抗病毒药物筛选方法及其应用与流程

本发明涉及药物筛选技术领域，尤其是涉及一种抗病毒药物筛选方法及其应用。

背景技术：

现有的抗病毒药物筛选系统是将病毒转录复制相关的基因和荧光素酶报告基因构建于真核表达载体上，然后共转染宿主细胞，再用荧光检测设备来检测药物对荧光强度的影响，从而筛选出有效的抗病毒药物。如抗埃博拉病毒药物筛选系统和抗流感病毒药物的筛选系统；还有针对病毒包膜的特定蛋白，涉及病毒的组织亲嗜性，比如针对流感病毒神经氨酸酶na的磁珠法筛选系统。

然而，现有筛选系统只能筛选出针对病毒感染某个阶段的抗病毒药物，比如装配阶段，而对于其他阶段如吸附，脱壳等，还需要设计其他的筛选系统；病毒通过基因工程加入报告基因后，会导致结构改变，并不能完全模拟活病毒的感染；针对不同病毒需要设计不同的病毒复制质粒或假病毒以及报告基因，且操作过程比较复杂。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种抗病毒药物筛选方法，该筛选方法操作简单，成本低，筛选通量大，完全模拟活病毒的感染过程，能够筛选出针对病毒复制所有阶段的抗病毒药物，能够解决上述问题中的至少一种。

本发明的第二个目的在于提供抗病毒药物筛选方法在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用，制备出新的抗病毒药物用于治疗因病毒感染而导致的疾病。

为了解决上述技术问题，特采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种抗病毒药物筛选方法，包括以下步骤：将病毒吸附至单层细胞后，覆盖培养基并加入待筛选药物进行孵育；

然后将细胞进行固定和染色现出空斑，通过观察空斑来筛选抗病毒药物。

作为进一步技术方案，所述病毒为具有完全感染能力的活病毒；

优选地，所述病毒包括动物病毒；

优选地，所述动物病毒包括肠道病毒、疱疹病毒、轮状病毒和流感病毒中的至少一种；

优选地，所述病毒的加入量为使每平方厘米单层细胞产生5～25个空斑；

优选地，所述病毒的加入量为使每平方厘米单层细胞产生10～20个空斑；

优选地，所述病毒吸附的时间为0.8～1.2h，优选为1h。

作为进一步技术方案，所述细胞包括动物细胞；

优选地，所述动物细胞包括肠上皮细胞、羊膜细胞和成纤维细胞中的至少一种。

作为进一步技术方案，所述培养基包括微晶纤维素；

优选地，微晶纤维素在培养基中的浓度为0.3％～1.5％，优选为1.2％。

作为进一步技术方案，所述待筛选药物的浓度为50～1000μm，优选为50～150μm；

优选地，所述待筛选药物的加入量为0.8％～1.2％(v/v)，优选为1％(v/v)。

作为进一步技术方案，所述固定所用到的固定液包括中性甲醛固定液、乙醇固定液和多聚甲醛固定液中的至少一种，优选为中性甲醛固定液；

优选地，中性甲醛固定液的浓度为4％～10％，优选为8％；

优选地，中性甲醇固定液的加入量为80％～120％(v/v)，优选为100％(v/v)；

优选地，中性甲醛固定液的固定时间为0.8～1.2h，优选为1h。

作为进一步技术方案，所述染色包括中性红染色、结晶紫染色和苏木精-伊红染色，优选为中性红染色；

优选地，中性红溶液的浓度为0.1％～1.5％，优选为0.3％。

作为进一步技术方案，所述染色后还包括清洗和晾干的步骤。

作为进一步技术方案，所述单层细胞的培养皿包括6孔、12孔、24孔、48孔和96孔培养板，优选为96孔培养板；

优选地，96孔培养板上每种药物设2～4个复孔；

优选地，96孔培养板上不加药物的对照孔至少为3个。

第二方面，本发明提供了一种抗病毒药物筛选方法在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的抗病毒药物筛选方法，通过将病毒吸附至单层细胞后，覆盖培养基并加入待筛选药物进行孵育，然后将细胞进行固定和染色，通过观察空斑来筛选抗病毒药物。本发明的筛选方法操作简单，不需要额外设计和构建报告基因系统，不涉及质粒构建和转染，不涉及单克隆抗体；并且该方法成本低，试剂廉价，低耗材，不需要使用其他的大型高端设备；此外，还具有筛选通量大的优点，能够同时实现对几十种药物的筛选；本发明提供的筛选方法完全模拟活病毒的感染过程，能够准确高效地筛选出针对病毒复制所有阶段的抗病毒药物，能够缓解现有抗病毒药物筛选方法筛选范围小，工艺繁琐，成本高的技术问题。将本发明提供的抗病毒药物筛选方法应用于制备治疗病毒感染性疾病的药物中，用于治疗因病毒感染而导致的疾病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的空斑形成流程图；

图2为本发明实施例1提供的病毒唑抑制ev-a71病毒空斑形成图；

图3为本发明实施例2提供的结果判读示意图。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，在一些具体的实施方式中提供了一种抗病毒药物筛选方法，包括以下步骤：将病毒吸附至单层细胞后，覆盖培养基并加入待筛选药物进行孵育；

然后将细胞进行固定和染色现出空斑，通过观察空斑来筛选抗病毒药物。

现有的抗病毒药物筛选系统是将病毒转录复制相关的基因和荧光素酶报告基因构建于真核表达载体上，然后共转染宿主细胞，再用荧光检测设备来检测药物对荧光强度的影响，从而筛选出有效的抗病毒药物。然而，现有抗病毒药物的筛选系统中存在着筛选范围小，不能完全模拟病毒的感染过程和操作复杂繁琐等问题。鉴于此，特提出本发明的抗病毒筛选方法，包括以下步骤：

首先，将病毒吸附至单层细胞上。将细胞于培养基中培养至单层细胞后，弃去培养基，加入适宜浓度的病毒溶液，使得病毒吸附在单层细胞上。

然后，覆盖培养基。在本发明中，通过观察被感染细胞的存活量来判断抗病毒药物的效果，因此，需要向单层细胞中添加培养基等营养物质将被病毒感染的细胞培养一段时间。由于后续还要添加待筛选药物，且待筛选药物要能够与细胞相接触，所以添加的培养基需要保证具有高流动性和低粘度。

随后，加入待筛选药物。待筛选药物加入后会通过培养基逐渐扩散到病毒和细胞表面，如果待筛选药物具有抗病毒的效果，则会发挥相应的抗病毒作用。根据抗病毒药物的作用机制主要分为以下几种：穿入和脱壳抑制剂、dna多聚酶抑制剂、逆转录抑制剂、蛋白质抑制剂、神经氨酸酶抑制剂和广谱抗病毒药物。本发明提供的抗病毒药物筛选方法，其待筛选药物加入的阶段为病毒的吸附阶段，但这只是起始的病毒吸附阶段，空斑的扩大还是依赖于病毒不停地从宿主细胞释放以及吸附新宿主细胞，因此，本发明的筛选方法是可以筛选出包括吸附，侵入，脱壳，生物合成，装配与释放的所有阶段的抗病毒药物的。

再对细胞进行孵育。加入待筛选药物后，将细胞置于适宜的培养条件下进行孵育。需要说明的是，根据细胞的种类不同需要设置不同的培养条件，本发明对于细胞的培养器材不做过多限制，例如为co2培养箱，或采用本领域技术人员所熟知的其他培养器材。

最后，将细胞进行固定和染色，通过观察空斑来筛选抗病毒药物。通过将感染病毒的细胞培养一段时间后，未被病毒入侵的细胞会继续生长繁殖下去，而被病毒入侵的细胞会发生裂解死亡，形成空斑，染色后，能够被观察到。在本发明中，将细胞孵育适当的时间后，对细胞进行固定和染色，观察空斑的大小，通过比较实验组(加入待筛选药物)和对照组(不加待筛选药物)空斑大小来判断待筛选药物的抗病毒作用。当实验组空斑的大小大于对照组或与对照组接近时，则说明该待筛选药物没有抗病毒作用，甚至会对细胞造成伤害；当实验组空斑的大小小于对照组时，则说明该待筛选药物有抗病毒作用。

本发明的筛选方法操作简单，不需要额外设计和构建报告基因系统，不涉及质粒构建和转染，不涉及单克隆抗体；并且该方法成本低，试剂廉价，低耗材，不需要使用其他的大型高端设备；此外，还具有筛选通量大的优点，能够同时实现对几十种药物的筛选；本发明提供的筛选方法完全模拟活病毒的感染过程，能够准确高效地筛选出针对病毒复制所有阶段的抗病毒药物，能够缓解现有抗病毒药物筛选方法筛选范围小，工艺繁琐，成本高的技术问题。

在一种优选的实施方式中，病毒为具有完全感染能力的活病毒。

在本发明中，采用具有完全感染能力的活病毒颗粒直接感染宿主细胞，不改变病毒的结构，完全模拟活病毒的感染。

优选地，所述病毒包括但不限于动物病毒。

优选地，所述动物病毒包括但不限于肠道病毒、疱疹病毒、轮状病毒和流感病毒中的至少一种。根据不同的病毒感染性疾病，选用不同的病毒。

优选地，所述病毒的加入量为使每平方厘米单层细胞产生5～25个空斑。

在本发明中，通过观察空斑的数量及大小来判断待筛选药物的抗病毒作用，为了更好的观察并做出准确的判断，空斑的数量不宜过多或过少。病毒的加入量为使每平方厘米单层细胞产生空斑典型但非限制性的个数为5、7、9、11、13、15、17、19、21、23或25。病毒的加入量根据细胞及病毒的种类、培养时间、培养基大小等因素做相应的调整。例如选择96孔板作为培养器皿，则每个孔上保证能够产生2～8个空斑；选择24孔板作为培养器皿，则每个孔上保证能够产生10～20个空斑；选择12孔板作为培养器皿，则每个孔上保证能够产生20～30个空斑；选择6孔板作为培养器皿，则每个孔上保证能够产生40～60个空斑。

优选地，所述病毒的加入量为使每平方厘米单层细胞产生10～20个空斑。

通过对病毒的加入量及产生空斑的个数进行进一步调整和优化，使得能够更加清晰准确的对待筛选药物的抗病毒作用做出判断。

优选地，所述病毒吸附的时间为0.8～1.2h。病毒吸附典型但非限制性的时间为0.8h、0.83h、0.86h、0.9h、0.93h、0.96h、1h、1.03h、1.06h、1.1h、1.13h、1.16h或1.2h，优选为1h。

病毒从溶液中到吸附至细胞的表面需要一定的时间，通过一定时间的吸附，保证细胞上具有一定的病毒吸附量，实现对病毒的感染。

在一种优选的实施方式中，细胞包括但不限于动物细胞。或者选用本领域技术人员所熟知的其他能够贴壁生长，并长成单层的细胞，如肿瘤细胞、永生化细胞。本发明主要针对动物抗病毒药物的筛选，因此所根据病毒的类型选择相应动物细胞，例如病毒为肠道病毒或轮状病毒，则细胞可以选择肠上皮细胞。

优选地，所述动物细胞包括但不限于肠上皮细胞、羊膜细胞和成纤维细胞中的至少一种。需要说明的是，本发明对于细胞的种类不做过多限制，细胞的选择与采用的病毒相对应，保证细胞能够被病毒感染致细胞病变并脱落即可。

在一种优选的实施方式中，培养基包括微晶纤维素。

相较于本发明选用的培养基，某些培养基，例如含有甲基纤维素培养基，具有高的粘度，难于从培养皿上直接倒出，流动水也很难冲洗干净，而本发明的包含微晶纤维素的培养基粘度低、流动性大，能够比较容易的从培养皿上直接倒出，残留的培养液通过流动水很容易冲洗干净。此外，培养基具有高的流动性和较低的粘度，也有利于后续加入的待筛选药物向细胞的扩散传质，增强药物对病毒的作用。

优选地，微晶纤维素在培养基中的浓度为0.3％～1.5％。微晶纤维素在培养基中典型但非限制性的浓度为0.3％、0.6％、0.9％、1.2％或1.5％，优选为1.2％。

在本发明中，含有微晶纤维素培养基的流动性高，粘度低，更适宜用于本发明的抗病毒筛选方法。

在一种优选的实施方式中，待筛选药物的浓度为50～1000μm。待筛选药物典型但非限制性的浓度为50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，优选为50～150μm。

优选地，所述待筛选药物的加入量为0.8％～1.2％(v/v)。待筛选药物典型但非限制性的加入量为0.8％(v/v)、0.83％(v/v)、0.86％(v/v)、0.9％(v/v)、0.93％(v/v)、0.96％(v/v)、1％(v/v)、1.03％(v/v)、10.6％(v/v)、1.1％(v/v)、1.13％(v/v)、1.16％(v/v)或1.2％(v/v)，优选为1％(v/v)。

待筛选药物的浓度和加入量需要控制在一定范围内，不宜过高或过低。待筛选药物的浓度或加入量过高会改变细胞外的渗透压，不利于细胞的正常生长；待筛选药物的浓度或加入量过低会降低药物的抗病病毒作用，不能准确的将抗病毒药物筛选出来。

在本发明中，通过对待筛选药物的浓度和加入量进行进一步的优化和调整，使得能够在不影响细胞正常生长的前提下，充分发挥待筛选药物的作用。

在一种优选的实施方式中，固定所用到的固定液包括但不限于中性甲醛固定液、乙醇固定液和对聚甲醛固定液中的至少一种，或者采用本领域技术人员所熟知的其他细胞固定液固定，优选为中性甲醛固定液。

优选地，中性甲醛固定液的浓度为4％～10％。中性甲醛固定液典型但非限制性的浓度为4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％，优选为8％。

优选地，中性甲醇固定液的加入量为80％～120％(v/v)。中性甲醇固定液典型但非限制性的加入量为80％(v/v)、83％(v/v)、86％(v/v)、90％(v/v)、93％(v/v)、96％(v/v)、100％(v/v)、103％(v/v)、106％(v/v)、110％(v/v)、113％(v/v)、116％(v/v)或120％(v/v)，优选为100％(v/v)。

优选地，中性甲醛固定液的固定时间为0.8～1.2h。中性甲醛固定液典型但非限制性的固定时间为0.8h、0.83h、0.86h、0.9h、0.93h、0.96h、1h、1.03h、1.06h、1.1h、1.13h、1.16h或1.2h，优选为1h。

通过对中性甲醛固定液的浓度、加入量和固定时间进行进一步优化和调整，使得细胞得到更好的固定。

在一种优选的实施方式中，染色包括但不限于中性红染色、结晶紫染色和苏木精-伊红染色，或者采用本领域技术人员所熟知的其他染色方式，优选为中性红染色。

优选地，中性红溶液的浓度为0.1％～1.5％。中性红溶液典型但非限制性的浓度为0.1％、0.15％、0.3％、0.6％、0.9％、1.2％或1.5％，优选为0.3％。

通过对染色方式和染色液浓度进行进一步的调整和优化，使得能够更加清晰观察到空斑，更有利于对待筛选药物抗病毒性的筛选。

在一种优选的实施方式中，染色后还包括清洗和晾干的步骤。

在本发明中，将染色好的细胞进行清洗，去除细胞表面的染色液，晾干后，再根据实验组(添加待筛选药物)与对照组(不添加待筛选药物)的空斑数量及大小判断待筛选药物的作用，从而实现对抗病毒药物的筛选。

在一种优选的实施方式中，单层细胞的培养皿包括但不限于6孔、12孔、24孔、48孔和96孔培养板，优选为96孔培养板。

在本发明中，通过采用96孔培养板来对抗病毒药物进行筛选，能够同时完成40多种药物的筛选，有效提高筛选抗病毒药物的通量，提高筛选效率。

优选地，96孔培养板上每种药物设2～4个复孔。复孔即为重复的实验组，在本发明中，通过设置多个复孔能够更加准确的筛选出抗病毒药物，避免偶然事件的发生而导致筛选错误。

优选地，96孔培养板上不加药物的对照孔至少为3个。96孔培养板上不加药物的对照孔典型但非限制性的个数为3、4、5、6、7、8、9或10。

通过对每种药物复孔个数和对照孔个数进行进一步优化和调整，能够更加准确的观察待筛选药物的抗病毒效果，从而增加筛选结果的准确性。

第二方面，在一些具体的实施方式中提供了一种抗病毒药物筛选方法在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用。

本发明的筛选方法操作简单，不需要额外设计和构建报告基因系统，不涉及质粒构建和转染，不涉及单克隆抗体；并且该方法成本低，试剂廉价，低耗材，不需要使用其他的大型高端设备；此外，还具有筛选通量大的优点，能够同时实现对几十种药物的筛选；本发明提供的筛选方法完全模拟活病毒的感染过程，能够准确高效地筛选出针对病毒复制所有阶段的抗病毒药物，能够缓解现有抗病毒药物筛选方法筛选范围小，工艺繁琐，成本高的技术问题。将本发明提供的抗病毒药物筛选方法应用于制备治疗病毒感染性疾病的药物，用于治疗因病毒感染而导致的疾病。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1

本实施例提供了一种抗病毒药物的筛选方法，如图1所示，包括以下步骤：

将细胞悬液用移液枪以每孔1000μl体积加入24孔板的中；待细胞在孔底长成单层细胞，用移液枪吸去培养液，每孔加入适当浓度的ev-a71病毒液200μl(确保每孔能产生10～20个空斑)；病毒吸附1h后，直接用移液枪加入含有微晶纤维素的培养基每孔1000μl；将浓度为400μm和1000μm的已知抗病毒药物病毒唑以每孔12μl的量直接加入到孔内培养基中，每个浓度设3个复孔，24孔板上留3个不加药物的对照孔；孵育一段时间后，每孔加1200μl8％的中性甲醛溶液固定1h后，洗板，再加0.3％中性红染料染色；最后进行洗板和晾干，判读结果如图2所示，其中a和b为不添加病毒唑的空斑图；c和d为添加浓度为400μm的病毒唑的空斑图；e和f为添加浓度为1000μm的病毒唑的空斑图。

如图2所示，从图中能够清楚看出孔板上的每个空斑(已用白色箭头标出)，抗病毒药物病毒唑的添加能够明显降低空斑的大小，随着病毒唑浓度的升高，空斑尺寸减小，分散成多个更小的空斑。说明，本发明提供的抗病毒筛选方法通过观察空斑的变化，能够清楚的得出待筛选药物的作用，准确的筛选出抗病药物。

实施例2

本实施例提供了一种抗病毒药物的筛选方法，包括以下步骤：

将细胞悬液用8通道排枪以每孔100μl体积加入96孔板的中；待细胞在孔底长成单层细胞，用8通道排枪吸去培养液，加入适当浓度的病毒液每孔60μl(确保每孔能产生2～8个空斑)；病毒吸附1h后，直接用8通道排枪加入微晶纤维素培养基每孔100μl；将药库中的浓度为100μm的待筛选药物以每孔1.6μl的量直接加入到孔内培养基中，每种药物设2个复孔，每个96孔板留4列不加药物的对照孔；根据不同病毒对细胞的完全致病变作用时间进行孵育，孵育结束后，每孔加160μl8％的中性甲醛溶液固定1h后，洗板，加0.3％中性红染料染色；最后进行洗板和晾干，判读结果如图3所示。

如图3所示，第3列、第6列、第9列和第12列为不添加药物的对照孔，根据每个孔中空斑的面积能够清楚地观察到细胞被病毒感染的情况，如f1孔、f2孔、h1孔和h2孔，孔板上空斑面积与不加药物的对照孔相近的，即为不能有效抑制病毒空斑形成的药物，没有抗病毒效果或者抗病毒效果差；如a1孔、a2孔、c1孔和c2孔，孔板上没有空斑的，即为能够有效抑制病毒空斑形成的药物，抗病毒效果好；如b1孔、a2孔、d1孔和d2孔，孔板上全是空斑的，即为对细胞毒性过大的药物，导致细胞全部脱落。通过本发明提供的筛选方法能够清楚的观察到各个药物对病毒的抑制效果，且采用96孔板能够同时实现对几十种药物的筛选，筛选通量大，提高抗病毒药物的筛选效率。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。