一种快速定量硅藻细胞密度的分子检测方法与流程

本发明属于藻类检测领域，具体涉及一种采用荧光定量pcr(聚合酶链式反应)方法对水体中的硅藻类群进行快速定量检测的方法，适用于对海洋、江河湖库、输水明渠、地下水、冰川乃至生命有机体中所含有的硅藻类群(法医鉴定)进行快速定量检测，可为相关生态环境调查和科学研究提供可靠的数据。

背景技术：

硅藻是一类具有色素体、细胞壁高度硅质化的单细胞真核微藻植物，常由几个或很多细胞个体连结成各式各样的群体；硅藻在地球存在约有2亿年是水生生态系统中物种最丰富的生物之一，全世界约有16000多种，中心纲硅藻物种数量只有羽纹纲硅藻的一半。硅藻分布极其广泛，栖息生境多样，不管是海洋、淡水、泥土及潮湿的基质表面上均可发现，是一类最重要的浮游植物；大部分硅藻生活在开阔的远洋水域，当然也有的像膜一样生活在海底砂砾上，更有能在仅仅是潮湿的大气中存活的种类。硅藻的一些种甚至会布在2公里的高空。在世界大洋中，只要有水的地方，一般都有硅藻的踪迹，尤其是在温带和热带海区。因为硅藻种类多、数量大，因而被称为海洋的“草原”。硅藻是水域生态系统的重要初级生产者，每年至少贡献全球20％的初级生产力，相当于热带雨林的贡献，在全球碳循环中具有重要作用。作为河流初级生产力的重要贡献者和对生境变化极其敏感的指示生物，硅藻对于环境中的有机污染物、无机营养物、重金属和酸碱度等因子的变化能快速响应，一直以来是一种重要的环境监测指示物种，常被用于水质研究和指示环境的变动。作为环境指示生物，一般需要满足以下三个基本条件：1.生物类群在研究区域广泛存在，有一个特定的栖息地，容易取样，且物种丰度不受生命循环周期的影响；2.能对外界环境变化快速作出响应，同时物种或者群落结构能揭示外界环境不同的特性。3.物种容易鉴定和量化，不需要消耗太多的时间和劳动力，最好是一般人员经过培训都能完成分析，而不需要过多的生物学基础知识。相对于大型无脊椎动物和鱼类，硅藻作为单细胞植物，生命周期短，能及时反映水环境变化，且广泛分布于各种水生环境中，因此是指示生物的上佳选择；硅藻采样方便，成本低，玻片样本容易辨识且能长期保存，吸引全世界的学者对其开展研究。但作为环境指示生物，硅藻的鉴定和量化方面一直是个短板，需要受过藻类生物学专业培训的技术人员借助烧片等样品前处理措施后在显微镜的帮助下才能鉴定和量化，这严重制约了硅藻作为环境指示生物的应用。因此，开发简便易行的硅藻鉴定和量化技术势在必行。

另一方面，我国水生态环境保护方面存在诸多的问题，尤其是水利工程引起的水资源时空分布格局改变、长距离输水干渠水质稳定、饮用水安全、重金属污染、农药污染、藻类水华泛滥等热点难点问题，人们希望以硅藻作为环境指示生物快速便捷找到相关线索或答案，硅藻的鉴定和量化成为重要的环境监测工具。事实上，单就藻类水华而言，近年来因为水域生态环境的变化以及水体营养的加富，硅藻水华在全国各地均频繁暴发。如三峡水库、汉江中下游、嘉陵江、汤浦水库、东钱湖等均多次出现，其中常见的硅藻优势种有冠盘藻(stephanodiscus)，曲壳藻(achnanthes)，小环藻(cyclotella)，针杆藻(synedra)，直链藻(melocira)，星杆藻(asterionella)等。有些硅藻还会产生毒素如软骨藻酸(domoicacid，da)，根据其毒性症状，也被命名为记忆丧失性贝毒(amnesicshellfishpoisoning，asp)；还有些硅藻可以产生醛类代谢物质，对桡足类等水生动物的生殖具有毒性。虽然产毒种类多发生于海洋类硅藻，但淡水硅藻的危害也不容忽视，如其对自来水厂滤池的堵塞，增加水厂预处理难度等，为防控这一危害，有必要建立起及时准确的硅藻检测与监测机制；从这个角度来看，开发简便易行的硅藻定量检测方法是迫在眉睫的需求。

硅藻检测方法包括样品前处理和样品检测两部分，样品前处理方法有强酸消化法、微波消解法、焚灼法、酶消化法等；样品检测方法有显微镜镜检、扫描电镜观察、色素含量的分光光度计测定和dna分析法等方法。具体介绍如下：1.基于形态学特征的检测方法：接受过专业技能培训的人员通过对样品进行前处理，经显微镜、扫描电镜等仪器设备进行观察镜检，确定硅藻种类和数量。前处理方法、检测仪器设备的性能以及检测人员的科学素养对检出结果有显著的影响。2.基于硅藻化学成分组成差异的检测方法：硅藻细胞的叶绿素荧光特性被用于检测和定量，形成叶绿素荧光检测方法；硅藻叶绿素a含量也常被用来作为简单定量其生物量的方法；frenkel等应用核磁共振波谱法与电感耦合等离子体质谱法检测羽纹纲硅藻信息素的释放过程，并可用于硅藻检测和种属分类；lavars等应用固体核磁共振硅谱以及衰减全反射红外光谱技术对不同浓度盐溶液中的两种硅藻进行检测，并对硅藻外壳硅、氧元素成分变化进行连续监测，结果显示不同硅藻外壳构成成分对盐溶液浓度高度敏感并相关；原子力显微镜技术源于扫描电镜，所提取的样品可直接用显微镜进行观察，该方法的优点是可直接在介质中对硅藻进行观察，扫描范围能覆盖最大的硅藻，并能将硅藻外壳化学成分的细节完全呈现。gebeshuber等首次用原子力显微镜监测了活体硅藻，pletikepic等利用该方法监测了硅藻有机成分与硅的结合过程以及硅藻外壳的形态特征。原子力显微镜目前应用于硅藻外壳矿化过程、细胞膜超微结构、细胞膜微观生物力学、细胞膜外基质的粘附参数等硅藻研究中。这一类研究方法严重依赖对高精尖科研仪器的使用，不是一般人员能够操作和解译其结果的。3.基于dna序列的分子检测方法：分子生物学的发展为硅藻检测开辟了全新的思路和方法，相对于前述方法，应用dna基因序列检测硅藻的灵敏度更高，操作更简单，且结果更客观精准，可信度高，在硅藻检测中越来越受到重视。由于检测样品量大，不同检测人员的工作习惯、业务素养等因素影响检测结果的准确性，开发一种简便、快捷、高灵敏度的检测方法十分必要。

近年来，随着分子生物学技术的发展，基于pcr的分子检测方法不断被开发，并应用在了藻类检测领域。在淡水硅藻分子检测手段研究的文献中，有使用小核糖体亚单位编码基因16srdna为对象进行硅藻检测的，16srdna含有多个可变区，信息量丰富，可为不同藻类鉴定提供信息；nubel等从环境水样中扩增了16srdna，结合变性梯度凝胶电泳技术进行硅藻群落的指纹分析；何方刚等应用其设计的引物进行过藻类分析，李鹏等建立pcr法扩增16srdna片段检测硅藻的方法，韩军鸽等对比了硝酸消化法与pcr扩增16srdna的检测方法，发现pcr方法所用样品量少，信息量丰富。vetrovsky等认为16srdna基因在结构功能上较蛋白质编码基因保守，用它不一定能够确保准确性。余政梁等应用pcr-dhplc方法检测硅藻特异的核糖体小亚基ssu基因，能直接检出硅藻，特异性较高。刘向东等建立了硅藻upa条形码基因的实时荧光定量pcr检测方法，引物upa99仅对硅藻标准株(针杆藻、舟形藻、直链藻、小环藻、菱形藻)dna具有扩增,确认基于硅藻upa基因设计通用引物建立qpcr的硅藻检验法特异性和灵敏度，应用于溺死诊断有较好的应用前景。彭帆等筛选硅藻叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基(largesubunitofribulose-1,5-bisphosphatecarboxylaseoxygenase,rbcl)基因的特异性引物，建立硅藻rbcl基因的聚合酶链式反应-毛细管电泳(polymerasechainreactioncapillaryelectrophoresis,pcr-ce)检测方法并探讨其在溺死尸体诊断中的应用价值。尽管目前公开报道的分子检测方法有很多，但目前这些方法都无法保证较理想的检出率，同时，无法进行精准的定量。

硅藻检测方法的专利方面，最相关的专利有如下四个：一种法医学硅藻检验的自动化方法(cn201010115728.0)：主要是硅藻扫描电镜图像数据库的建立、硅藻自动化识别系统的建立和样品中硅藻自动化检测过程，自动化检测过程包括：(1)对样品进行微波消解和真空抽滤；(2)采用自动化扫描电镜对样品所划分的视场图像进行逐个拍摄；(3)对所拍摄的样品视场扫描电镜图像，采用gabor滤波器、灰度阈值分割处理和数学形态学处理方法进行图像增强、图像分割和二值化处理；提取形态结构特征，并在硅藻形态结构特征数据库中进行检索匹配和统计计算。一种法医学硅藻检验方法(cn201610099515.0)：主要是对样品的前处理以及基于扫描电镜自动拍照并存储图像，采用人工识别方式或计算机自动化识别方式对所拍摄视场图像中的硅藻进行检查、分类和统计处理。一种硅藻rbcl基因分析方法及其在法医检测中的应用(cn201710459244.x)：提供了一种对硅藻rbcl基因通用质体扩增区的分析方法，其主要基于普通pcr方法来定性检测生物体内硅藻，引物验证时，选取有限藻株进行筛选，样本量较少，未覆盖所有硅藻种类(文中脆杆藻显示为阴性，表明引物未检测出该硅藻)，此引物不适用硅藻细胞密度检测，同时，反应体系时间相比较本发明较长(退火和延伸时间为1分钟)。一种硅藻upa基因分析方法及其在法医检测中的应用(cn201710459243.5)：提供一对检测硅藻upa基因的引物对和硅藻upa基因的分析方法，提取硅藻内核酸，利用引物对核酸中upa基因进行扩增，利用扩增产物制备待测样本，对待测样本进行核酸分析。探针为5’-cggaggcgtacaaag-3’，探针5’端以fam荧光报告基团标记，3’端以nfq-mgb荧光淬灭基团标记。还提供了将上述硅藻upa基因分析方法应用于法医检测中的应用，在溺亡者脏器中提取硅藻核酸并用pcr技术进行扩增，然后进行检测并与水样中的硅藻核酸进行比对，通过检出率和硅藻upa基因测序结果的比对，即可判断溺亡者是否真正死于溺亡，同时有助于找出真正的溺亡区域。上述发明均对于硅藻检测提供了有价值的方法，但上述方法仍然以定性为主，缺乏真正定量的分子检测方法。

本发明通过对硅藻细胞内的众多核心基因进行考察，发现了适合作为淡水硅藻检测的分子标记——叶绿体内核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(rubisco)，此酶由8个大亚基和8个小亚基组成，其中编码大亚基的基因rbcl是叶绿体进行光合作用的关键基因片段，长度约1400bp，对已有研究及ncbi数据库、genbank的分析发现，rbcl序列的信息比较齐全，出现内含子的概率较小，可被用于硅藻的分类研究；同时还发现，此基因为单拷贝，适合用于野外样品的定量检测；本发明对其进行了实时荧光定量pcr的体系优化和野外样品检测验证，确认了方法的可行性和可靠性。通过本发明，将排除检测技术人员对检测结果的影响，突破硅藻定量检测依赖大型专业仪器设备和技术人员的瓶颈，大大提高野外硅藻的检测效率，为水质安全管理和预警提供重要的技术手段。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种快速定量硅藻细胞密度的分子检测方法，针对当前硅藻检测方法中存在的样品量大、分析任务繁重、严重依赖专业技术人员和高精尖仪器、缺乏特异性定量检测方法等问题，基于荧光定量pcr的生物学原理与工作特性，结合硅藻特异性引物的设计和pcr反应程序的优化，研发一套基于rbcl基因荧光定量pcr的快捷简便检测硅藻细胞密度的分子检测方法，实现对环境样品中硅藻总量的快速灵敏检测，方法操作简便易行，具有很高的灵敏度和准确度。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种快速定量硅藻细胞密度的分子检测方法，其步骤包括待测水样的采集与过滤处理、总基因组dna的提取和纯化、采用硅藻专一特异性引物通过荧光定量pcr扩增rbcl基因、并进行了荧光定量pcr的反应体系的优化、标准曲线的制作以及待测样品的硅藻细胞密度计算。具体步骤如下：

a、采集待测水样，经滤膜(0.22μm或0.45μm)过滤，将过滤得到的藻类样本进行总基因组dna的提取和纯化；

b、将提取纯化的dna通过荧光定量pcr对rbcl基因进行扩增和定量，荧光定量pcr的正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列如seqidno.2所示，目标产物大小为280bp，反应完成后记录样品的ct值；

c、标准曲线的制作：取细胞密度已知的单种培养或纯培养硅藻作为标准藻株，提取其基因组总dna，梯度稀释后作为标准模板，依照上述荧光定量pcr方法与待测样品同时进行定量pcr扩增，反应结束后，根据标准藻株各个稀释浓度梯度的ct值绘制荧光定量pcr标准曲线，作为待测水样中硅藻细胞密度的计算依据；待测样品的ct值应落在绘制标准曲线的ct值范围内；

d、根据待测样品的ct值和标准曲线计算样品rbcl基因的拷贝数，样品中硅藻的细胞密度等同于所述的拷贝数。

优选地，步骤c中的标准藻株选自直链藻、小环藻、冠盘藻、脆杆藻或针杆藻中的任意一种。

优选地，荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性5min，接着40个循环，每个循环包括95℃15s、60℃30s和72℃30s，每个循环完成后进行一次荧光检测。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.摆脱了对专业技术人员和光学显微镜、扫描电镜的依赖性，常规的水质分析员借助荧光定量pcr就可以实现对硅藻这一单一类群的定量。

2.操作方法简单便捷，普通的水质检测人员在短时间内就可以掌握，且单位时间内可以检测更多的样品，效率大大提高。

3.成本低廉，每个样本所需要花费的费用较低。

4.数据准确客观，可比性强，有望成为国标检测方法。

5.在诸多的基因中确定rbcl基因作为硅藻定量检测的分子标记，针对该基因设计了专一特异性引物、优化了反应程序，通过高通量测序技术对设计引物进行了验证，检出率高达99.9％，同时经过反应体系优化后，退火和延伸时间仅30秒。

附图说明

图1为快速定量硅藻的检测方法对野外滤膜样品的检出结果。高通量测序结果如图所示，本发明所用引物对野外滤膜样品中硅藻的检出率达到99.9％(8a为野外滤膜样品)。

图2为实施例2中绘制的标准曲线图。纵坐标为ct值，横坐标为基因拷贝数，所用引物扩增效率高(e＝97.612％)，所得的标准曲线线性关系良好(r²＝0.999)。

图3为快速定量硅藻细胞密度的分子检测方法与人工显微计数法的结果比较。

具体实施方式

实施例1

引物设计及特异性验证：

针对硅藻rbcl基因设计出一对特异性引物rbc280-f/rbc280-r：

rbc280-f：5’-acgtttagaagatatgcgtattc-3’

rbc280-r：5’-ggttaataccttccatacag-3’。

利用引物rbc280-f/rbc280-r，对已有藻株进行验证，结果如表1。

表1部分藻株验证结果

注：“+”为阳性检出，“—”为阴性未检出。

表1对实验室培养的已有藻株包括蓝藻7种、绿藻14种和硅藻9种采用特异引物进行检测，从检测结果来看，本研究方法对硅藻的检出率为100％，对蓝藻和绿藻则没有检出，可见本引物的特异性。

图1对野外样品采用本方法进行检测，对硅藻的检出率达到99.9％，由此进一步显示本引物对硅藻检测的特异性。

实施例2

一种快速定量硅藻细胞密度的分子检测方法，其步骤是：

1、样品采集和dna提取：

2018年4月份采集南水北调中线干渠水样进行硅藻的定量，采样点为2个。本实施例中依据水体藻类生物量的具体情况采集1l待测水样，将水样经0.22μm醋酸纤维素膜过滤，将过滤得到的样本进行总基因组dna的提取和纯化。提取的dna溶于无菌双蒸水或去离子水中，置-20℃保存备用。

2、荧光定量pcr

采用特异性的硅藻rbcl基因引物通过荧光定量pcr进行扩增和定量，目标产物大小为280bp，反应完成后记录各个样品的ct值，每个样品重复3次。

反应体系20μl：sybrgreenmastermix10μl，特异性正反向引物各10μmol/μl(rbc280-f，rbc280-r)；反应程序：95℃预变性5min，接着40个循环，每个循环包括95℃15s、60℃30s和72℃30s，每个循环完成后进行一次荧光检测。

rbc280-f：5’-acgtttagaagatatgcgtattc-3’，rbc280-r：5’-ggttaataccttccatacag-3’。

3、标准曲线的制作：

取已知浓度的直链硅藻做为标准藻株，提取其基因组总dna，10倍梯度稀释作为标准模板(10¹-10⁸拷贝/μl)。依照上述步骤2的荧光定量pcr体系和程序与待测样品同时进行定量pcr扩增。反应结束后，根据标准藻株各个浓度梯度的ct值和浓度值绘制荧光定量pcr标准曲线，作为待测水样细胞密度的计算依据。

本次实验的标准曲线的计算公式为：

拷贝数＝10^x，x＝(37.53-ct)/3.38ct值为实验所得到的值

4、样品中rbcl基因浓度及细胞密度的计算：

将待测样品的ct值代入标准曲线公式中即可得出样品中硅藻rbcl基因的原始的拷贝数，由于rbcl基因为单拷贝基因，可认为基因的拷贝数等同于细胞数，由此得出待测样品中硅藻细胞密度。

样品中rbcl基因浓度的计算：

拷贝数＝10^x，x＝(37.53-ct)/3.38ct值为实验所得到的值

通过上述方法，在较短时间内获得南水北调中线干渠2018年4月2个样点的硅藻rbcl基因拷贝数如下：陶岔样点的拷贝数为101851.74copies/l，团城湖样点的拷贝数为196212.18copies/l。结果表明：在南水北调中线总干渠中，在所采集的2个样点都检测到了相应硅藻rbcl基因，拷贝数(细胞密度)达到了10⁵cells/l的数量级，表明在这些样点硅藻含量较高，需要加强监测采取相应措施。借助该方法，一般水质分析员可以快速检测出水体中硅藻的细胞密度，简便易行，且费用低廉，该方法具有标准化的特征，可望在不远的将来成为计量认证的检测指标。

5、本发明方法与人工计算方法比较：

对两样点的水样分别进行了定量pcr方法和人工方法比较，发现定量pcr方法与人工显微计数差异不显著(p>0.5)，说明两种方法均能反映出水体中硅藻的实际数量，但定量pcr方法具有高效和稳定特点，在样品量较大以及对计数熟练程度不同的条件下更具有优势。

通过上述技术具体措施，可快速高效检测出水样中的硅藻细胞密度，相比于借助显微镜形态检测而言，工作量极大减少，工作效率显著提高；同时，成本低廉，数据客观可比性强。

序列表

<110>中国科学院水生生物研究所

<120>一种快速定量硅藻细胞密度的分子检测方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acgtttagaagatatgcgtattc23

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggttaataccttccatacag20