耐药性检测组合物、耐药性检测试剂盒及耐药性检测方法与流程

本发明涉及分子生物学检测领域，特别是涉及一种耐药性检测组合物、耐药性检测试剂盒及耐药性检测方法。
背景技术：
：抗生素的发现和应用，尤其是20世纪40年代青霉素于临床的应用，开创了人类战胜感染性疾病的新纪元，但随之出现的细菌耐药现象又给人类征服细菌提出了严峻的挑战。近20年来，各种新型抗菌药物不断地应用于临床，由于大量不合理地使用抗生素，细菌耐药性和多重耐药日趋严重，已成为全球医学界关注的热点问题，引起了世界卫生组织和越来越多国家的高度重视。从1940首次在大肠埃希菌中发现青霉素酶，1956年在芽孢杆菌中发现头孢菌素酶以及1960年第一次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)，细菌的耐药发生发展过程伴随着抗菌药物的不停使用和新药的不断开发，呈逐年加剧的态势。各种耐药细菌不仅呈逐年增多的趋势，而且常为多重耐药。迄今为止，多重耐药细菌、泛耐药甚至是全耐药细菌的报道已经屡见不鲜。随着新型致病菌的不断出现，抗菌药的防治效果也越来越差。细菌多重耐药现象日益严重，耐药机制也趋于复杂，主要有以下几种：①细菌水平和垂直传播耐药基因的整合子系统；②细菌可同时产生多种水解酶和修饰酶；③细菌膜基因改变而形成的外排泵出系统；④细菌生物膜的形成；⑤细菌使药物作用的靶位改变等。kpc基因是最为常见的耐药基因。kpc是一种由质粒介导的丝氨酸β-内酰胺酶，可以编码碳青霉烯酶，可引起细菌对青霉素、头孢菌类和培南类在内的几乎所有β-内酰胺类抗菌药物的耐药性，例如亚胺培南、美罗培南等。cmy-2基因可以编码ampc酶，即c类β内酰胺酶，它被认为是大肠埃希菌对三代头孢类抗生素耐药的又一重要机制。cmy-2基因位于质粒上，不需要诱导即可产生大量ampc酶。对于产ampc酶细菌的抗感染治疗已成为越来越棘手的临床问题，它不仅能水解青霉素、头孢菌素，其作用底物还包括头孢美素(如头孢西丁和头孢替坦)以及β内酰胺类与酶抑制剂的复合抗生素，因而近年来对ampc酶进行了广泛和深入的研究。耐甲氧西林葡萄球菌(mrs)是引起医院感染的一种主要病原菌，耐药机制复杂，迄今为止，其耐药机制仍然不清楚，其中meca基因编码的青霉素结合蛋白pbp2a的耐药机制得到普遍认可。meca基因是mrs的分子标志，在葡萄球菌中广泛分布，目前在葡萄球菌属以外的细菌中尚未检出，因此clsi将检测meca基因作为检测mrs的金标准。科学家对代表性的金黄色葡萄球菌进行了全基因组测序，根据基因组结构分析得知，meca基因位于葡萄球菌mec盒式染色体(sccmec)上，其包括三个部分：①mec基因复合体，分为a～e五种类型，包括meca基因、β内酰胺诱导转录调节基因(meci和mecr1)和插入序列is431；②盒式染色体重组酶基因ccra、ccrb和ccrc，负责sccmec元件的整合、剪切；③无功能区。sccmec是mrs的耐药性基因岛，它与耐药基因的传递、多重耐药性等关系密切，已成为世界性的研究焦点。各种致病菌对不同的抗菌药物的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也有差异。长期以来，各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药物失去药效，人们难以很好地掌握药物对细菌的敏感度，所以快速准确地获得细菌的耐药性结果能够帮助临床医师迅速选用抗菌药物并提高疗效。传统的细菌耐药性检测方法主要有常规药敏实验、抗性蛋白检测方法和耐药性分子检测方法等。这些方法的缺点是操作繁琐、经验依赖性强、报告结果慢。目前常用的快速检测细菌耐药性的方法包括质粒指纹图谱分析、pcr限制性片段长度多态性分析(pcr-rflp)和多重pcr等。其中多重pcr的应用比较广泛，因为耐药基因多种多样，同一株细菌可携带多种耐药基因，需要对多种耐药基因同时检测。然而，在具体的应用中，针对特定的两种甚至三种耐药基因，要找到能相互兼容、可在同一反应体系中分别进行特异性扩增的多个引物对以及相应的探针是非常困难的。技术实现要素：基于此，有必要提供一种用于快速同时检测多个细菌耐药基因的耐药性检测组合物。一种耐药性检测组合物，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第一探针、第二探针和第三探针；其中，所述第一引物对的序列如seqidno:1和seqidno:2所示，所述第二引物对的序列如seqidno:3和seqidno:4所示，所述第三引物对的序列如seqidno:5和seqidno:6所示，所述第一探针的序列如seqidno:7所示，所述第二探针的序列如seqidno:8所示，所述第三探针的序列如seqidno:9所示；所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针的两端均分别标记有能够发生荧光能量共振转移的荧光基团和淬灭基团，且所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针上标记的荧光基团各不相同。本发明提供了一种经过筛选优化的耐药性检测组合物，可利用多重实时荧光pcr技术快速同时进行三种细菌耐药基因的联合检测，即碳青霉烯类耐药基因kpc、c类头孢菌素耐药基因cmy-2以及甲氧西林耐药基因meca，极大地简化了检测流程，缩短了检测时间，且具有较高的灵敏度和精密度，为量少珍贵的核酸样品提供更多的靶点检测信息，全过程均在单管封闭条件下进行避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染，为科研及临床的细菌耐药性检测提供了简单高效的检测方法，对临床治疗成败和抗生素的合理应用具有重要意义。耐药性检测组合物中，第一引物对和第一探针用于扩增碳青霉烯类耐药基因kpc，第二引物对和第二探针用于扩增c类头孢菌素耐药基因cmy-2，第三引物对和第三探针用于扩增甲氧西林耐药基因meca。在其中一个实施例中，还包括内标引物对和内标探针，所述内标引物对的序列如seqidno:10和seqidno:11所示，所述内标探针的序列如seqidno:12所示，所述内标探针的两端也分别标记有能够发生荧光能量共振转移的荧光基团和淬灭基团，且所述内标探针上标记的荧光基团不同于所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针上标记的荧光基团。在其中一个实施例中，所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针和所述内标探针上标记的荧光基团分别选自fam、hex、rox和cy5中的一种，所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针和所述内标探针上标记的淬灭基团分别选自bhq1和bhq2中的一种。在其中一个实施例中，所述第一探针的5’端标记有荧光基团fam，3’端标记有淬灭基团bhq1；所述第二探针的5’端标记有荧光基团rox，3’端标记有淬灭基团bhq2；所述第三探针的5’端标记有荧光基团cy5，3’端标记有淬灭基团bhq2；所述内标探针的5’端标记有荧光基团hex，3’端标记有淬灭基团bhq1。本发明还提供了一种耐药性检测试剂盒，包括上述耐药性检测组合物。在其中一个实施例中，还包括pcr缓冲液、dna聚合酶、mgcl2和dntps中的至少一种。在其中一个实施例中，还包括核酸释放剂。本发明还提供了一种耐药性检测方法，包括以下步骤：将核酸样品与pcr缓冲液、dna聚合酶、mgcl2、dntps和上述耐药性检测组合物混合，然后进行实时荧光pcr扩增并检测荧光信号。在其中一个实施例中，还包括以下制备所述核酸样品的步骤：将待测样品与核酸释放剂混合，静置2～10min，得到所述核酸样品。在其中一个实施例中，所述实时荧光pcr扩增的条件为：92℃～96℃预变性4～6min；92℃～96℃变性13s～17s，58℃～62℃退火28s～32s，若干个循环。附图说明图1为fam通道碳青霉烯类耐药基因kpc阳性检测结果；图2为rox通道c类头孢菌素耐药基因cmy-2阳性检测结果；图3为cy5通道甲氧西林耐药基因meca阳性检测结果；图4为hex通道内标阳性检测结果；图5为所有通道阴性样本检测结果；图6为fam通道碳青霉烯类耐药基因kpc检测灵敏度分析结果；图7为rox通道c类头孢菌素耐药基因cmy-2检测灵敏度分析结果；图8为cy5通道甲氧西林耐药基因meca检测灵敏度分析结果；图9为fam通道碳青霉烯类耐药基因kpc检测精密度分析结果；图10为rox通道c类头孢菌素耐药基因cmy-2检测精密度分析结果；图11为cy5通道甲氧西林耐药基因meca检测精密度分析结果。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本发明一实施例的耐药性检测组合物，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第一探针、第二探针和第三探针。其中，第一引物对的序列如seqidno:1和seqidno:2所示，第二引物对的序列如seqidno:3和seqidno:4所示，第三引物对的序列如seqidno:5和seqidno:6所示，第一探针的序列如seqidno:7所示，第二探针的序列如seqidno:8所示，第三探针的序列如seqidno:9所示，具体如表1所示。表1第一探针、第二探针和第三探针的两端均分别标记有能够发生荧光能量共振转移的荧光基团和淬灭基团，且第一探针、第二探针和第三探针上标记的荧光基团各不相同。多重聚合酶链式反应(多重pcr)是指在同一试管中同时进行多个pcr，从而一次性扩增多个目标片段，因此节省了大量的时间和金钱，具有巨大的经济和时间效应。但是，引物之间以及引物与模板序列之间存在相互干扰，在实时荧光pcr中还存在引物、模板和探针之间的相互干扰，从而导致出现扩增偏向性、非特异性扩增、灵敏度低、精密度低等问题。目前，引物、模板和探针之间相互干扰的内在机理仍然不明了，影响扩增结果的因素繁多而复杂，难以通过一个标准化的操作即可得到相应的结果，且随着扩增重数的增加而难度越大。因此，针对特定的两种甚至三种耐药基因，要找到能相互兼容、可在同一反应体系中分别进行特异性扩增的多个引物对以及相应的探针是非常困难的。往往单独进行扩增时效果较好的引物对和探针，一旦混合在一起在同一反应体系中进行反应时效果就显著降低，发明人往往需要分别进行大量的试验和探索，才有可能找到满足要求的引物对和探针。本实施例提供了一种经过筛选优化的耐药性检测组合物，可利用多重实时荧光pcr技术快速同时进行三种细菌耐药基因的联合检测，即碳青霉烯类耐药基因kpc、c类头孢菌素耐药基因cmy-2以及甲氧西林耐药基因meca，极大地简化了检测流程，缩短了检测时间，且具有较高的灵敏度和精密度，为量少珍贵的核酸样品提供更多的靶点检测信息，全过程均在单管封闭条件下进行避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染，为科研及临床的细菌耐药性检测提供了简单高效的检测方法，对临床治疗成败和抗生素的合理应用具有重要意义。耐药性检测组合物中，第一引物对和第一探针用于扩增碳青霉烯类耐药基因kpc，第二引物对和第二探针用于扩增c类头孢菌素耐药基因cmy-2，第三引物对和第三探针用于扩增甲氧西林耐药基因meca。在一个具体示例中，耐药性检测组合物还包括内标引物对和内标探针，内标引物对的序列如seqidno:10和seqidno:11所示，内标探针的序列如seqidno:12所示，具体如表2所示。内标探针的两端也分别标记有能够发生荧光能量共振转移的荧光基团和淬灭基团，且该荧光基团也不同于第一探针、第二探针和第三探针上标记的荧光基团。该内标引物对和内标探针主要用于扩增gapdh管家基因，以检测样本在实时荧光pcr过程中是否正常，避免出现假阴性的结果，通过筛选优化内标引物对和内标探针，可进一步确保检测的稳定性。表2在一个具体示例中，第一探针、第二探针、第三探针和内标探针上标记的荧光基团分别选自fam、hex、rox和cy5中的一种，第一探针、第二探针、第三探针和内标探针上标记的淬灭基团分别选自bhq1和bhq2中的一种。在一个具体示例中，第一探针的5’端标记有荧光基团fam，3’端标记有淬灭基团bhq1。第二探针的5’端标记有荧光基团rox，3’端标记有淬灭基团bhq2。第三探针的5’端标记有荧光基团cy5，3’端标记有淬灭基团bhq2。内标探针的5’端标记有荧光基团hex，3’端标记有淬灭基团bhq1。可以理解，标记方式不限于此。本发明一实施例的耐药性检测试剂盒，包括上述耐药性检测组合物。在一个具体示例中，耐药性检测试剂盒还包括pcr缓冲液、dna聚合酶、mgcl2和dntps中的至少一种，dna聚合酶可以是taqdna聚合酶或tthdna聚合酶等。进一步地，耐药性检测试剂盒还包括核酸释放剂。可以理解，耐药性检测试剂盒还可以根据需要添加其他组分。本发明一实施例的耐药性检测方法，包括以下步骤：将核酸样品与pcr缓冲液、dna聚合酶、mgcl2、dntps和上述耐药性检测组合物混合，然后进行实时荧光pcr扩增并检测荧光信号。在一个具体示例中，还包括以下制备上述核酸样品的步骤：将待测样品与核酸释放剂混合，静置2～10min，得到上述核酸样品。可选地，核酸释放剂为一种无菌水溶液，由50mmol/l～200mmol/l的氯化钾、0.01mmol/l～0.5mmol/l的表面活性肽、0.01％～2％(质量/体积)的十二烷基磺酸钠或十二烷基硫酸锂或chelex树脂，以及0.05％～1％(体积)的乙醇组成，其中百分比以无菌水体积为计算基准。在一个具体示例中，实时荧光pcr扩增的条件为：92℃～96℃预变性4～6min；92℃～96℃变性13s～17s，58℃～62℃退火28s～32s，若干个循环。在一个具体示例中，单个pcr反应管中总体积为20～200μl，pcr缓冲液中加入合适浓度的dna聚合酶、mgcl2、dntps等组份，各引物和/或探针的浓度可以为50nm～500nm不等，具体一个示例如下表所示。以下为具体实施例。一、实时荧光pcr扩增准备临床样品29例，在样本处理室分别取5μl待测样品与5μl核酸释放剂混合，静置2～10min得到核酸样品，然后与pcr缓冲液、dna聚合酶、mg2+、dntps和上述耐药性检测组合物混合，具体反应体系如表3所示。然后在宏石荧光定量pcr仪上进行实时荧光pcr扩增并检测荧光信号，实时荧光pcr扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃变性15s，60℃退火30s并采集荧光信号，45个循环。表3组份每一反应体系中的体积或浓度核酸样品10μlmgcl24mmdntps(25mm)0.4mmtaq酶(5u/μl)1μlseqidno:1300nmseqidno:2300nmseqidno:3300nmseqidno:4300nmseqidno:5300nmseqidno:6300nmseqidno:7150nmseqidno:8150nmseqidno:9150nmseqidno:10300nmseqidno:11300nmseqidno:12150nmpcrbuffer(s01)补足至50μl二、检测结果及分析1.分析流程利用taq酶水解荧光探针产生荧光信号的技术原理，以各通道荧光信号达到设定的阈值时所需的循环次数ct值作为判定标准。本实施例中第一探针的5’端标记有荧光基团fam，3’端标记有淬灭基团bhq1；第二探针的5’端标记有荧光基团rox，3’端标记有淬灭基团bhq2；第三探针的5’端标记有荧光基团cy5，3’端标记有淬灭基团bhq2；内标探针的5’端标记有荧光基团hex，3’端标记有淬灭基团bhq1。因此各荧光通道中，fam通道代表碳青霉烯类耐药基因kpc，rox通道代表c类头孢菌素耐药基因cmy-2，cy5通道代表甲氧西林耐药基因meca，hex通道代表内标。baseline的设置：baseline一般设置为3～15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点(start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点(end)比最早出现指数扩增的样本ct减少1～2个循环。threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，一般取扩增斜率1/3～1/2处。先分析内标在hex通道的检测ct，若有ct≤40，表示本次结果有效，可继续进行后续分析；若内标在hex通道没有检出ct或ct＞40，表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应。若fam通道检测到扩增曲线，且ct≤40，表示碳青霉烯类耐药基因kpc检测结果为阳性；若rox通道检测到扩增曲线，且ct≤40，表示c类头孢菌素耐药基因cmy-2检测结果为阳性；若cy5通道检测到扩增曲线，且ct≤40，表示甲氧西林耐药基因meca检测结果为阳性。2.检测结果29例临床样本中，检出2例碳青霉烯类耐药基因kpc阳性，1例c类头孢菌素耐药基因cmy-2阳性，3例甲氧西林耐药基因meca阳性，该结果与分别单独检测各耐药基因的结果一致。图1所示为fam通道碳青霉烯类耐药基因kpc阳性检测结果，图2所示为rox通道c类头孢菌素耐药基因cmy-2阳性检测结果，图3所示为cy5通道甲氧西林耐药基因meca阳性检测结果，图4为hex通道中内标阳性检测结果，图5为所有通道阴性样本检测结果。3.灵敏度实验进一步对该耐药性检测组合物及检测方法进行灵敏度分析，取浓度分别为1000copies/μl、100copies/μl和10copies/μl的dna样品5μl作模板进行检测，结果如图6～8所示。结果表明该耐药性检测组合物及检测方法灵敏度高，检测浓度可达10copies/μl。4.精密度试验进一步对该耐药性检测组合物及检测方法进行精密度分析，选择强阳、弱阳2个浓度水平(分别为100copies/μl和20copies/μl)的质控品进行批内精密度和批间精密度的测定，每个样本重复测定20次，结果如图9～11所示。结果显示强阳、弱阳参考品的检出率均为100％，并且批内、批间的检测ct值变异系数(cv)小于5％，可以认为该耐药性检测组合物及检测方法在批内、批间均有着很好的检测精密度。5.对比试验进一步将该耐药性检测组合物与其他组合物进行对比，准备如表4所示的引物对及探针。以下引物对和相应探针作为单检体系，以质粒为模板分别进行了测试，均可成功进行检测，且检测浓度可达10copies/μl，批内、批间的检测ct值变异系数(cv)小于5％。表4将表4所示的各引物对及探针作为对比例，将本申请的各引物对及探针作为实施例，交叉组合进行联检测试，形成16个多重体系，具体引物探针组合方式以及结果如表5所示。根据结果可知，本申请的耐药性检测组合物的效果最佳，采用对比内标引物对的组合物的效果略差，采用对比引物对及探针的组合物无法成功检测或检测灵敏度和精密度很低，充分说明了并不是任意组合的引物对和探针均能达到本申请耐药性检测组合物的检测效果。表5以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>湖南圣湘生物科技有限公司<120>耐药性检测组合物、耐药性检测试剂盒及耐药性检测方法<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gccgtgacggaaagcttaca20<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tcgtgtttccctttagccaatc22<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ggttccgcagaacgaacaaa20<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcttcggcgtcaagttgtc19<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gttagattgggatcatagcgtcat24<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ttggccaattccacattgtt20<210>7<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7aaactgacactgggctctgcactggc26<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ctatcgcgaagggaagcccgtacac25<210>9<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ttccaggaatgcagaaagaccaaagcatac30<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10caagatcatcagcaatgcct20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11agtccttccacgataccaaa20<210>12<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12caccaccaactgcttagcacccctg25当前第1页12