脱水污泥制备产油酵母发酵培养基的方法及其应用与流程

本发明涉及一种脱水污泥制备产油酵母发酵培养基的方法及其应用，属于污泥资源化处理领域，同时也涉及微生物油脂合成领域。

背景技术：

挥发性脂肪酸是可以被酵母菌直接利用的碳源，与传统碳源葡萄糖相比，挥发性脂肪酸向油脂的转化途径更短、理论转化效率更高。已有研究以剩余污泥(含水率99％)厌氧发酵获得的挥发性脂肪酸溶液为碳源培养产油酵母，获得了微生物油脂可以用于生物柴油的制备。但剩余污泥含水率高、不易于运输与储存。而污水处理厂将剩余污泥经过深度脱水处理后得到的脱水污泥，一方面易于运输和储存，另一方面其较高的有机质含量有利于提高挥发性脂肪酸的产量，更适用于后续实际生产和应用，从而降低生物柴油的生产成本。

对于高浓度的脱水污泥，其有机物多以固相存在于污泥中，通常需要对其进行预处理使有机物释放至液相中，以利于厌氧发酵。采用的预处理方法需使用较高的温度或者强酸强碱性等物理化学方法，这些操作会产生一些对微生物存在毒性或抑制作用的物质。除此之外，脱水污泥厌氧发酵后的发酵液中碳氮比很低，不能满足产油酵母正常生长的需求。因此对于高浓度的脱水污泥，经过预处理及厌氧发酵后获得的产酸液不能直接作为培养基培养产油酵母。研发相应的方法对脱水污泥产酸液进行适当的调理从而去除抑制性物质，才能作为产油酵母合适的培养基合成微生物油脂。

技术实现要素：

针对中浓度污泥发酵产酸上清液中存在抑制性物质、氨氮含量高的特点，本发明提供了一种脱水污泥制备产油酵母发酵培养基的方法及其应用。

具体而言，使用混凝、酸析、鸟粪石沉淀联合调理结合序批式培养的方法，提高污泥发酵产生的挥发性脂肪酸向微生物油脂的资源化转化效率。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的一个目的是提供一种脱水污泥制备产油酵母发酵培养基的方法，包括以下步骤：

(1)以污水处理厂产生的脱水污泥为原料，稀释至中浓度后，采用热碱预处理方法获得清液；

(2)向步骤(1)中获得清液接种同一污水处理厂浓缩池污泥，常温条件下厌氧发酵获得清液；

(3)采用混凝、酸析、鸟粪石沉淀联合的调理方法去除步骤(2)所得溶液中的腐殖酸、蛋白质和氨氮，得到高c/n且富含挥发性脂肪酸的溶液；

(4)将步骤(3)所得溶液灭菌后作为产油酵母发酵培养基。所述产油酵母发酵培养基为富含挥发性脂肪酸的溶液。

在本发明的一个实施方式中，所述脱水污泥来源于采用生物法处理城市生活污水的污水处理厂。

在本发明的一个实施方式中，所述中浓度是指污泥浓度为40～70g/l。即根据测得的脱水污泥浓度，加入水将其稀释至污泥浓度为40～70g/l。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)采用热碱预处理方法进行预处理过程中，搅拌速度为70～80rpm，预处理温度85～95℃，预处理ph为10，预处理时间为6h，预处理结束后分离获取清液，离心力为20000×g，离心时间为20min。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)所述中接种采用的浓缩池污泥来源于采用生物法处理城市生活污水的污水处理厂，采用离心浓缩的方式获得接种物，离心力为5000×g，离心时间为10min。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)所述厌氧发酵产酸过程中，搅拌速度为200rpm，发酵温度25～30℃，发酵ph为8，发酵时间为8～10天，发酵结束后分离获取清液，离心力为18000×g，离心时间为20min。

所述的步骤(3)需要对产酸上清液进行抑制性物质去除，采用混凝+酸析+鸟粪石沉淀法联合的调理方法。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)所述采用混凝、酸析、鸟粪石沉淀联合的调理方法具体为：

以浓盐酸调节溶液ph为5，向溶液中以2g/l的浓度投加聚合氯化铝浓液，先后以200rpm搅拌30min，50rpm搅拌5min，8000×g离心15min分离获得清液；

以浓盐酸将溶液调节至ph为3，4℃静沉过夜，18000×g离心20min分离获得清液；

向溶液中投加磷酸氢二钠固体和氯化镁浓液，使溶液中n:p:mg比例为1:2～3:2～3(优选为1:2.6:2.6)，沉淀过程控制ph为9.0～9.5，离心分离获取上清液，离心力为8000×g，离心时间为5min。

本发明的另一个目的是提供一种基于上述方法获得的产油酵母培养基。

本发明的再一个目的是提供一种产油酵母培养基的应用，包括以下步骤：

(5)利用所述产油酵母培养基，采用序批式培养方式培养产油酵母；

(6)以步骤(5)培养结束后获得的酵母细胞为原料，提取得到微生物油脂。

在本发明的一个实施方式中，采用序批式培养方式培养产油酵母，实现微生物油脂的积累。其操作方式为：将酵母菌种子培养液以5％～10％(v/v)接入到步骤所述产油酵母培养基中进行培养，定期监测培养过程中酵母菌的生物量，当酵母菌不再生长时排出培养基保留酵母菌菌体，然后添加新鲜所述产油酵母培养基进入下一个周期的培养，共进行4个周期，所述产油酵母培养基初始ph为6.0，转速200rpm，培养温度为29.5～30.5℃。

在本发明的一个实施方式中，步骤(6)中，采用离心法收集酵母细胞，离心力4000×rpm，时间5min，生理盐水离心清洗一次。提取得到微生物油脂的方法为：采用物理研磨破碎+有机溶剂提取的方法，甲醇氯仿(1:1，v:v)有机溶剂提取两次，离心后抽取并合并两次提取的下层溶液，再以0.15％氯化钠溶液离心清洗一次，抽取下层溶液，45～55℃条件下采用氮吹法挥发有机溶剂获得微生物油脂。

本发明技术方案可以提高脱水污泥厌氧发酵产酸量，去除脱水污泥厌氧发酵清液中含有的抑制性物质，从而为产油酵母提供适宜的培养基合成微生物油脂，一方面实现了脱水污泥的资源化和能源化，另一方面也降低了微生物油脂的合成成本。

与现有技术相比，本发明具有以下的优点和有益效果：

1、以脱水污泥为原料制备培养基，方便物料运输与储存，同时可减少厌氧产酸反应装置占地面积。

2、以经稀释的脱水污泥产酸发酵上清液为培养基，不需要外加任何营养物质，微生物油脂生产成本低。

3、本发明以混凝+酸析法进行发酵产酸溶液中抑制性有机物去除，以鸟粪石沉淀法进行溶液中氨氮和总磷的回收，实现了污泥中有机物的转化利用以及氮磷的回收，提供了一条高效实现中浓度污泥资源化的新途径。

4、采用混凝+酸析+鸟粪石沉淀结合序批式培养的方式，使酵母菌油脂产量从1.11g/l提高至1.95g/l，油脂含量从15.5％提高至39.7％，促产效果显著。

5、鸟粪石结合序批式培养的模式适用于一般污泥浓度中等、有机物和氨氮含量高而c/n比低的溶液，为中浓度污泥的资源化提供了一条符合实际应用的新思路。

附图说明

图1为实施例中采用混凝+酸析+鸟粪石沉淀联合调理方法处理前后，污泥厌氧发酵产酸清液中有机物和氨氮浓度。

图2为采用序批式培养的实施例培养结果，展示了以去除抑制性有机物和氨氮后的污泥厌氧发酵产酸清液为培养基时，序批式培养中不同培养周期所获得的油脂酵母的生物量和油脂含量。

图3为采用序批式培养的对比实施例培养结果，展示了以仅去除氨氮的污泥厌氧发酵产酸清液为培养基时，序批式培养之下所获得的油脂酵母生物量和油脂含量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

本发明采用的产油酵母菌株为cryptococcuscurvatusmucl29819。适用于所有能以vfas为碳源合成微生物油脂的酵母菌株，如cryptococcuscurvatusatcc20509，rhodosporidiumtoruloidesas2.1389，yarrowialipolyticamucl2884等。

本发明适用于采用生物法的生活污水处理厂脱水污泥经稀释后厌氧发酵产酸液培养产油酵母。实施例中的脱水污泥采用上海市某污水处理厂的脱水污泥，该污水处理厂进水主要为生活污水，采用a/a/o(anaerobic-anoxic-oxic,厌氧-缺氧-好氧法)工艺，其中厌氧段停留时间1.5h、缺氧段1.5h、好氧段4.7h，污泥泥龄8～10d，污泥负荷0.2kg(bod5)/(kgmlss·d)。实施例中污泥的vs(挥发性固体，volatilesolids)/ts(总固体，totalsolids)为0.67～0.75。

实施例

(1)热碱预处理：将脱水污泥加水稀释至3％～5％vs，置于三角锥形瓶中，搅拌均匀后，以石灰乳调节ph至10，置于90±5℃水浴锅中，采用立式搅拌机以70～80rpm的转速搅拌6h，热碱预处理过程中保证瓶口密封。预处理后，取出预处理混合液，离心分离获得预处理清液，离心力为20000×g，离心时间为20min。

(2)厌氧发酵：将浓缩池污泥离心浓缩作为接种物，离心力为5000×g，离心时间为10min，以10％v/v的比例接种经浓缩的污泥至预处理清液，搅拌均匀后以6m盐酸调节ph至8，于厌氧发酵罐中在厌氧条件下进行厌氧发酵，发酵ph为8，发酵温度25～30℃，搅拌速度为200rpm，发酵时间为8～10天，发酵过程中保持发酵ph为8，发酵结束后分离获取发酵产酸清液，离心力为18000×g，离心时间为20min。

(3)上清液调理：

①混凝

收集污泥厌氧发酵获得的产酸清液，取适量清液，以6m盐酸调节溶液ph为5，根据溶液体积向溶液中以2g/l的浓度加入聚合氯化铝浓液，先后以200rpm搅拌30min，50rpm搅拌5min，搅拌结束后8000×g离心15min分离获得去除部分有机物的清液。

②酸析

收集混凝所得清液，取适量清液，在缓慢搅拌的条件下以6m盐酸调节溶液ph至3，4℃条件下静沉过夜待有机物析出，18000×g离心20min分离获得进一步去除部分有机物的清液。

③鸟粪石沉淀

收集酸析所得清液，取适量清液，根据n:p:mg(mol:mol:mol)＝1:2.6:2.6加入规定量十二水合磷酸氢二钠固体，200rpm搅拌下使固体完全溶解；然后以6m氢氧化钾调节ph至9.5，再加入定量氯化镁母液，开启化学沉淀过程；反应过程中以6m氢氧化钾调节使ph保持在9左右；反应过程中进行磁力搅拌或机械搅拌，首先200rpm搅拌5min，然后100rpm搅拌10min。反应结束后，进行离心分离，离心力8000×g，时间5min，获得去除氨氮的清液。

采用混凝+酸析+鸟粪石沉淀联合调理方法处理前后，污泥厌氧发酵产酸清液中有机物和氨氮浓度如图1所示。

(4)酵母菌的培养：

①种子培养

种子培养基：ypd种子培养基，包含20g/l葡萄糖，10g/l鱼粉蛋白胨，10g/l酵母提取物，初始ph为6.0。

种子培养方式：挑取1～2接种环酵母菌菌落，接种至50mlypd液体培养基内，于250ml锥形瓶中培养36h，培养温度为30℃，转速200rpm。

②产油酵母培养

培养基：去除抑制性有机物和氨氮的污泥产酸发酵上清液，初始ph调节至7.0。

培养方式：序批式培养。首先将5ml发酵36h的ypd种子培养液接种至45ml产酸液培养基中，培养过程中监测生长曲线，酵母菌生长进入稳定期后，以新鲜培养基替换原培养基，全部酵母菌细胞继续进行下一个周期的培养。共进行四个周期的培养。四个周期培养时间分别为48h、46h、41h、37h。培养温度为30±0.5℃，转速为200rpm。

(5)酵母菌的收集和油脂的提取：每个培养周期末，取出样品进行生物量和油脂含量的测定。离心收集酵母菌细胞(离心力5000×rpm，时间5min)，并采用机械研磨破碎结合有机溶剂提取的方法获得微生物油脂。加0.5mm直径的玻璃珠3500rpm高速研磨5～10s，提取试剂为氯仿甲醇溶液(v:v＝1:1)，提取两次，离心后抽取并合并两次提取的下层溶液，再以0.15％氯化钠溶液离心清洗一次，抽取下层溶液，50℃条件下采用氮吹法挥发有机溶剂获得微生物油脂。离心力5000×rpm，时间5min。

(6)培养结果：如图2，序批式培养第四周期，生物量达到4.90g/l，油脂产量达到1.95g/l，油脂含量达到39.7％。

图2为采用序批式培养的培养结果，展示了以去除抑制性有机物和氨氮后的污泥厌氧发酵产酸清液为培养基时，序批式培养中不同培养周期所获得的油脂酵母的生物量和油脂含量。

对比例

(1)热碱预处理：将脱水污泥加水稀释至3％～5％vs，置于三角锥形瓶中，搅拌均匀后，以石灰乳调节ph至10，置于90±5℃水浴锅中，采用立式搅拌机以70～80rpm的转速搅拌6h，热碱预处理过程中保证瓶口密封。预处理后，取出预处理混合液，离心分离获得预处理清液，离心力为20000×g，离心时间为20min。

(2)厌氧发酵：将浓缩池污泥离心浓缩作为接种物，离心力为5000×g，离心时间为10min，以10％v/v的比例接种经浓缩的污泥至预处理清液，搅拌均匀后以6m盐酸调节ph至8，于厌氧发酵罐中在厌氧条件下进行厌氧发酵，发酵ph为8，发酵温度25～30℃，搅拌速度为200rpm，发酵时间为8～10天，发酵过程中保持发酵ph为8，发酵结束后分离获取发酵产酸清液，离心力为18000×g，离心时间为20min。

(3)鸟粪石沉淀

收集厌氧发酵所得清液，取适量清液，根据n:p:mg(mol:mol:mol)＝1:2.6:2.6加入规定量十二水合磷酸氢二钠固体，200rpm搅拌下使固体完全溶解；然后以6m氢氧化钾调节ph至9.5，再加入定量氯化镁母液，开启化学沉淀过程；反应过程中以6m氢氧化钾调节使ph保持在9左右；反应过程中进行磁力搅拌或机械搅拌，首先200rpm搅拌5min，然后100rpm搅拌10min。反应结束后，进行离心分离，离心力8000×g，时间5min，获得去除氨氮的清液。

(4)酵母菌的培养：

①种子培养

种子培养基：ypd种子培养基，包含20g/l葡萄糖，10g/l鱼粉蛋白胨，10g/l酵母提取物，初始ph为6.0。

种子培养方式：挑取1～2接种环酵母菌菌落，接种至50mlypd液体培养基内，于250ml锥形瓶中培养36h，培养温度为30℃，转速200rpm。

②产油酵母培养

培养基：去除氨氮的污泥产酸发酵上清液，初始ph调节至7.0。

培养方式：序批式培养。首先将5ml发酵36h的ypd种子培养液接种至45ml产酸液培养基中，培养过程中监测生长曲线，酵母菌生长进入稳定期后，以新鲜培养基替换原培养基，全部酵母菌细胞继续进行下一个周期的培养。共进行四个周期的培养。四个周期培养时间分别为38h、34h、34h、32h。培养温度为30±0.5℃，转速为200rpm。

(5)酵母菌的收集和油脂的提取：每个培养周期末，取出样品进行生物量和油脂含量的测定。离心收集酵母菌细胞(离心力5000×rpm，时间5min)，并采用机械研磨破碎结合有机溶剂提取的方法获得微生物油脂。加0.5mm直径的玻璃珠3500rpm高速研磨5～10s，提取试剂为氯仿甲醇溶液(v:v＝1:1)，提取两次，离心后抽取并合并两次提取的下层溶液，再以0.15％氯化钠溶液离心清洗一次，抽取下层溶液，50℃条件下采用氮吹法挥发有机溶剂获得微生物油脂。离心力5000×rpm，时间5min。

(5)培养结果：如图3所示。序批式培养第四周期，生物量达到7.18g/l，油脂产量达到1.11g/l，油脂含量达到15.5％。

图3为采用序批式培养的对比实施例培养结果，展示了以仅去除氨氮的污泥厌氧发酵产酸清液为培养基时，序批式培养之下所获得的油脂酵母生物量和油脂含量。

通过与对比例的对比分析可知，采用“混凝+酸析+鸟粪石沉淀去除抑制性有机物和氨氮结合序批式培养”的方式，能够获得良好的培养效果。经联合调理结合序批式培养之下油脂产量和油脂含量分别为仅经鸟粪石调理结合序批式培养之下的1.8倍和2.6倍。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。