恒温检测细胞培养液中支原体污染的方法及试剂盒与流程

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种恒温检测细胞培养液中支原体污染的方法及试剂盒。

背景技术：

支原体是细胞培养过程中最常见和最不易觉察的污染物。支原体是一类缺乏细胞壁、具有高度多样性，大小介于细菌和病毒之间的一种原核生物，可通过常规的滤菌器，能够在培养基中独立存在，自行繁殖。支原体污染对细胞有多方面的影响，细胞被支原体污染之后，培养基ph值变化明显，培养基更换几小时就变为黄色，并且细胞内的dna、rna及蛋白表达发生变化，细胞状态变差，转染效率降低等等，这导致实验结果不准确。因此，在细胞培养过程中进行支原体检测和预防十分必要。

目前，检测细胞培养中支原体污染的方法有很多种，常用的有hoechstdna荧光染料法，直接培养法，酶联免疫吸附（elisa）实验法和聚合酶链式反应（pcr）方法等，每种方法各有利弊，相比较于其它方法，pcr法操作相对简单且检测灵敏度较高，能够在支原体污染早期检出，是目前最常用的支原体污染检测方法，但pcr法也有明显的缺点：pcr产物的电泳需要用到eb等致癌物质；需要用到pcr仪，电泳槽，凝胶成像仪等大型仪器；整个过程大约需要3个小时；并且由于核酸扩增技术的高灵敏度，扩增产物量很高，开盖操作极易造成气溶胶污染，造成后续检测的假阳性。

rpa是一种快速灵敏的新型恒温扩增技术，依赖重组酶、单链结合蛋白和链置换dna聚合酶这三种酶的协同作用使得扩增在37-42℃的恒温下进行，具体扩增原理为：首先重组酶与引物结合形成的重组酶-引物复合体，该复合体能在双链dna中寻找同源序列，一旦引物定位到同源序列，就会发生链置换反应并在dna聚合酶的帮助下启动dna合成，同时被置换下来的dna链与单链结合蛋白结合，防止进一步替换，通过此过程的循环可实现目标片段的指数式扩增，整个过程非常快，一般可在10-20分钟内获得可检出水平的扩增产物。rpa具有快速、灵敏、简便的优点，并且体系非常稳健，可直接利用粗提取的核酸样本进行扩增，是现场检测非常好的选择。

最近，张锋课题组基于rna引导和rna靶向的核酸内切酶cas13a的旁路切割效应结合rna扩增，建立了基于crispr的核酸检测方法sherlock，sherlock检测灵敏度高，可以达到单分子检测水平，特异性强，检测靶序列rna非常方便；doudna和中科院王金课题组使用crispr系统的另外一种核酸内切酶cas12a，将核酸扩增和cas12a检测反应相结合，建立了detectr和holmes检测体系，可用于dna的快速检测。原理是，首先通过pcr的方法大量扩增得到包含靶序列的片段，然后将扩增产物加入cas12a检测体系中（包括crrna，cas12a蛋白，ssdna探针），一旦cas12a和crrna复合体识别切割靶序列之后，可以触发对于非特异性单链的切割活性，检测体系中的单链报告分子被切割，发出荧光，从而确认靶序列的存在，可用于dna病毒和snp的检测。该检测方法不需要昂贵的试剂和特殊仪器，成本低，操作简便，但需要开盖操作，及易造成气溶胶污染。因此，开发一种密闭的一体化检测体系，将扩增反应和结果观察相结合，同时满足特异性、灵敏度、快速、低成本和简单操作的要求显得越来越重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种一体化的检测细胞培养液中支原体污染的方法和试剂盒，使支原体检测反应在不打开反应容器的情况下进行检测过程和结果判定。

本发明提供的检测细胞培养中支原体污染的方法，称为一步法，具体步骤如下：

（1）构建一体化检测的反应体系，体系中包含：rpa恒温扩增反应成分，特异性扩增支原体16srrna保守区域dna序列的引物对，rna酶抑制剂，cas12a蛋白，靶向目标序列的crrna和单链dna报告分子，记为记为ssdna；

（2）取1ml细胞培养上清液，95℃~98℃加热培养2min~5min，取1ul作为检测样品加入到24ul一体化检测体系中，37℃经过反应25min~45min，通过蓝光切胶仪直接观察检测体系荧光变化进行支原体检测；发黄绿色荧光说明有支原体污染，不发光说明没有支原体污染。

其中：

所述特异性扩增支原体16srrna保守区域dna序列的引物对序列为：

rpa-mycoplasma-f:ggagcaaacaggattagataccct；（seq.id.no1）

rpa-mycoplasma-r:cattttacgacacgagctgacgacaaccatgcacc；

（seq.id.no2）；

所述rna酶抑制剂为ribonucleaseinhibitor（takara）；

所述靶向目标序列的crrna序列为：mycoplasma-crrna：

uaauuucuacuguuguagaucgacacgagcugacgacaaccaug；（seq.id.no3）

所述单链报告分子序列为：5‘6-fam-ttatt-3’bhq1；

所述的crrna可以直接合成，也可以由t7体外转录得到。体外转录体系中引物对序列为：

t7-mycoplasma-f:gaaattaatacgactcactataggg；（seq.id.no4）

t7-mycoplasma-r2：

catggttgtcgtcagctcgtgtcgatctacaacagtagaaattccctatagtgagtcgtattaatttc；（seq.id.no5）。

反应体系中：特异性扩增支原体16srrna保守区域dna序列的引物反应浓度为0.36um；扩增片段长度为300bp；crrna浓度为1000nm；ssdna浓度为200nm；

反应体系中，rpa（twistampbasickit）反应组分中的反应催化剂mgoac被buffer2.1(neb)代替。

本发明中，优选一体化反应体系为25ul，包括14.75ul水化twistampbasickit反应干燥球，0.9ul10mmrpa-mycoplasma-f（seq.id.no1）和rpa-mycoplasma-r（seq.id.no2），0.375ulribonucleaseinhibitor（takara），3.5ulbuffer2.1（neb），1ul检测样品，1000nmcrrna（seq.id.no3），250nmcas12a蛋白，200nmssdna，超纯水补至总体积为25ul。

本发明还提供恒温检测支原体污染的试剂盒，该试剂盒中含有：

rpa扩增组分：水化twistampbasickit反应干燥球，特异性rpa扩增引物（seq.id.no1和seq.id.no2），1ul检测样品；

cas12a切割检测组分：ribonucleaseinhibitor（takara），buffer2.1（neb）,crrna（seq.id.no3），cas12a蛋白，ssdna。

本发明试剂盒中，优选反应体系为：

rpa扩增组分：14.75ul水化twistampbasickit反应干燥球，0.9ul10mmrpa-mycoplasma-f（seq.id.no1）和rpa-mycoplasma-r（seq.id.no2），1ul检测样品；

cas12a切割检测组分：0.375ulribonucleaseinhibitor（takara），3.5ulbuffer2.1,1000nmcrrna（seq.id.no3），250nmcas12a蛋白，200nmssdna；

超纯水补至总体积为25ul。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明将核酸扩增和cas12a切割检测放到一个反应体系中，无需打开反应容器就可以实验对检测结果的裸眼观测，大大降低气溶胶污染问题；

2.该反应操作简便，使用rpa恒温扩增，不需要大型仪器，也不需要pcr产物的电泳检测，就可以实现细胞培养过程中的支原体检测；

3.本发明通过rpa扩增和cas12a非靶向切割两步反应扩大检测信号。

附图说明

图1为本发明恒温检测支原体污染方法的实验操作流程示意图。

图2为使用普通pcr方法检测6个样本琼脂糖电泳图。其中，最左侧泳道为100bpdnaleader；泳道1-6为所检测样品，其中泳道2，5，6为被支原体污染样品，1，3，4没有被支原体污染，7为阴性对照。

图3为将图2中所示阳性条带胶回收，进行sangar测序，测序比对结果显示确实是支原体16srrna基因组序列。

图4为使用本发明所述方法检测相同的样品结果。其中，2，5，6有黄绿色荧光表示被支原体污染，1，3，4没有黄绿色荧光表示没有被污染，7为阴性对照。

图5为使用本发明方法检测3个样本的实验结果。其中，1号样本为支原体污染的细胞样品，2号样本为没有被支原体污染的哺乳动物基因组，3号样本为细菌基因组，4号样本为阴性对照。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为本发明的限制。

若未特别指出，本发明所使用的实验技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明所使用的rpa扩增试剂盒为twistampbasickit购自英国twist公司；cas12a蛋白购自neb，t7体外转录试剂盒为hiscribet7highyieldrnasynthesiskit，购自neb，单链dna报告分子由上海生工合成，引物由苏州金唯智公司合成，rna酶抑制剂购自takara公司，蓝光切胶仪为b-boxbluelightled。

实施例1：利用本发明所述一步法恒温检测支原体污染方法，具体包括如下步骤：

（1）准备检测样品，取细胞培养上清，98℃加热2min，取1ul作为检测样品；

（2）配置一体化检测体系，反应体系为25ul，包括14.75ul水化twistampbasickit反应干燥球，0.9ul10mmrpa-mycoplasma-f和rpa-mycoplasma-r，0.375ulribonucleaseinhibitor，3.5ulbuffer2.1，1000nmcrrna，250nmcas12a，200nmssdna，加水补至24ul；

（3）取1ul检测样品加入检测体系中，37℃恒温反应30min；

（4）结束反应后，将pcr管置于蓝光切胶仪上，裸眼观察，有荧光则证明样品有支原体污染，没有荧光则表明样品没有被支原体污染。

检测结果如图3所示，1，2，4有黄绿色荧光表示被支原体污染，3，5没有黄绿色荧光表示没有被污染，6为阴性对照。

实施例2：使用普通pcr方法检测支原体污染

使用普通pcr扩增方法对同样的样品进行支原体检测，检测步骤如下：

（1）配置检测的pcr体系，反应体系为20ul，包括0.4ul10mm扩增引物，10ul2xtaq酶mix，加水补到19ul；

（2）取1ul检测样品加入反应体系中，进行pcr扩增反应，反应条件为：

95℃预变性5min

68℃延伸30s

68℃延伸5min；

（3）进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定实验结果。

值得注意的是，该反应中用到的特异性扩增支原体16srrna保守区域dna序列的引物为文献中报导的引物：

f：caccatctgtcactctgttaa（seq.id.no6）；

r：ggagcaaacaggattagatac（seq.id.no7）。

实施例3：本发明所述一步法恒温检测支原体方法检测特异性判定

反应前试剂准备，25ul反应扩增液（包含14.75ul水化twistampbasickit反应干燥球，0.9ul10mmrpa-mycoplasma-f和rpa-mycoplasma-r，0.375ulribonucleaseinhibitor，3.5ulbuffer2.1，1000nmcrrna，250nmcas12a，200nmssdna，加水补至24ul）

取未被支原体污染的细胞基因组和细菌基因组作为检测样本，加入到检测体系中；

检测步骤同实施例1；

结果均未出现黄绿色荧光，表明本发明所述一步法恒温支原体检测方法，可以特异性检测支原体污染。

序列表

<110>复旦大学

<120>恒温检测细胞培养液中支原体污染的方法及试剂盒

<130>001

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggagcaaacaggattagataccct24

<210>2

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cattttacgacacgagctgacgacaaccatgcacc35

<210>3

<211>44

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

uaauuucuacuguuguagaucgacacgagcugacgacaaccaug44

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gaaattaatacgactcactataggg25

<210>5

<211>68

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

catggttgtcgtcagctcgtgtcgatctacaacagtagaaattccctatagtgagtcgta60

ttaatttc68

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

caccatctgtcactctgttaa21

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ggagcaaacaggattagatac21