应5小时，tlc显示反应完全，过滤，滤液在30℃下减压蒸发脱除thf，残留物中加入200ml蒸馏水和100ml乙酸乙酯，搅拌5分钟，静置分液，水相用乙酸乙酯萃取(100ml×2次)，合并乙酸乙酯相，用0.5mol/l的盐酸水溶液洗涤至水相ph≈5，分液，乙酸乙酯相直接在30℃下减压蒸发脱除乙酸乙酯，得43.8g泡沫状白色固体，即boc-d-leu-d-arg(no2)-ome，收率98％。

2、将35g(78.39mmol)boc-d-leu-d-arg(no2)-ome加入到500ml单口瓶中，在0～10℃下加入180ml4mol/l的氯化氢乙酸乙酯溶液，室温搅拌反应3小时，tlc显示无原料，在30℃下减压蒸发脱除大量乙酸乙酯和氯化氢气体，得白色固体，向其中加入300mlthf和23.8g(0.235mol)nmm，室温反应10小时，tlc显示无中间体，在30℃下减压蒸发脱除thf，得淡黄色固体，淡黄色固体用80ml甲基叔丁基醚与石油醚体积比为1：2的混合溶剂搅拌1小时后过滤，固体用30ml该混合溶剂洗涤，真空干燥，得22.1g白色固体cyclo(d-leu-d-arg(no2))，收率89.7％。

3、将20g(63.6mmol)cyclo(d-leu-d-arg(no2))加入到250ml单口瓶中，加入120ml乙醇和3ml浓盐酸，搅拌下加入1.8g含水量10％的pd/c，氮气置换三次，室温反应6小时，tlc显示无原料剩余，滤出pd/c回收，滤液于40℃下减压蒸发至基本无馏分后用dcm带干两次，加入50ml乙酸乙酯，搅拌1小时，过滤，滤饼用20ml乙酸乙酯洗涤，真空干燥得17.4g白色固体cyclo(d-leu-d-arg)·hcl，即环(d-亮氨酰-d-精氨酰)二肽盐酸盐，收率89.43％。经质谱确认，产物正确。

实施例2

环(l-亮氨酰-l-精氨酰)二肽乙酸盐的合成

1、将20g(56.59mmol)fmoc-l-leu-oh、8.47g(73.57mmol)hosu和300mlthf加入到500ml三口瓶中，室温搅拌10分钟使其全部溶解，然后加入15.17g(73.57mmol)dcc，搅拌反应8小时，过滤收集滤液，搅拌下向滤液中加入22.89g(84.89mmol)l-arg(no2)-ome·hcl、100ml蒸馏水、21g(0.198mol)碳酸钠，室温搅拌反应6小时，tlc显示反应完全，过滤，滤液在30℃下减压蒸发脱除thf，残留物中加入200ml蒸馏水和100ml乙酸乙酯，搅拌5分钟，静置分液，水相用乙酸乙酯萃取(100ml×2次)，合并乙酸乙酯相，用2mol/l的盐酸水溶液洗涤至水相ph≈5，分液，乙酸乙酯相直接在30℃下减压蒸发脱除乙酸乙酯，得31.24g白色固体，即fmoc-l-leu-l-arg(no2)-ome，收率97.08％。

2、将30g(57.3mmol)fmoc-l-leu-l-arg(no2)-ome加入到500ml单口瓶中，加入250mlthf搅拌溶解后，加入60ml哌啶，室温搅拌反应6小时，在30℃下减压蒸发脱除thf，残留物用140ml甲基叔丁基醚与正己烷体积比为1：1的混合溶剂搅拌1小时后过滤，固体用50ml该混合溶剂洗涤，真空干燥，得14.6g白色固体cyclo[l-leu-l-arg(no2)]，收率88％。

3、将12.5g(39.76mmol)cyclo[l-leu-l-arg(no2)]加入到250ml单口瓶中，加入100ml甲醇和2ml冰乙酸，搅拌下加入2g含水量10％的pd/c，氮气置换三次，室温反应4小时，tlc显示无原料剩余，滤出pd/c回收，滤液于40℃下减压蒸发至基本无馏分后用dcm带干两次，加入100ml甲基叔丁基醚，搅拌2小时，有大量白色固体析出，过滤，滤饼用30ml甲基叔丁基醚洗涤，真空干燥得11.4g白色固体cyclo(l-leu-l-arg)·acoh，即环(l-亮氨酰-l-精氨酰)二肽乙酸盐，收率87.05％。经质谱确认(见图1)，产物正确。