循环microRNAs检测试剂盒和特异性检测循环microRNAs的方法及应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，涉及一种循环micrornas检测试剂盒，一种特异性检测循环micrornas的方法，及它们在检测循环micrornas中的应用。
背景技术：
：循环micrornas(mirnas)是一类长约19-23nt，内源性，非编码，存在于血清、血浆或尿液等体液中的细胞外游离状态的mirnas，它通过与其靶mrna分子的3’端非编码区(3’utr)互补结合，在翻译水平上调控基因的表达，因此mirnas广泛参与了生物体多种生理过程，如个体发育，细胞增殖、分化和凋亡，代谢与应激反应的调节，甚至疾病发生，包括肿瘤形成。mirnas还参与了肿瘤细胞重要的生物程序调控，间接地起着促癌基因和抑癌基因的功能，在肿瘤的发生和发展中起了至关重要的作用，因此mirnas被视为肿瘤早期诊断、预后和治疗的重要潜在生物标记物和靶标。循环mirnas具有短序列、高同源、低含量和极易降解的特性，因此在生物医学研究和早期临床诊断方面急需高效，特异的mirnas检测方法。传统的mirnas的检测方法主要有northernblot，微阵列和实时荧光定量pcr(real-timepcr)，这些检测方法不仅需要使用大型昂贵的仪器设备，操作繁琐，而且灵敏度低，特异差，因此很难普及。因此，亟需开发一种新的检测循环micrornas的方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种循环micrornas检测试剂盒和特异性检测循环micrornas的方法及应用。在基于sybrgold荧光核酸染料的条件下，采用双链特异性核酸酶介导的靶标循环反应和滚环扩增反应对循环mirnas进行特异性检测，既可以降低检测背景又可以起到双向信号放大的作用，具有操作简单、检测快速，灵敏度高、特异性好和成本低等特点。为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种循环micrornas检测试剂盒，该循环micrornas检测试剂盒包括以下组份：(1)具有粘性末端的发卡结构dna，所述发卡结构dna的一部分与目标microrna的至少一部分互补配对；所述互补配对使得发卡结构dna展开，与目标microrna形成mirna-dna杂交体；(2)双链特异性核酸酶及双链特异性核酸酶反应缓冲液；(3)环状dna探针，所述环状dna探针的一部分与发卡结构dna的一部分互补配对；(4)任选的以下组份之一：(4-1)sybrgold荧光核酸染料；(4-2)dna聚合酶；(4-3)dna聚合酶反应缓冲液；(4-4)4×dntps。本发明试剂盒中上述组分可单独提供，也可根据需要将部分组分以混合物形式提供。本发明的原理如图1所示，以目标microrna为mir-21为例。该检测体系包含了两步反应，当待检测物mir-21存在的时候，靶标mir-21首先会与发卡结构dna结合并将其展开形成能被双链特异性核酸酶识别和剪切的mirna-dna杂交体，双链特异性核酸酶将杂交体中的dna部分剪切掉后，靶标mir-21会被释放进入第一步反应的循环。而发卡结构dna中剩下的一段粘性末端与环状dna互补，因此在dna聚合酶和dntp的作用下会进行滚环扩增，产物是具有大量重复序列(与环状dna完全互补)的线状单链dna。最后将sybrgold荧光核酸染料加入该扩增体系中，通过荧光信号的强弱对比来判断靶标mirna含量的高低。在没有待检测物mir-21的时候，发卡结构dna将不会被打开，因此后续两步反应将无法进行，检测信号极弱。双链特异性核酸酶(duplex-specificnuclease，dsn)是一个商业化的耐热型核酸酶，它能够选择性降解双链dna(10-12bp)和dna-rna杂交体(15bp)中的dna，但是对单链dna，单链rna和双链rna无降解作用。而且该酶可以区分完全匹配和不完全匹配的dna杂交体，具有高的特异性。滚环扩增(rollingcircleamplification，rca)是借鉴自然界中环状dna分子滚环式的扩增机制发展起来的一种信号放大的检测方法。rca是恒温酶促反应，在恒定温度下以单链环状dna/rna为模板，通过特定的dna/rna聚合酶的作用，短的单链dna/rna引物被扩增成长的单链dna/rna，rca的产物含有成百上千个与环状模板互补串联重复序列，可用于极微量生物标记物的检测。sybrgolddye是一种低毒，稳定的商业化荧光核酸染料，自身荧光微弱，但是与核酸结合后(单链dna，单链rna，双链dna，双链rna),荧光信号可明显增强(1000倍)因此可以显著降低检测背景。根据本发明，基于上述原理的各种结构的发卡结构dna均可实现该效果。优选地，所述发卡结构dna的靠近长粘性末端的一部分与目标microrna的至少一部分互补配对；更优选地，所述发卡结构dna的长粘性末端开始的一部分与目标microrna完全互补配对；进一步优选地，所述发卡结构dna的长粘性末端的一部分与目标microrna的至少一部分互补配对的碱基个数为15-24。与此对应地，所述环状dna探针的一部分与发卡结构dna短粘性末端的一部分互补配对。本发明中所述“长粘性末端”和“短粘性末端”的概念能够为本领域技术人员理解，分别指粘性末端中突出的一端和未突出的一端。根据本发明一种具体实施方式，所述目标microrna为mir-21，具有如seqidno：1所示序列；所述发卡结构dna具有如seqidno：2所示序列；所述环状dna探针具有如seqidno：3所示序列。根据本发明，优选地，所述发卡结构dna以发卡结构dna的缓冲液的形式提供，其浓度为1nm-100nm；所述缓冲液例如tris-hcl缓冲液(100mmnacl，5mmmgcl2，ph7.4)。优选地，所述环状dna探针以环状dna探针的滚环扩增反应液的形式提供，其浓度为1nm-100nm。所述滚环扩增反应液可以为常规的各种适用于滚环扩增反应的反应液。本发明的第二方面提供一种特异性检测循环micrornas的方法，该方法包括以下步骤：1)将待测物与发卡结构dna混合，加入双链特异性核酸酶，进行酶解反应；2)向酶解反应产物中加入环状dna探针，进行滚环扩增；3)检测滚环扩增产物；其中，所述发卡结构dna具有粘性末端，其一部分与目标microrna的至少一部分互补配对；所述互补配对使得发卡结构dna展开，与目标microrna形成mirna-dna杂交体；所述环状dna探针的一部分与发卡结构dna的一部分互补配对。根据本发明，优选地，利用sybrgold荧光核酸染料检测滚环扩增产物。根据本发明，基于上述原理的各种结构的发卡结构dna均可实现该效果。优选地，所述发卡结构dna的靠近长粘性末端的一部分与目标microrna的至少一部分互补配对；更优选地，所述发卡结构dna的长粘性末端开始的一部分与目标microrna完全互补配对；进一步优选地，所述发卡结构dna的长粘性末端的一部分与目标microrna的至少一部分互补配对的碱基个数为15-24。与此对应地，所述环状dna探针的一部分与发卡结构dna短粘性末端的一部分互补配对。本发明中，步骤1)所述酶解反应可采用常规双链特异性核酸酶反应条件，例如50-60℃下孵育15-60分钟。本发明中，步骤2)中，滚环扩增条件可采用本领域常规反应条件，例如，在20-40℃孵育60-120分钟。本发明的第三方面提供上述循环micrornas检测试剂盒和/或上述方法在检测循环micrornas中的应用。利用本发明的试剂盒和方法对mirnas进行测定，不需要任何化学修饰，没有复杂的反应过程，也不需要昂贵的仪器，mirnas在该检测体系中可循环使用，操作简便，检测时间短，成本低，灵敏度高，特异性好，临床应用前景好。本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。附图说明通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。图1为本发明的检测原理示意图。图2示出了第一步反应产物的20％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。图3示出了整个检测体系反应产物的0.4％琼脂糖凝胶电泳结果。图4a和图4b示出了不同浓度靶标mir-21存在时的荧光光谱(a)和荧光强度(b)。图4a中，从上至下各谱线代表对照组、mir-21的浓度依次为1fm、10fm、100fm、1pm、10pm、100pm、1nm。图5示出了本发明检测体系特异性分析结果。图6a和图6b示出了本发明的检测体系用于检测乳腺癌细胞mda-mb-231和t47d中的mir-21的结果，其中，从上至下各谱线代表浓度为0、1ng/μl、2ng/μl、5ng/μl、10ng/μl。具体实施方式下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。通过以下实施例对本发明进行进一步说明。实施例中未注明的具体条件者，皆按照分子生物学常规操作条件或制造商建议的条件进行，各种常规试剂均可商购。试剂盒组成4a)检测溶液1：20mmtris-hclbuffer(100mmnacl,5mmmgcl2,ph7.4)(内含发卡结构dna探针hp：1nm-100nm)，双链特异性核酸酶(duplex-specificnuclease,dsn)0.1u/μl(含10×dsnmasterbuffer)。4b)检测溶液2：dna环状探针1nm-100nm,phi29dna聚合酶0.5u/μl(含rca反应液)，dntp：0.5mm。4c)sybrgold荧光核酸染料。表1本发明中使用的核酸(含dna和mirnas)序列aa发卡结构dna中下划线的碱基表示互补的序列，它们将形成发卡探针的互补区(茎区)。发卡结构dna中加粗的碱基表示靶标mir-21的互补区。环状dna探针中加粗的碱基表示发卡结构dna的互补区。m1、m2和m3中下划线的碱基表示mir-21的突变位点。操作步骤(a)将含有mirna的溶液与检测溶液1充分混匀后55℃孵育30分钟。(b)将检测溶液2加入到上述反应液(a)中，30℃孵育90分钟。(c)将sybrgold荧光核酸染料加入到上述反应液(b)中，用酶标仪读取荧光信号。测试例1对第一步反应的产物(即步骤(a)所得产物)进行20％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测试，结果如图2所示。当检测体系中只含有mir-21(1)、发卡结构dna(2)的时候不能启动第一步的反应，而且当检测体系中含有mir-21和双链特异性核酸酶(3)或含有发卡结构dna和双链特异性核酸酶时(4)，双链特异性核酸酶对靶标mir-21和发卡结构dna无降解作用。当检测体系中含有靶标mir-21和发卡结构dna的时候(5)只能启动第一步的部分反应。只有当检测体系中发卡结构dna，双链特异性核酸酶和靶标mir-21同时存在的时候(6)，才能完全启动第一步的反应。这些实验现象与图1所示检测原理相符，有力的证明了该技术方案的可行性。测试例2对整个检测体系的反应产物(即步骤(c)所得产物)进行0.4％琼脂糖凝胶电泳测试，结果如图3所示。当该检测体系中无靶标mir-21的时候，该体系不能进行双链特异性核酸酶介导的靶标循环反应和滚环扩增反应(1)，当该检测体系含靶标mir-21的时候才能进行双链特异性核酸酶介导的靶标循环反应和滚环扩增反应(2)，这一现象与该体系的检测原理相符，又进一步证明了该技术方案的可行性。测试例3该测试例用于测试该检测体系的灵敏度，特异性及在复杂生物样本中的应用。结果如图4所示，随着靶标mir-21浓度的升高，相应的荧光强度也逐渐增大。lgcmir-21的浓度在1-4的荧光强度可以画出标准校准曲线(b),该线性回归方程为荧光强度(λex＝485nm，λem＝544nm)＝297.5+36.21×lgcmir-21(线性相关系数r2＝0.991)，该检测体系对mir-21的检测限为1fm，说明本发明方法的灵敏度极高。测试例4该测试例用于说明本发明检测体系的特异性。如图5所示，含靶标mir-21的样品的相对荧光强度分别是1个、2个和3个碱基错配mir-21相对荧光强度的3倍、6.6倍和11.4倍。这一实验结果证明了该技术方案的特异性极高。测试例5该测试例用于说明该检测体系用于检测乳腺癌细胞mda-mb-231和t47d中的mir-21。提取乳腺癌细胞mda-mb-231和t47d中的总mirnas,用该方法对不同浓度总mirnas中的mir-21进行检测，如图6所示，说明该方法可以检测细胞中的mirna，具有一定的临床应用前景。测试例6该测试例用于说明该检测体系应用于实际检测样本时检测效果的评估。结果如表2所示，当该检测体系中含有10％的正常人血清时并不影响其检测结果，这一结果表明该技术方案可以在复杂的生物样本(血清)中进行mirnas的检测，具有非常好的应用前景和实用价值。表2在含有10％的正常人血清条件下检测mir-21(n＝3)样品实际加入值(pm)平均计算值(pm)b平均复原率(％)c相对标准偏差(％)d11012.25122.574.2925056.4156.412.263100117.23117.230.88bd三次独立的实验测得的值c平均复原率(％)＝100×(c平均计算值/c实际加入值)以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。序列表<110>深圳市乾康医药科技有限公司<120>循环micrornas检测试剂盒和特异性检测循环micrornas的方法及应用<130>1800234<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>rna<213>homosapiens<400>1uagcuuaucagacugauguuga22<210>2<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tcaacatcagtctgataagctaccatgtgtagaatgcttatc42<210>3<211>54<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3agcacaatctacacatcaaagcccatactacaacaactacaacattgatagata54<210>4<211>22<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4uagcuuaucagaccgauguuga22<210>5<211>22<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5uagcauaucagaccgauguuga22<210>6<211>22<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6uagcaaaucagaccgauguuga22当前第1页12