一种用于检测乳腺癌相关基因表达水平的试剂盒的制作方法

本发明涉乳腺癌基因检测领域，更特别地，涉及一种用于检测乳腺癌相关基因表达水平的试剂盒。
背景技术：
：乳腺癌是目前女性发病率第一的癌症，2012年全球约170万例患者，其中521900例患者死于乳腺癌，位列我国女性癌症发病率第一位。对于雌激素受体(estrogenreceptor，er)阳性的早期乳腺癌患者，是单用内分泌治疗，还是加用化疗，使患者技能避免过度治疗，又能避免转移复发，是一个亟待解决的问题。但是，与乳腺癌有关的基因众多，每个都检测耗费巨大，并且会是医生淹没于海量的数据中，而忽略了有效数据。因此，要从其中挑选出可用作诊断、用药和预后指标的基因进行检测。微流控技术是以微加工技术实现微体积反应，并可实现高通量反应使得手工操作和检测成本大幅降低，显著提高效率。现阶段乳腺癌相关基因表达水平检测的主要方法包括二代测序、微阵列芯片、荧光pcr等。这些方法或耗时长，操作复杂，或对操作者和实验场地有较高要求，或检测费用较高，或难以同时检测多个基因的不同突变位点。因此，有必要建立一种高通量、高效率、低成本的基因表达水平检测方法和产品，以实现快速检测及乳腺癌患者的普遍检测。技术实现要素：我们在研究过程中发现，通过检查乳腺癌组织中有16个基因的表达水平可用于针对个体病例提供更为精确的治疗决策与预后信息，使临床医生能够预测从内分泌或化疗中获益的患者。这些基因包括atcb、bag1、bcl2、ccnb1、cd68、scube2、scube2、ctsl2、esr1、grb7、gstm1、erbb2、mki67、mybl2、pgr、aurka、mmp11、birc5。另外我们还挑选了5个参考基因：actb、gapd、rplpo、gusb、tfrc用来衡量上述基因的表达量。通过检测淋巴结阴性、雌激素受体阳性乳腺癌患者的21基因，分析其表达来确定复发风险rs分值(0～100分)，＜18分为复发低危；18-30为复发中危；≥31为复发高危。乳腺癌nccn指南建议对复发高危的患者采用辅助性化疗。基于以上研究，本发明提供了一种用于检测乳腺癌相关基因表达水平的试剂盒，括用于检测于乳腺癌相关基因的表达水平的检测试剂。在一个优选实施方案中，所述检测于乳腺癌相关基因的检测试剂包括用于扩增覆盖所述基因的引物对，以及检测所述基因的探针。在一个优选实施方案中，所述乳腺癌相关基因包括bag1、bcl2、ccnb1、cd68、scube2、ctsl2、esr1、grb7、gstm1、erbb2、mki67、mybl2、pgr、aurka、mmp11、birc5中的一种或多种。在一个优选实施方案中，所述乳腺癌的基因的表达水平检测，用于检测bag1的引物对如seqidno4和5所示，探针如seqidno6所示；用于检测bcl2的引物对如seqidno7和8所示，探针如seqidno9所示；用于检测ccnb1的引物对如seqidno10和11所示，探针如seqidno12所示；用于检测cd68的引物对如seqidno13和14所示，探针如seqidno15所示；用于检测scube2的引物对如seqidno16和17所示，探针如seqidno18所示；用于检测ctsl2的引物对如seqidno19和20所示，探针如seqidno21所示；用于检测esr1的引物对如seqidno22和23所示，探针如seqidno24所示；用于检测grb7的引物对如seqidno28和29所示，探针如seqidno30所示；用于检测gstm1的引物对如seqidno31和22所示，探针如seqidno33所示；用于检测erbb2的引物对如seqidno37和38所示，探针如seqidno39所示；用于检测mki67的引物对如seqidno40和41所示，探针如seqidno42所示；用于检测mybl2的引物对如seqidno43和44所示，探针如seqidno45所示；用于检测pgr的引物对如seqidno46和47所示，探针如seqidno48所示；用于检测aurka的引物对如seqidno52和53所示，探针如seqidno54所示；用于检测mmp11的引物对如seqidno55和56所示，探针如seqidno57所示；或者，用于检测birc5的引物对如seqidno58和59所示，探针如seqidno60所示。在一个优选实施方案中，还包括用于检测参考基因的检测试剂。在一个优选实施方案中，所述参考基因为actb、gapd、rplpo、gusb、tfrc中的一种或多种。在一个优选实施方案中，用于检测atcb的引物对如seqidno1和2所示，探针如seqidno3所示；用于检测gapd的引物对如seqidno25和26所示，探针如seqidno27所示；用于检测gusb的引物对如seqidno34和35所示，探针如seqidno36所示；用于检测rplpo的引物对如seqidno49和50所示，探针如seqidno51所示；或者，用于检测tfrc的引物对如seqidno61和62所示，探针如seqidno63所示。使用本发明的试剂盒可在同一个反应条件下同时对24个与耳聋相关基因的突变进行高通量检测。检测的特异性强，灵敏度高，最低检测限为1ng/μl，用时短，从标本送检到得出结果可在2小时以内完成。适用于对遗传性耳聋患者的检测以及对胎儿的筛查。附图说明图1为使用实施例中的试剂盒检测得到的atcb基因分析结果的扩增曲线图。具体实施方式以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。1.突变位点的检测1.1检测技术和仪器为了能够快速高通量地检测这些突变，我们采用微流控技术，包括微流控芯片和微流控平台两个部分。微流控芯片是将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过气压、温度控制系统及荧光分析系统自动完成反应体系混合，实现多达9216个pcr反应。大大降低了手工加样的步骤和时间，完成整个过程约2小时。微流控芯片上都精密设置了许多微通道(样本、试剂、控制液通道)和微反应仓，预先在进样口分别加入试剂、样本和控制液，通过气压控制可实现芯片上的不同阀门开关，精准控制溶液在芯片通道内流动，在反应仓中混合，最多可以实现9216个nl级的pcr反应仓，进行实时荧光定量pcr反应。我们采用的微流控平台由ascendmf600型微流控核酸扩增仪(对应fluidigm的juno)和ascendmf800型微流控核酸检测仪(对应fluidigm的biomark)组成。ascendmf600型微流控核酸扩增仪(juno)pcr与普通扩增仪的区别主要在于微流控技术，原理如下：微流控核酸扩增仪所使用芯片将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过微流控核酸扩增仪气压控制系统和温度控制系统自动完成反应体系混合和pcr反应。微流控核酸扩增仪嵌入式pc控制系统可校准和监测仪器的性能，识别和记录芯片条码。利用触摸lcd显示屏，自定义和选择需要的试验程序。仪器采用的芯片将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过气压控制系统控制样本及试剂在微流控芯片每一个微小的反应室内的精准流动和混合，温控模块实现pcr过程中快速、精确、均匀的升温/降温，在芯片上实现微流控pcr反应。完全取代人工操作，实现反应体系混合和pcr反应的全自动化。微流控核酸扩增仪包括气压控制系统及温控控制模块，气压控制系统通过真空泵的气压控制液体在微流控芯片中的精准流动，可作为芯片样本及试剂预处理控制器，嵌入式pc可校准和监测仪器的性能；温控模块控制pcr过程中快速、精确、均匀的升温/降温。用户可利用触摸lcd显示屏，自定义和选择需要的试验程序。微流控核酸检测仪原理类似于实时荧光定量pcr仪。原理如下：微流控核酸检测仪所使用芯片将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，可自动完成pcr反应及结果分析。在pcr反应刚开始时，试剂量充足，模板和产物的浓度都足够低，产物不与引物竞争，扩增以恒定的指数速率增长。后期反应速率不再呈指数增长，扩增呈可变线性增长，进入线性增长期。在平台期，扩增速率趋近于零。1.2检测引物和探针设计微流控芯片与平台的结合可实现高通量快速的检测。但是，在一张芯片上，所有反应体系的反应条件是一致的，需要在引物和探针方面进行综合考虑，实现所有21种检测反应能在同一个反应条件下得到有效并且精确的检测结果。这给一次性检测不同的位点带来了很大难度。我们花了大量时间进行研究和实验验证，设计了以下引物和探针以实现一次性对上述21个基因进行有效而精确的检测。引物和探针的如表1所示。表1检测引物和探针2.3反应体系组成和反应条件。所述模板可以为全血、干血斑。反应条件如表2所示。表2反应条件3具体检测示例21对引物及21个探针由英潍捷基合成；192.24芯片购自fluidigm公司；rox参比染料购自life公司；特异性pcr反应液购自appliedbiosystems公司；逆转录试剂购自thermo公司仪器：微流控核酸扩增仪(juno)、微流控核酸检测仪(biomark)、2720型pcr扩增仪，涡旋振荡器，离心机。采用本试剂盒以临床已确认型别的共计18例石蜡组织为模板，建立微流控荧光pcr检测乳腺癌21基因的反应体系，最终以循环结束后扩增曲线图作为结果判断的标准。配制引物探针mixx，其中x表示数字1-21，分别代表第一至第二十一个基因。按照表3分别配制21个基因的引物探针mix。将引物探针mixx按照表4所示配制10×试剂，分别标记为assay1-21。按表5配制样本预混液，然后将样本预混液与模板配制成最终反应体系(表6)。表3引物探针mix的配制表410×试剂的配制表5样本预混液的配制表6最终反应体系的配制组分反应体积(μl)dna1.6样本预混液2.4总体积4.0将反应体系上载至微流控芯片上，于微流控平台中进行进行荧光pcr检测反应，反应条件如表2所示。图1为mki67基因分析结果的扩增曲线图，统计后如表7。结果显示，本发明的试剂盒检测结果与实际相符。表7mki67基因检测结果统计样本编号检测结果(ct值)样本编号检测结果(ct值)123.21035.5229.71125.9333.21220.0433.31324.4521.01420.4627.91519.5733.01628.3835.71731.2934.81819.1以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>广东腾飞基因科技股份有限公司<120>一种用于检测乳腺癌基因表达水平的试剂盒<160>63<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cagcagatgtggatcagcaag21<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gcatttgcggtggacgat18<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aggagtatgacgagtccggcccc23<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgttgtcagcacttggaatacaa23<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gttcaacctcttcctgtggactgt24<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cccaattaacatgacccggcaaccat26<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cagatggacctagtacccactgaga25<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列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