一种细胞培养多环境因子的最优控制方法与流程

本发明涉及细胞培养的应用领域，影响细胞生长的环境因子非常多，本发明特别涉及一种细胞培养多环境因子的最优控制方法，综合控制细胞培养的多环境因子。

背景技术：

细胞培养目前已成为应用于生命科学的主要技术之一，细胞培养的环境系统是一个非线性、强耦合且复杂性高的系统，影响细胞生长的环境因子有例如剪切力、渗透压、溶氧、ph值、生长因子等。中国专利申请号为cn201320697500.6的文献中提出了一种可监测细胞培养液体环境的细胞培养装置，该装置可以实时监测细胞培养装置中溶解氧浓度，但只是单纯地监测细胞的溶氧度，局部地监测细胞环境参数，没有涉及综合控制细胞培养的多环境因子，中国专利申请号为cn200510134489.2的文献中提出了一种细胞培养装置，该装置大量迅速培养，获取细胞，但并没有研究使细胞生长最佳的影响参数，中国专利申请号为cn201720021655.6的文献中提出了一种检测细胞培养环境中的温度、氧气含量、二氧化碳含量以及培养液中的ph值，但无法提前得知细胞生长最优的环境因素，没有缩短实验研究时间。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提出了一种细胞培养多环境因子的最优控制方法，构建出葡萄糖浓度、溶氧、ph值以及剪切力等环境因子与细胞生长之间的关系，求取出最佳的环境因子，使得细胞生长最佳，在以后的实验中就可利用这些环境因子的数值推算出预期的细胞生长状况。

本发明是通过以下技术方案实现上述技术目的：包括如下步骤：

步骤1)：获取不同葡萄糖浓度l、ph值h、溶氧浓度o、剪切力τ的培养液，进行细胞培养；

步骤2)：拍摄细胞的生长图并将图像传输给上位机，得到不同的葡萄糖浓度l、ph值h、溶氧浓度o、剪切力τ的环境下细胞生长的细胞生长率μ；

步骤3)：以葡萄糖浓度l、ph值h、溶氧浓度o、剪切力τ作为输入，以细胞生长率μ作为输出构建bp神经网络数学模型μ＝f(l，o，h，τ)，即细胞生长的适应度函数c＝f(l，o，h，τ)；

步骤4)：将葡萄糖浓度l分成个2^p等级，作为个体基因的前p位二进制；将溶氧浓度o分成个2^q等级，作为个体基因的p位后的q位二进制；将ph值h分成个2^r等级，作为个体基因的q位后的r位二进制；将剪切力τ分成个2^s等级，作为个体基因的最后的s位二进制；共有2^p+q+r+s种个体，每个个体有p+q+r+s位二进制编码；

步骤5)：产生初始化群体，经复制、交叉、变异，输出的个体基因分成四段提取，前p位为葡萄糖浓度l，q位为溶氧浓度o，r位为ph值h，最后s位为剪切力τ，得到最优环境因子数值。

本发明与已有方法相比，具有如下优点：

1、本发明利用bp神经网络算法构建出细胞生长率与葡萄糖浓度、溶氧浓度、ph值以及剪切力等环境因子的数学模型，然后用遗传算法寻找最优的环境因子，在实际的细胞培养中，根据最优的环境因子进行控制细胞培养，避免了复杂的摸索实验，使投入的人力，物力，财力等最少。

2、本发明在寻找对细胞生长有影响的环境因子的最优组合时采用了遗传算法，葡萄糖浓度，ph值以及溶氧，剪切力等环境因子都对细胞生长有所影响，使用遗传算法寻找最优的环境因子，使细胞生长最佳。遗传算法具有良好的全局搜索能力，可以快速地将解空间中的最优解搜索出来，且过程简单，不需要人力介入。

3、本发明利用注射泵进行营养液的进给，并且模型的构建以及遗传算法的寻优都是通过上位机实施的，不需要人工参与，自动化程度高，降低成本。

附图说明

图1是实现本发明一种细胞培养多环境因子的最优控制方法所采用的细胞培养实验装置的整体结构示意图；

图2是细胞的生长曲线图；

图3是本发明的工作流程图；

附图中各部件的序号和名称：1.注射泵；2.第一注射器；3.第二注射器；4.营养液进液槽；5.细胞培养仓；6.半透膜；7.废液收集仓；8.空气发生器；9.配制的营养液；10.培养液；11.细胞。

具体实施方式

参见图1，细胞培养实验装置主要由注射泵1、第一注射器2、第二注射器3、营养液进液槽4、细胞培养仓5、半透膜6、废液收集仓7以及空气发生器8组成。注射泵1连接第一注射器2和第二注射器3，圆环形的半透膜6置放在细胞培养仓5的正中间，将细胞培养仓5分隔成内腔室和外腔室，内腔室是半透膜6内部，外腔室是半透膜6外壁与细胞培养仓5内壁形成的圆环形腔室。营养液进液槽4与废液收集仓7则通过管道连接在细胞培养仓5的外部。第一注射器2将细胞11注射进入半透膜6内，第二注射器3将配制好的营养液9注入营养液进液槽4内，营养液进液槽4通过管道连通细胞培养仓5的外腔室。注射泵1能控制细胞11和营养液9的进给速率。营养液进液槽4内部还通过管道连接空气发生器8。当注射完配制的营养液9后，空气发生器8向营养液进液槽4内输送氧气，此时形成了细胞生长所需的培养液10，培养液10通过导管流入细胞培养仓5的外腔室，培养液10的物质经半透膜6进入到细胞培养仓5的内腔室，开始进行细胞培养，当细胞脱落后，废液则进入废液收集仓7。

参见图2所示的细胞生长曲线图，利用显微镜观察细胞的生长状况，摄像机与显微镜连接，主要提取图1所示的培养液10中细胞培养过程中的细胞图像，并且与上位机连接，将图像传输给上位机，上位机进行图像处理，统计出细胞数量，画出细胞生长曲线图。在细胞培养过程中，细胞经历了四个阶段，一般可分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期，上位机得到细胞在不同时间的数目，然后以培养时间为横坐标存活的细胞数为纵坐标作图，即可得到图2所示的细胞的生长曲线图。根据细胞生长曲线图可以知道，在(t1,t2)阶段，细胞处于对数期，在对数期中，利用细胞生长率μ来表达细胞的生长情况，此时细胞的生长率μ通过公式(1)计算，其中t1、t2分别为细胞开始进入对数增长期与稳定期的时间，且细胞数目分别为n1、n2。

参见图3，本发明采用细胞培养实验装置进行实验时的具体控制步骤如下：

步骤1：获取不同葡萄糖浓度、ph值、溶氧浓度的培养液10，从而进行细胞培养，从而研究葡萄糖浓度，ph，溶氧值等环境因子对细胞的生长的影响。取高糖培养基v毫升，然后在培养基中添加配置好的葡萄糖溶液，使葡萄糖的浓度分别达到l1,l2,l3,….ln的n个不同的浓度梯度，然后在含有不同葡萄糖浓度的培养基中加入不同浓度的碳酸氢纳缓冲液，再在培养基中加入维生素、血清、氨基酸等细胞生长所需的物质，然后摇晃混匀，杀菌消毒，接着利用ph试纸测量营养液的ph值，得到测量值分别为h1,h2,h3,….hn，n个不同ph值，最终得到配制完成多组不同的葡萄糖浓度、ph值的营养液9。

当配制好不同的葡萄糖浓度、ph值的营养液9后，第一注射器2以v的注射速率将细胞11注入细胞培养仓5内，第二注射器3以不同的进给速率q1,q2,q3,….qn将配制好的营养液9注射入营养液进液槽4中，然后利用空气发生器8向营养液进液槽4内输送不同的溶氧浓度o1,o2,o3,….on的氧气，从而获取得到细胞生长所需的培养液10。培养液10通过导管进入半透膜6的外部，培养液10的营养物质通过半透膜6不断扩散至细胞培养仓5内，为细胞生长提供新鲜的营养物质，开始进行细胞培养。

当细胞在培养仓5中培养时，上述中不同的营养液的进给速率会对细胞产生不同的剪切力，而细胞的剪切力会影响到细胞的生长，利用不同的营养液进给速率q1,q2,q3,….qn，根据公式2计算出不同的剪切力为τ1,τ2,τ13,….τn。其中τ是剪切力，q是营养液进给速率，η是营养液动力粘度，w是培养仓5的水平宽度，h是培养仓高度。

步骤2：当细胞贴壁后，每隔一段时间，利用摄像机拍摄细胞的生长图，然后将图像传输给上位机，上位机通过图像处理技术计算得到细胞的数目，然后画出以时间为横坐标，细胞的数目则为纵坐标的细胞生长曲线图，再根据公式(1)计算得出在步骤1得到的不同的葡萄糖浓度、溶氧、ph值和剪切力的环境下生长的细胞生长率μ1,μ2,μ3,….μn。

此时上位机在已经得到了一系列的不同的葡萄糖浓度、ph值、溶氧浓度、以及剪切力的环境因子的情况下，所对应的不同的细胞生长率μ，将获取的这些数值作为下述步骤3所用的样本数据。

步骤3：利用bp神经网络构建细胞生长的适应度函数。采用遗传算法寻找最优的环境因子时，最重要的是寻找遗传算法中的适应度函数，由于为了研究细胞生长的最佳，即可让适应度值等于细胞生长率，所以构建细胞生长的适应度函数即是利用bp神经网络构建细胞生长率与环境因子的数学模型。

根据步骤1和步骤2，已经得到不同环境因子对应的不同的细胞生长率的数值，以葡萄糖浓度l(l1,l2,l3,….ln)，溶氧o(o1,o2,o3,….on)、ph值h(h1,h2,h3,….hn)、剪切力τ(τ1,τ2,τ13,….tn)四个环境因子作为bp神经网络的输入，以细胞生长率μ(μ1,μ2,μ3,….μn)作为输出进行模型构建，利用bp神经网络构建数学模型，从而得出不同环境因子与细胞生长率的数学关系式μ＝f(l，o，h，τ)。具体步骤如下：上位机对步骤1和步骤2得到的环境因子以及细胞生长率进行归一化处理，使其五个量处于[0,1]区间。为了能够更准确地反映细胞的生长状况，并保证数据的准确性，选取一部分样本作为训练样本，一部分为测试样本，训练样本用于创建bp神经网络模型，测试样本用于修正该模型。以训练样本中葡萄糖浓度、溶氧浓度、ph值、剪切力作为bp神经网络的输入变量，以细胞生长率作为神经网络的输出变量，建立bp神经网络模型，以测试数据样本对该模型进行测试修正，通过修正该模型相关参数，使得实际测量值与模型输出值之间的相对误差尽可能的小，最终完成整个bp神经网络的训练过程，得到环境因子与细胞生长率之间的数学模型μ＝f(l，o，h，τ)，即细胞生长的适应度函数为c＝f(l，o，h，τ)。

步骤4：参数的分类与编码；利用算法将参数转换遗传空间的由基因按一定结构组成的基因个体。

1)将葡萄糖浓度l分成个2^p等级，作为个体基因的前p位二进制，通过营养液的配制，控制葡萄糖浓度的数值均在细胞允许生长的范围内，lg＝lmax-a×g，g＝0,1,2,…..2^p，式中lg是等级g时的葡萄糖浓度值，lmax是细胞生长允许的最大葡萄糖浓度值，a是两相邻等级之差。

2)将溶氧浓度o分成个2^q等级，作为个体基因的p位后的q位二进制，通过营养液的配制，控制溶氧的数值均在细胞允许生长的范围内，oj＝omax-b×j,j＝0,1,2,…..2^q，式中oj是等级j时的溶氧值，omax是细胞生长允许的最大溶氧值，b是两相邻等级之差。

3)将ph值h分成个2^r等级，作为个体基因的q位后的r位二进制，通过营养液的配制，控制ph值保证细胞正常生长，hk＝hmax-k×e,k＝0,1,2,…..2^r，式中hk是等级k时的ph值，hmax是细胞生长允许的最大ph值，e是两相邻等级之差。

4)将剪切力τ分成个2^s等级，作为个体基因的最后的s位二进制，通过不同的营养液进给速率注射营养液，从而控制剪切力，τt＝τmax-t×x,t＝0,1,2,…..2^s，式中τt是等级t时的剪切力数值，τmax是细胞生长允许的最大剪切力，x为两相邻等级之差。

由此，葡萄糖浓度l、溶氧浓度o、ph值h、剪切力τ四个参数组合一共有2^p+q+r+s种个体，每个个体一共有p+q+r+s位二进制编码，从左到右分别为葡萄糖浓度l、溶氧浓度o、ph值h、剪切力τ的数值。

步骤5：产生初始化群体。上位机设置初始化进化代数d＝0，设置最大进化代数dmax，设置交叉概率为pc，设置变异概率为pm。上位机从2^p+q+r+s种可能中随机选择n个个体组成群体t0，并对其进行编号，从个体1到个体n，

步骤6：上位机初始化个体计数参数i＝1。将个体i的基因转换成四个参数的十进制形式，并结合步骤3所构建的细胞生长的适应度函数c＝f(l，o，h，τ)进行计算，得到基因个体的适应ci。

步骤7：终止条件判断。上位机将进化代数d加1，然后判断d>dmax是否成立，如果不成立，执行下面的步骤8；如果成立则将进化过程中所得到的具有最大适应度的个体基因作为最优解输出，执行下面的步骤10。

步骤8：上位机进行复制、交叉、变异运算。上位机进行复制操作。每次从群体t中随机选定1个个体，并将其染色体复制，每个个体被选中的概率为pi，重复n次，得到一个种群t1。pi是每个个体的适应度值占总适应度的比例，已知群体大小为n，个体i的适应度值为ci，则个体i被选中的概率pi为：

上位机进行交叉操作，按交叉率pc所决定的交叉的染色体数c，从群体t1中随机确定c个染色体进行交叉操作：交叉操作前将选择得到的n个个体以随机的方式组成n/2对配对个体组，实行交叉时，该由pc所决定的交叉点后的两个个体的部分结构进行互换，生成两个新个体，重复n/2次，用产生的新染色体代替原染色体，得到群体t2。

上位机进行变异操作，按变异率pm所决定的变异次数m，从t2中随机确定m个染色体，分别进行变异操作，用产生的新染色体代替原染色体，得到群体t3。

步骤9：将群体t3作为新一代种群，即用t3代替t0，转到步骤6。

步骤10：上位机将输出的个体基因分成四段提取，得到最优的组合，前p位为葡萄糖浓度，q位为溶氧值，r位为ph值，最后s位为剪切力，并将最优组合的四个参数，即葡萄糖浓度、溶氧浓度、ph值、剪切力以十进制形式保存在上位机中，最终得到了需要的最优的环境因子数值，从而使细胞生长最佳。

步骤11：在得到最优的组合后，通过实验装置按照步骤10得到的最优环境因子的数值进行细胞控制，开始细胞培养，从而得到细胞最佳生长状况。