本发明涉及疫苗生产过程中的多糖抗原的纯化，更具体的说是涉及一种b型嗜血杆菌荚膜多糖的纯化工艺。
背景技术：
多糖类疫苗(包括多糖结合疫苗)的生产过程大致相同，都经过菌种培养、发酵罐发酵、菌体分离、胞外多糖纯化等步骤。当前国际上针对b型嗜血杆菌荚膜多糖纯化普遍采用相同的方法即表面活性剂沉淀发酵液离心后的上清液获得复合多糖、复合多糖乙醇梯度沉淀去除核酸获得粗糖、粗糖酚抽提去除蛋白，乙醇沉淀后旋转蒸发干燥获得精糖。该方法在粗糖制造精糖的过程中，大量使用苯酚与乙醇、丙酮等有机溶媒。它们不仅对环境与生产人员的身体健康产生危害，而且对疫苗使用者的身体健康存在威胁。减少有机溶媒的使用，加强多糖纯化控制具有重要的现实意义。
在中国生物制品学杂志2013年9月第26卷第9期中《层析法纯化脑膜炎球菌a、c、y、w135群多糖工艺的建立》提出了一种利用采用流穿层析模式，经一步层析将多糖与其他杂质分离，再经sephodexg25脱盐后获得脑膜炎球菌多糖原液的方法。b型嗜血杆菌多糖与脑膜炎球菌多糖化学结构、带电性、分子大小都不同，不能利用该方法纯化获得符合国家药典的b型嗜血杆菌多糖。本专利工艺相比该方法，选择紫外检测器与时差检测器联用，解决了b型嗜血杆菌多糖在紫外-可见光检测无相应的问题；层析过程中，缓冲液中脱氧胆酸钠质量浓度高于1.5％，是实现b型嗜血杆菌多糖流穿的关键；层析后，使用切向流超滤膜包超滤代替sephodexg-25凝胶柱层析，切向流对多糖损害小、处理量大、耗时短，更具工业应用价值；增加了冻干工艺，直接对超滤浓缩液进行冻干，多糖更稳定。
中国专利cn201210037245.2，专利名为《一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法》，该专利公布了一种利用羟基磷灰石层析进行b型嗜血杆菌多糖纯化的方法。该方法不再使用苯酚进行蛋白去除，采用羟基磷灰石进行多糖纯化，去除蛋白。本专利工艺相比该方法，采用脱氧胆酸钠预处理初步降低了蛋白含量；使用deae与adhere复合模式(弱阴离子模式与疏水模式)柱串联，不同于羟基磷灰石层析原理；层析后，使用切向流超滤膜包超滤代替g-25凝胶柱，更具工业应用价值；增加了冻干工艺，直接对超滤浓缩液进行冻干，多糖更稳定。
中国专利cn201210121292.5，发明名称为《b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化工艺》，该专利公布了一种利用离子交换柱层析、高盐洗脱，sephadexg-25凝胶柱脱盐获得精糖原液的方法。本专利工艺相比该工艺，使用deae与adhere复合模式(弱阴离子模式与疏水模式)柱串联，不进行洗脱直接收集流穿溶液，不同于纯阴离子层析原理；层析后，使用切向流超滤膜包超滤代替sephodexg-25凝胶柱层析，切向流对多糖损害小、处理量大、耗时短，更具工业应用价值；增加了冻干工艺，直接对超滤浓缩液进行冻干，多糖更稳定。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种流穿层析法纯化b型嗜血杆菌荚膜多糖的工艺。
本发明通过预处理-串联deae-adhere复合模式层析柱层析-切向流超滤膜包超滤-冷冻干燥的方法进行b型嗜血杆菌荚膜多糖的纯化，减少了有机溶媒的使用，克服了传统工艺的不足，同时能生产出优于国家药典的精糖。
本发明的目的通过以下方案实现：
本发明所述的流穿层析法纯化b型嗜血杆菌荚膜多糖的工艺，包括以下步骤：
1)预处理：将粗多糖充分溶解于tris缓冲液中，向溶液中添加等体积的脱氧胆酸钠溶液，搅拌6小时以后中空纤维柱过滤，获得过滤液；
2)将过滤液通过deae柱与adhere柱串联的层析柱，收集流穿的层析液；
3)使用切向流超滤膜包对层析液进行超滤脱盐、浓缩，获得浓缩液；
4)将浓缩液冷冻干燥，获得絮状固体b型嗜血杆菌的荚膜多糖。
其中，步骤1)预处理：
粗多糖浓度在0.5～50mg/ml，优选2.5～5mg/ml，tris缓冲液浓度为20mmol/ltris，ph在7.5～8.5之间，添加的脱氧胆酸钠溶液中脱氧胆酸钠质量分数为3～4％，tris缓冲液浓度为20mmol/ltris，ph在7.5～8.5之间；中空纤维柱孔径为0.22～0.45，优选μm0.22μm。
其中，步骤2)层析
deae层析柱与adhere层析柱串联的长度比例为1：1～4，优选1：2，总柱高为5～100cm，优选40～80cm，上样量为0.2～1.5cv，优选0.25～1cv，流速在50～300cm/h，优选100～250cm/h；流穿过程中的缓冲液为脱氧胆酸钠溶液，脱氧胆酸钠质量分数为1.5％～2％，tris缓冲液浓度为20mmol/ltris，ph在7.5-8.5之间；使用检测器为紫外检测器与时差检测器联用；层析液收集判定条件为紫外检测器280nm波长无峰，示差检测器出现波峰时收集流穿层析液，当紫外280nm波长开始出峰时，停止收集流穿层析液。
其中，步骤3)超滤：
将层析溶液收集，超滤过程中添加室温下的注射用水，超滤方式为等体积超滤，超滤倍数为5～100倍，优选20～60倍，最后对溶液进行浓缩，浓缩至多糖浓度在10～40mg/ml，切向流超滤膜包型号为10～500kd，优选50～200kd。
其中，步骤4)冷冻干燥：
冷冻干燥阶段，压力保持在100pa以下，温度为-55℃，时间为48～72小时。
优选的，本发明所述的流穿层析法纯化b型嗜血杆菌荚膜多糖的工艺，包括以下步骤：
其中，步骤1)预处理阶段：
将浓度在2.5～5mg/ml粗多糖溶解于浓度20mmol/l的tris缓冲液中，溶液的ph在7.5～8.5之间，向溶液中添加等体积的脱氧胆酸钠溶液，添加的脱氧胆酸钠溶液中脱氧胆酸钠质量分数为3～4％，搅拌6小时以后中空纤维柱过滤，获得过滤液，中空纤维柱孔径为0.22μm。
其中，步骤2)层析：
将过滤液通过deae柱与adhere柱串联的层析柱，收集流穿的层析液；
deae层析柱与adhere层析柱串联的长度比例为1：2，总柱高为40～80cm，上样量为0.25～1cv，流速在100～250cm/h；流穿过程中的缓冲液为脱氧胆酸钠溶液，脱氧胆酸钠质量分数为1.5-2％，tris缓冲液浓度为20mmol/ltris，ph在7.5-8.5之间；使用检测器为紫外检测器与时差检测器联用；层析液收集判定条件为紫外检测器280nm波长无峰，示差检测器出现波峰时收集流穿层析液，当紫外280nm波长开始出峰时，停止收集流穿层析液。
其中，步骤3)超滤阶段：
将过滤液通过deae柱与adhere柱串联的层析柱，收集流穿的层析液；
超滤过程中添加注射用水，超滤方式为等体积超滤，超滤倍数为20～60倍，最后对溶液进行浓缩，浓缩至多糖浓度在10～40mg/ml，切向流超滤膜包型号为50～200kd；
其中，步骤4)冷冻干燥阶段：
将浓缩液冷冻干燥，获得絮状固体b型嗜血杆菌的荚膜多糖，其中冷冻干燥阶段，压力保持在100pa以下，温度为-55℃，时间为48～72小时。
b型嗜血杆菌荚膜粗糖属于现有产品，其制备方法按照国际通用制备工艺，参照文献(anderson，1977.infctionandimmunity.vol15.no.2，p472～477)培养b型嗜血杆菌，添加甲醛灭菌，发酵液离心。上清液添加ctab沉淀过夜，离心获得复合多糖。复合多糖氯化钙溶液解离，乙醇分部沉淀去除核酸，离心获得沉淀进行旋蒸获得粗糖。
本发明的有益效果在于以下方面：
1)通过预处理-串联deae-adhere复合模式层析柱层析-切向流超滤膜包超滤-冷冻干燥的方法进行b型嗜血杆菌荚膜多糖的纯化，减少了有机溶媒的使用，克服了传统工艺的不足。
2)串联deae-adhere层析柱层析，层析柱为复合模式层析柱(阴离子柱与疏水柱性质)对多糖的分离性更佳；层析过程为流穿模式，不通过洗脱，处理量高、层析时间短。
3)检测条件以示差检测器出现波峰时收集流穿层析液，当紫外280nm波长开始出峰时，停止收集流穿层析液，解决了b型嗜血杆菌荚膜多糖对紫外吸收无响应的问题。
4)切向流超滤膜包进行脱盐操作，相比于脱盐凝胶柱，处理量高，耗时短，可根据分子量进一步降低核酸、蛋白的含量。
5)超滤后直接冻干，相较于传统工艺的旋转蒸发，含水量可由20～40％降低至10～20％，多糖稳定性更高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
1)预处理：将粗多糖充分溶解于tris缓冲液中，向溶液中添加脱氧胆酸钠溶液，搅拌6小时以后中空纤维柱过滤，获得过滤液：
粗多糖浓度在2.5mg/ml，tris缓冲液浓度为20mmol/ltris，ph在8.5之间，添加的脱氧胆酸钠溶液中脱氧胆酸钠质量分数为3％，tris缓冲液浓度为20mmol/ltris，ph在8.5之间；中空纤维柱孔径为0.22μm。
2)过滤液通过deae柱与adhere柱串联的层析柱，收集流穿的层析液：
deae层析柱与adhere层析柱串联的长度比例为1：2，总柱高为60cm，上样量为0.25cv，流速在100cm/h；流穿过程中的缓冲液为脱氧胆酸钠溶液，脱氧胆酸钠质量分数为1.5％，tris缓冲液浓度为20mmol/ltris，ph在8.5之间；使用检测器为紫外检测器与时差检测器联用；层析液收集判定条件为紫外检测器280nm波长无峰，示差检测器出现波峰时收集流穿层析液，当紫外280nm波长开始出峰时，停止收集流穿层析液。
3)使用切向流超滤膜包对层析液进行超滤脱盐、浓缩，获得浓缩液：
将层析溶液收集，超滤过程中添加室温下的注射用水，超滤方式为等体积超滤，超滤倍数为30倍，最后对溶液进行浓缩，浓缩至多糖浓度在40mg/ml。切向流超滤膜包型号为50kd。
4)将浓缩液冷冻干燥，获得絮状固体b型嗜血杆菌的荚膜多糖。
冷冻干燥阶段，压力保持在50pa，温度为-55℃，时间为48小时。
实施例2
1)预处理：将粗多糖充分溶解于tris缓冲液中，向溶液中添加脱氧胆酸钠溶液，搅拌6小时以后中空纤维柱过滤，获得过滤液：
粗多糖浓度在5mg/ml，tris缓冲液浓度为20mmol/ltris，ph在7.5之间，添加的脱氧胆酸钠溶液中脱氧胆酸钠质量分数为4％，tris缓冲液浓度为20mmol/ltris，ph在7.5之间；中空纤维柱孔径为0.22μm。
2)过滤液通过deae柱与adhere柱串联的层析柱，收集流穿的层析液：
deae层析柱与adhere层析柱串联的长度比例为1：2，总柱高为80cm，上样量为0.5cv，流速在100cm/h；流穿过程中的缓冲液为脱氧胆酸钠溶液，脱氧胆酸钠质量分数为2％，tris缓冲液浓度为20mmol/ltris，ph在7.5之间；使用检测器为紫外检测器与时差检测器联用；层析液收集判定条件为紫外检测器280nm波长无峰，示差检测器出现波峰时收集流穿层析液，当紫外280nm波长开始出峰时，停止收集流穿层析液。
3)使用切向流超滤膜包对层析液进行超滤脱盐、浓缩，获得浓缩液：
将层析溶液收集，超滤过程中添加室温下的注射用水，超滤方式为等体积超滤，超滤倍数为40倍，最后对溶液进行浓缩，浓缩至多糖浓度在10mg/ml。切向流超滤膜包型号为100kd。
4)将浓缩液冷冻干燥，获得絮状固体b型嗜血杆菌的荚膜多糖。
冷冻干燥阶段，压力保持在80pa以下，温度为-55℃，时间为48小时。
通过本发明工艺所获得b型嗜血杆菌多糖各项指标与国家药典及现有专利(专利号：cn201210037245.2)进行比较结果如下：
可以发现本工艺所获得b型嗜血杆菌多糖各项指标均符合国家药典要求，且蛋白、核酸含量低于现有专利方法所获得的多糖。